一种影响肉牛肌内脂肪含量的ARID5B基因突变位点及其应用的制作方法

本发明涉及延黄牛品种培育技术领域，尤其涉及一种影响肉牛肌内脂肪含量的arid5b基因突变位点及其应用。

背景技术：

延黄牛因其适应性强、生长速度快、产肉率高和具有独特的肉质风味等优点越来越受到人们的关注，是吉林省延吉市饲养的主导肉牛品种之一。延黄牛品种来源是由延黄牛和利木赞经过27年杂交合成、横交固定和群体继代选育而成的新型培育品种。

富含at相互作用功能域5b(at-richinteractivedomain5b，arid5b)基因位于牛28号染色体上，含有13个外显子，共编码939个氨基酸，是arid基因家族重要的一员。arid包含15种人类特殊蛋白质，根据个体成员之间序列同源性差异可将其分为7个亚型，分别是arid1、arid2、arid3、arid4、arid5、jarid1和jarid2。arid5b和arid5a也是arid家族成员，而arid5b也被称为调制器识别因子2(modulaterrecognitionfactor2,mrf2)能与巨细胞病毒的增强子结合并抑制其活性。有研究报道arid5b基因编码的转录因子在细胞生长调控过程、细胞型基因表达和胚胎发育过程中发挥着重要的作用。早期研究发现，人arid5b基因的5个snp位点与儿童急性淋巴细胞白血病相关，还发现该基因与人类动脉粥样硬化有关。拷贝数变异(cnv)与多种人类疾病(包括肥胖)的病因有关，selvanayagam等学者对罕见cnv肥胖儿科病例个体中发现arid5b是一种潜在的新型肥胖候选基因。敲除调节剂识别因子-2(mrf-2)的小鼠体型消瘦，白色脂肪组织显著减少，mrf2可能是脂肪细胞分化的潜在调节因子和瘦蛋白的潜在抑制因子。arid5b在脂肪细胞产热调节途径发挥着重要作用，具有显著的肥胖和抗肥胖作用。脂肪是由脂肪细胞组成，是动物体内能量储存和内分泌功能的主要器官，不仅在调节新陈代谢中发挥重要作用，而且还调节动物肥胖。脂肪形成是一个涉及细胞增殖、分化、激素调节和基因表达调控等复杂过程。牛肉品质受许多主效基因的影响，例如脂肪酸结合蛋白(fabp)基因影响牛肉的肌内脂肪含量和钙蛋白酶(calpain)基因影响牛肉的嫩度。目前已证实arid5b基因参与脂肪酸代谢，但是对于该基因在牛肉质方面的研究尚未见报道。

肌内脂肪是影响牛肉品质的一个关键因素，而脂肪形成过程受许多基因调控。l.a.aqrawi等研究发现arid5b是影响脂肪组织发育和减少线粒体脂肪酸β-氧化的关键基因。j.murray等研究报道arid5b在脂肪生成和软骨形成中具有重要功能，并且该基因的抑制导致原代骨骼肌细胞分化也受到抑制，说明该基因在骨骼肌肌肉生成中也发挥着重要的作用。l.l.sun等还研究发现arid5b基因的四个单核苷酸多态性(snp)位点与2型糖尿病(t2dm)和人类脂质代谢相关。本研究发现延黄牛arid5b基因第10外显子261bp处存在a/g突变，且存在三种基因型，aa是优势等位基因型，a为优势等位基因。三种基因型与延黄牛肉用性状中的肌内脂肪存在显著相关性(p<0.05)。arid5b基因在小鼠骨骼肌原代细胞中敲除导致骨骼肌细胞分化也受抑制，说明arid5b基因在骨骼肌生长过程中发挥调控作用，而骨骼肌的发育与动物体尺性状息息相关。j.dong等才研究报道敲除arid5b基因的小鼠体型消瘦，白色脂肪组织显著减少，arid5b基因可能是脂肪细胞分化的潜在调节因子和瘦蛋白的潜在抑制因子。m.claussnitzer等发现arid5b基因在脂肪细胞产热途径也发挥重要的调控作用，具有显著的肥胖和抗肥胖的作用，而本发明发现arid5b基因的多态性与延黄牛肉质性状中的肌内脂肪含量具有相关性，这说明gg基因型有可能是调控延黄牛脂肪酸代谢的关键基因型。肌内脂肪均匀地分布于肌肉组织中，磷脂约占整个脂肪组织的20％-50％，磷脂是影响肉品质风味的主要物质，这也说明arid5b基因的多态性可能影响延黄牛肉质风味。

本发明以延黄牛dna为模板，通过hrm分型技术检测arid5b基因的多态性，再通过单因素方差分析该基因的多态性与延黄牛肉用性状的相关性。本发明结果可为延黄牛肉质改良和有效遗传标记基因的筛选提供参考依据。

技术实现要素：

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种影响肉牛肌内脂肪含量的arid5b基因突变位点及其应用。

本发明的技术方案如下：

一种影响肉牛肌内脂肪含量的arid5b基因突变位点，位于arid5b基因第10外显子261bp处。

优选的，具有影响肉牛肌内脂肪含量的arid5b基因突变位点的核苷酸序列分别为seqidno.1和seqidno.2所示；本发明发现了延黄牛arid5b基因第10外显子261bp处存在a/g突变，含有三种基因型，分别为aa基因型、ag基因型和gg基因型。

优选的，影响肉牛肌内脂肪含量的arid5b基因突变位点完全连锁的分子标记，该分子标记为arid5b-hrm-10，其引物序列为：

arid5b-hrm-f10：5’-aaaagagaatgccccaaag-3’；

arid5b-hrm-r10：5’-ctgtagaggagcacaact-3’。

优选的，所述的影响肉牛肌内脂肪含量的arid5b基因突变位点在延黄牛分子标记辅助育种中的应用。

优选的，所述的影响肉牛肌内脂肪含量的arid5b基因分子标记在延黄牛分子标记辅助育种中的应用。

优选的，所述的影响肉牛肌内脂肪含量的arid5b基因分子标记的引物在延黄牛分子标记辅助育种中的应用。

本发明的有益之处在于：本发明发现了延黄牛arid5b基因第10外显子261bp处存在a/g突变，含有三种基因型，分别为aa基因型、ag基因型和gg基因型。arid5b基因第10外显子基因型gg与肉质性状中的肌内脂肪存在显著正相关(p<0.05)。本发明结果可为延黄牛肉质改良和有效遗传标记基因的筛选提供参考依据。

附图说明

图1：arid5b基因第10外显子pcr产物电泳图；其中，m,dl2000dnamarker；1、3、11、18、25、35、40和65表示不同dna样品pcr产物；

图2：延黄牛arid5b第10外显子核苷酸序列比对图；注：1、3、11、18、25、35、40、65、77、86、96、98-f表示随机挑选的测序样品；

图3：延黄牛arid5b基因第10外显子氨基酸序列比对图；注：1、3、11、18、25、35、40、65、77、86、96、98-f表示随机挑选的测序样品；

图4：aa、ag和gg基因型的测序波峰图；

图5：延黄牛arid5b基因外显子10的分型结果图。

具体实施方式

实施例：

1材料与方法

1.1试验动物

选取18月龄的99头延黄牛母牛，参照肉牛遗传改良计划的标准测量肌内脂肪含量(通过甘道夫兽用b超仪测量获得)。采集其耳组织约1.5g放入含有75％乙醇的2mlep管中，做好标记和日期带回实验室，-20℃保存。

1.2主要试剂及仪器

480hrmmastermix试剂盒购自美国罗氏公司；2×estaqmastermix购自cwbio公司；axyprep基因组dna提取试剂盒购自axygeno公司；pcr仪t100购自上海伯乐生命医学产品有限公司；超微量分光光度计quawell-q5000购自北京鼎盛生物技术有限责任公司。

1.3基因组dna的提取

根据axyprep基因组dna提取试剂盒说明书提取99头延黄牛牛耳组织基因组dna，采用quawell-q5000超微量分光光度计检测dna的浓度及纯度，并取3μl进行2.0％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，将电泳检测结果完好的dna样品-20℃保存备用。

1.4dna引物设计及合成

根据genbank中发表的牛arid5b基因dna序列(xm_002698842.3)，用primer5.0设计引物，引物序列均由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列信息见表1。

表1引物序列信息；

1.5pcr反应体系及条件

pcr反应体系(20μl)：2xtaqmastermix10μl，dna1μl，上下游引物各取0.5μl，ddh2o8μl。pcr反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s；53℃退火30s，72℃延伸30s，共34个循环；72℃终延伸5min，产物4℃保存。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6snp位点检测

pcr产物直接测序，利用dnaman软件对测序结果逐一进行分析寻找外显子中snp位点，用chromas软件对测序结果波峰图进行分析。

1.7hrm基因分型

利用hrm基因分型技术对测序检测结果arid5b基因第10外显子261bpa/g突变位点进行引物设计，用beacondesigner7.0软件设计hrm引物并扩增出了突变位点前后的部分序列。

arid5b-hrm-f10：5’-aaaagagaatgccccaaag-3’；

arid5b-hrm-r10：5’-ctgtagaggagcacaact-3’，

预扩增片段长度为82bp，tm为54℃，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。hrm反应体系为20μl：hrmmastermix10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板1μl，mgcl22μl，加ddh2o至20μl。hrm反应程序为：预孵育95℃10min；扩增95℃10s,tm54℃20s,72℃20s探测模式为single,循环50次；溶解曲线95℃1min,40℃1min,65℃1s,95℃探测模式为continous；冷却40℃10s。hrm反应程序结束后通过480genescanning程序进行数据分析。

1.8数据统计分析

利用spss19.0软件进行单因素方差分析不同基因型与延黄牛肉用性状相关性及显著性差异，以期确定单个基因型与肉质性状的相关性。结果以平均值±标准差表示，以p<0.05为差异显著性判断标准。

2试验结果

2.1pcr扩增结果

pcr产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果发现，arid5b基因第10外显子片段长度约为418bp，与预期扩增片段大小一致，如图1所示。

2.2序列分析

通过dnaman软件对所有arid5b基因第10外显子测序结果进行核苷酸序比对，在第10外显子编码区发现a/g的突变(如图2所示)，该位点的突变没有引起编码氨基酸的改变(如图3所示)。利用chromas软件对测序结果波峰图依次对比，将与genbank(登录号：xm_002698842.3)具有相同序列定义为aa基因型、ag基因型和gg基因型，测序峰图见图4。

由图4可知：在箭头位置处，aa基因型出现碱基为a的波峰，而gg基因型出现碱基为g的波峰，均表现为纯合子，虽然ag基因型序列中碱基为a，但同时存在a、g两种波峰，则说明ag基因型个体为突变杂合子。

通过hrm技术进行分型，测序结果各基因型对应的曲线如图5所示。

2.arid5b基因外显子10不同基因型与肌内脂肪含量的相关性分析

利用spssstatistisone-wayanova的分析方法，探究arid5b基因外显子10不同基因型与肌内脂肪性状的相关性。结果表明，延黄牛arid5b基因外显子10的gg基因型与肌内脂肪性状存在显著性差异(p<0.05)，为正相关。

arid5b基因外显子10的gg基因型为高肌内脂肪含量的判断标准，若想培育高肌内脂肪含量的肉牛，可以考虑选择带有gg基因型的个体。

表2延黄牛arid5b基因10外显子不同基因型与肉用性状的相关性分析结果；

同行数据肩标不同字母表示差异显著(p<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(p>0.05)。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>吉林省农业科学院

<120>一种影响肉牛肌内脂肪含量的arid5b基因突变位点及其应用

<130>2010

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>199

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gttaatcctgccgtatgaaaggtttattaaaggagaggaagataagcccctgcctccaat60

caaacctcgaaaacaggagaacaattcacaggaaaacgagaataagacaaaagtatcagg120

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<210>2

<211>199

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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