一种同时制备生物表面活性剂和乳化剂的发酵培养方法与流程

本发明属于生物活性物分子制备技术领域，特别涉及一种bacillussubtilis发酵培养方法。

背景技术：

生物表面活性剂(biosurfactant)作为表面活性剂的一种，是一类由生物代谢产生的，具有两亲结构的表/界面活性物质。同时，它具有抗病毒、抗凝血、抗癌细胞、抗细菌等生物活性。此外，生物表面活性剂在环境中易降解，是石油基表面活性剂最具潜力的良好的替代者。在石油领域、食品工业、环境工程、洗涤日用品、生物医药等各个领域都展示出巨大的应用价值。

在微生物采油方面，油藏经传统方法开采后仍有20％-30％的石油残余地层中，无法被开采。微生物采油技术是一种经济有效的提高原油采收率的技术。自1926年提出微生物采油的基本原理以及1947年注册第一个微生物采油专利以来，特别是1954年美国首次开展外源微生物采油，以及随后俄罗斯首次开展内源微生物采油获得试验成功后，这一技术引起了国际同行的普遍关注。将生物表面活性剂生产菌发酵液直接注入油藏的驱油技术已在多个国家的不同油藏中提高了原油采收率。其中，由于bacillussubtilis(枯草芽孢杆菌)有极强的生存能力，能在有氧及厌氧环境中生长并生产高性能的生物表面活性剂-脂肽，对其发酵研究日益关注。但是，现有技术中，bacillussubtilis发酵液对石油产量提升程度有限，其驱油效能仍有较大提升空间。

在油污土壤修复方面，在石油工业中石油的泄漏事故时有发生，进入大自然的石油分别进入土壤、地下水及空气，造成了大量的污染。我国已将石油污泥列入《国家危险废物目录》中，《国家清洁生产促进法》和《固体废物环境污染防治法》也要求必须对其进行无害化处理。由于石油类物质进入土壤会粘着于土壤颗粒的表面，很难进行分离，而且微生物对有机污染物的降解主要通过其吸收溶解态有机物的途径实现，故很难被微生物利用。表面活性剂能够降低有机物在土壤，沉积物上的吸附和提高有机物从土壤，沉积物上的脱附，同时也能提高有机物的生物可利用性。因此，表面活性剂可以用于洗脱土壤中的石油烃污染物，也可用于强化石油烃污染土壤的生物修复。

现有技术获得的bacillussubtilis发酵液乳化能力较低，与油井及油污泥中的石油烃形成的分散体系不够稳定，极大影响了其应用效果。本发明针对现有技术存在的上述问题，对bacillussubtilis产脂肪酶性能进行了研究，利用其产脂肪酶特性，同时结合植物油经脂肪酶水解产生的甘油酯及脂肪酸对油或烃类物质具有极强的乳化性且乳化液稳定性高的特殊性质，将bacillussubtilis培养生产脂肽与产酶水解植物油结合起来，获得了具有高乳化性能发酵液。具体是：于bacillussubtilis发酵培养基中补充添加植物油作为第二碳源和能源进行发酵培养，使bacillussubtilis同时利用水溶性和非水溶性碳源进行生长代谢，植物油不仅能提供菌体生长代谢所需能量及物质基础，而且被bacillussubtilis代谢产生甘油酯及脂肪酸，由此增强了发酵液对油烃类物质的乳化性。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种同时制备获得具有良好性能的生物表面活性剂和乳化剂的发酵培养方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种同时制备生物表面活性剂和乳化剂的发酵培养方法，其特征在于，在同时含水溶性和非水溶性碳源的培养基中培养bacillussubtilis菌种，获得发酵液。枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)菌种包括但不限于当前已公开的菌种，如文献appliedbiochemistryandbiotechnology,2012,166(8):2091-2100中公开的bacillussubtilistd7菌种(发明人所在实验室保藏)；文献analyticalsciences,2012,28(8):789-793中公开的bacillussubtilishso121菌种(发明人所在实验室保藏)；中国普通微生物保藏管理中心的枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)cgmcc1.8715(发明人所在实验室购买并保藏)；中国农业微生物菌种保藏中心枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)accc10626；中国工业微生物菌种保藏中心枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)cicc10210和cicc10366等。

所述的培养基中水溶性碳源浓度10～40g/l，非水溶性碳源浓度1～20g/l。

所述的水溶性碳源包括葡萄糖或蔗糖。

所述的水溶性碳源为蔗糖，在培养基中的浓度为20g/l。

所述的非水溶性碳源包括菜花油、橄榄油、核桃油、花生油、葵花油、米糠油、香油、杏仁油、葡萄籽油、玉米油、大豆油、蓖麻油、棉麻油或环氧大豆油。

所述的非水溶性碳源为大豆油，在培养基中的浓度为10g/l。

所述的培养基中还包含以下成分1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2。

所述的培养基中培养温度37℃，培养基初始ph为6.7-6.9，培养时间3天。

所述的方法具体包括以下步骤：

1)种子液培养：取菌种bacillussubtilis至lb平板上，将平板置于37℃恒温培养箱中活化培养12h；用接种环从斜面上挑取单菌落至种子液培养基中，于37℃，150rpm/min下摇床培养14h取出作为种子液备用，

2)摇瓶培养：将步骤(1)培养完成的种子液按体积分数1.0％的接种量接入发酵培养基中，于37℃，150rpm摇床培养3天。

步骤(1)中种子液培养基组分为20.0g/l水溶性碳源，1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2；培养基ph为6.7；

步骤(2)中发酵培养基组分：10～40.0g/l水溶性碳源，1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2；培养基ph为6.7，以及1.0～20％非水溶性碳源，ph为6.9。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.解决了现有发酵培养技术获得的发酵液不能兼具良好的表界面活性及乳化性能，影响了应用效果的问题，开发建立了同时制备获得具有良好性能的生物表面活性剂和乳化剂的发酵培养方法。

2.本发明对bacillussubtilis产脂肪酶性能进行了研究，利用其产脂肪酶特性，同时结合植物油经脂肪酶水解产生的甘油酯及脂肪酸对油或烃类物质具有极强的乳化性且乳化液稳定性高的特殊性质，将bacillussubtilis培养生产脂肽与产酶水解植物油结合起来，获得了具有高乳化性能发酵液。具体是：于bacillussubtilis发酵培养基中补充添加植物油作为第二碳源和能源进行发酵培养，使bacillussubtilis同时利用水溶性和非水溶性碳源进行生长代谢，植物油不仅能提供菌体生长代谢所需能量及物质基础，而且被bacillussubtilis代谢产生甘油酯及脂肪酸，由此增强了发酵液对油烃类物质的乳化性。

3.本发明显著提高了发酵液的乳化性能，将发酵液对原油的乳化指数e24由52％提高至92％。

附图说明

图1：不同种类的油烃对bacillussubtilis发酵液乳化能力及脂肽产量的影响；

图2：蔗糖培养基中添加不同量大豆油对bacillussubtilis发酵液乳化性能影响(e24)；

图3：以不同大豆油含量的培养基发酵培养bacillussubtilis获得的发酵液乳化性能对比(图中左一为1.0％大豆油添加量，左二为0.5％大豆油添加量，左三为不添加大豆油发酵液)；

图4：葡萄糖培养基中添加不同量大豆油对bacillussubtilis发酵液乳化性能的影响(e24)。

具体实施方式

申请人在使用bacillussubtilis发酵液作为乳化剂使用时发现，该发酵液对石油的乳化性偏低。因此，对发酵培养基配方进行改进，显著提高了发酵液的乳化能力。下面结合实施例对本发明中的bacillussubtilis产生的高乳化能力发酵液进行详细的描述。

实施例1

1)种子液培养：取一定量菌种bacillussubtilistd7至lb平板上，将平板置于37℃恒温培养箱中活化培养12h；用接种环从斜面上挑取单菌落至种子液培养基中，于37℃，150rpm/min下摇床培养14h取出作为种子液备用。上述种子液培养基组分为20.0g/l蔗糖，1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2；培养基ph为6.7。

2)摇瓶培养：将步骤(1)培养完成的种子液按体积分数1.0％的接种量接入发酵培养基中，于37℃，150rpm摇床培养3天。发酵培养基组分：20.0g/l蔗糖，1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2；培养基ph为6.7，以及1.0％非水溶性碳源，ph为6.9。其中，非水溶性碳源分别为菜花油、橄榄油、核桃油、花生油、葵花油、米糠油、香油、杏仁油、葡萄籽油、玉米油、大豆油、蓖麻油、棉麻油、环氧大豆油等。发酵液对原油的乳化性能有不同程度的提高，提高幅度为将发酵液对原油的e24从52％提高至54～92％，见图1。

实施例2

1)种子液培养：取一定量菌种bacillussubtilistd7至lb平板上，将平板置于37℃恒温培养箱中活化培养12h；用接种环从斜面上挑取单菌落至种子液培养基中，于37℃，150rpm/min下摇床培养14h取出作为种子液备用。上述种子液培养基组分为20.0g/l蔗糖，1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2；培养基ph为6.7。

2)摇瓶培养：将步骤(1)培养完成的种子液按体积分数1.0％的接种量接入发酵培养基中，于37℃，150rpm摇床培养3天。取发酵液测量取乳化能力及脂肽含量。上述培养基组分为40.0g/l蔗糖，1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2，以及浓度分别为0.1％、0.5％、1％、1.5％和2％的大豆油，培养基ph为6.7。结果如附图2所示，在添加大豆油1.0％时发酵液乳化性最佳，故确定大豆油的添加量为1.0％。本发明得到的发酵液较原产品乳化性得到显著提升，将发酵液对原油的乳化指数e24从52％提高至92％，见图3。

实施例3

1)种子液培养：取一定量菌种bacillussubtilistd7至lb平板上，将平板置于37℃恒温培养箱中活化培养12h；用接种环从斜面上挑取单菌落至种子液培养基中，于37℃，150rpm/min下摇床培养14h取出作为种子液备用。上述种子液培养基组分为20.0g/l葡萄糖，1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2；培养基ph为6.8。

2)摇瓶培养：将步骤(1)培养完成的种子液按体积分数1.0％的接种量接入发酵培养基中，于37℃，150rpm摇床培养3天。取发酵液测量取乳化能力及脂肽含量。上述培养基组分为20.0g/l葡萄糖，1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2，以及浓度分别为0.1％、0.5％、1％、1.5％和2％的大豆油，培养基ph为6.8。结果如附图4所示。

实施例4

1)种子液培养：取菌种bacillussubtilishso121至lb平板上，将平板置于37℃恒温培养箱中活化培养12h；用接种环从斜面上挑取单菌落至种子液培养基中，于37℃，150rpm/min下摇床培养14h取出作为种子液备用，种子液培养基组分为20.0g/l葡萄糖，1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2；培养基ph为6.7；

2)摇瓶培养：将步骤(1)培养完成的种子液按体积分数1.0％的接种量接入发酵培养基中，于37℃，150rpm摇床培养3天。发酵培养基组分：10.0g/l葡萄糖，1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2；培养基ph为6.7，以及1.0～20％花生油，ph为6.9。发酵液对原油的乳化指数e24为90.8％。

实施例5

1)种子液培养：取菌种bacillussubtiliscgmcc1.8715至lb平板上，将平板置于37℃恒温培养箱中活化培养12h；用接种环从斜面上挑取单菌落至种子液培养基中，于37℃，150rpm/min下摇床培养14h取出作为种子液备用，种子液培养基组分为20.0g/l蔗糖，1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2；培养基ph为6.7；

2)摇瓶培养：将步骤(1)培养完成的种子液按体积分数1.0％的接种量接入发酵培养基中，于37℃，150rpm摇床培养3天。发酵培养基组分：40.0g/l蔗糖，1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2；培养基ph为6.7，以及20％橄榄油，ph为6.9。发酵液对原油的乳化指数e24为85.6％。

实施例6

以非水溶性碳源为大豆油(10g/l)及1.34g/lnh4cl，2.45g/lkh2po4，3.97g/lna2hpo4·12h2o，0.1g/lmgso4，1g/l酵母粉，0.001g/lcacl2为培养基，在37℃、培养基初始ph为6.8，分别对枯草芽胞杆菌bacillussubtilis(accc10626、cicc10210和cicc10366)培养3天。取发酵液测定对原油乳化指数e24分别为80.1％、88.3％和84.6％。

本发明得到的发酵液较现有技术产品不仅具有良好的表界面活性，而且同时具有优良的乳化性能。与现有技术产品比较，其对原油的乳化指数e24由52％最高提升至92％。