一种超深渊来源抗菌肽hydramacin及其制备方法与流程

本发明涉及一种超深渊来源的海参peniagonesp.抗菌肽hydramacin，尤其是涉及一种peniagonesp.抗菌肽hydramacin及其制备方法。

技术背景

在生物体免疫过程中，由特定基因编码产生一类具有抗菌活性的小分子蛋白，称为抗菌肽(1、hancockrew,chappleds.peptideantibiotics[j].lancet,1999,349(9049):418.)。抗菌肽具有分子量小、抑菌谱广、在自然环境中广泛且稳定存在等特点。抗菌肽一般由10～60个氨基酸组成，广泛存在于细菌、真菌、病毒、植物、昆虫、两栖类动物、水生动物、哺乳动物体内(2、hej,andersonm,shiw,etal.designandactivityofa‘dual-targeted’antimicrobialpeptide[j].internationaljournalofantimicrobialagents,2009,33(6):532-537.)，能够强选择性地抑制、杀灭细菌或真菌(3、parkcb,kimhs,kimsc.mechanismofactionoftheantimicrobialpeptidebuforinii:buforiniikillsmicroorganismsbypenetratingthecellmembraneandinhibitingcellularfunctions.[j].biochemical&biophysicalresearchcommunications,1998,244(1):253-257.)，还具有抗病毒(4、jrrw,mcdougallb,trand,etal.anti-hiv-1activityofindolicidin,anantimicrobialpeptidefromneutrophils[j].journalofleukocytebiology,1998,63(1):94-100.)、抑制肿瘤细胞生长(5、lius,yangh,caih,etal.[enhancementofcytotoxicityofcantionicantimicrobialpeptideintumorcellsbyconjugationtocell-penetratingpeptide].[j].journalofbiomedicalengineering,2011,28(1):110.)、促进细胞愈合和免疫调节等作用。

现如今，抗菌肽在多个领域都具有应用价值，具有极大的研究意义。

抗菌肽不仅具有广谱抗菌性，能杀灭细菌、真菌和病毒，而且具抑制肿瘤细胞生长、促进细胞愈合、免疫调节等作用，对人体及其它动物、植物生理损害作用很小，在先天性获得免疫方面还发挥着重要作用，易被蛋白酶水解，在生物体内的半衰期较短。最重要的是，抗菌肽对细菌的作用机制多样，作用靶点不特定不单一，不易产生耐受性，在临床医学中，是极具潜力的抗生素替代药物(6、hancockr.thetherapeuticpotentialofcationicpeptides.[j].expertopiniononinvestigationaldrugs,1998,7(2):167-74.)。目前抗菌肽在临床上己有多方面的应用：(1)发挥消炎抗感染的功效，例如多黏菌素b(polymyxinb)和短杆菌肽s(gramicidins)已成功在临床上用于治疗皮肤烧伤感染、手术伤口感染及眼睛表面感染等(7、ledsonmj,gallaghermj,cowperthwaitec,etal.fouryears'experienceofintravenouscolomycininanadultcysticfibrosisunit.[j].europeanrespiratoryjournal,1998,12(3):592-594.)；(2)昆虫抗菌肽pyrrochoricm作为免疫调节剂发挥作用，pyrrochoricm及其衍生物具有运载抗原依赖性疫苗的潜力(8、jrol,cudicm,chuaby,etal.aninsectantibacterialpeptide-baseddrugdeliverysystem.[j].molecularpharmaceutics,2015,1(1):220-232.)；(3)治疗恶性肿瘤，例如由抗菌肽magainin开发的药品ma1278已在临床上显示出对肿瘤细胞有良好的杀伤效果(9、胡荣贵,李改瑞,陆家海.抗菌肽在抗肿瘤方面的研究进展[j].实用肿瘤杂志,2010,25(2):227-230.)。

抗菌肽由于其天然来源、安全无毒、抗菌性强、抗菌谱广、水溶性好、耐热耐酸碱性强等特点，在食品防腐保鲜领域被作为天然防腐剂的一类得到关注和开发。例如由乳酸链球菌分泌的乳酸链球菌素(nisin)，能够抑制葡萄球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属等革兰氏阳性菌的生长，直接添加于猪、牛、羊、禽类等肉制品中可以有效地延长保质期(10、李增利.nisin抗菌作用机制及抑菌效力[j].食品科技,2004(10):59-62.)。

抗菌肽具有广谱抗菌性，当抗菌肽替代抗生素作为饲料添加剂时，不仅可以促进禽畜、水产类动物的生长，还可以提高它们对外源病原菌的免疫力，且在动物体内无毒副作用、无残留、不易产生耐药性(11、姜珊,王宝杰,刘梅,等.饲料中添加重组抗菌肽对吉富罗非鱼生长性能及免疫力的影响[j].中国水产科学,2011,18(6):1308-1314.)。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供peniagonesp.抗菌肽hydramacin基因序列。

本发明的第二个目的是提供peniagonesp.抗菌肽hydramacin蛋白序列。

本发明的第三个目的是提供peniagonesp.抗菌肽hydramacin的制备方法。

本发明所述peniagonesp.抗菌肽hydramacin基因，其编码peniagonesp.抗菌肽hydramacin的核苷酸序列，记作hydramacin。

所述peniagonesp.抗菌肽hydramacin基因的分子类型为dna，序列特征：长度为249bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述peniagonesp.抗菌肽hydramacin基因的序列如下所示，记为seqidno.1：

本发明所述peniagonesp.抗菌肽hydramacin基因，其核苷酸序列采用以下方法获得，首先根据序列信息人工合成hydramacin的核苷酸序列，序列分析知1～66bp为信号肽序列；切除信号肽后序列为seqidno.2：

随后以人工合成的hydramacin为模板，以合成序列seqidno.4，seqidno.5作为引物，经pcr扩增获得hydramacin基因核苷酸序列seqidno.2(去除信号肽)。然后通过原核重组表达hydramacin基因，纯化hydramacin基因的表达产物；

所述合成序列seqidno.4：cgggatccggtatcggcgattgttgggc；(下划线为核酸内切酶，酶切位点bamhⅰ)

所述合成序列seqidno.5：cggaattctcagtagcactgacattgcc；(下划线为核酸内切酶，酶切位点ecorⅰ)

所述peniagonesp.抗菌肽hydramacin的分子类型为蛋白质，序列特征：长度为60aa，类型为氨基酸，所述peniagonesp.抗菌肽hydramacin的氨基酸序列记为seqidno.3：

1gigdcwatwsrcsqwsdwgtgwlwqscndrckelgrrggscqdvssscpfssrawqcqcy

所述peniagonesp.抗菌肽hydramacin，其蛋白具有seqidno.3所示氨基酸序列的多肽；或将seqidno.3氨基酸序列经过至少1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与seqidno.3所示的氨基酸序列相似功能的多肽。

本发明所述peniagonesp.抗菌肽hydramacin的制备方法，包括以下步骤：

1)peniagonesp.抗菌肽hydramacin的人工合成和序列分析；

2)peniagonesp.抗菌肽hydramacin基因的pcr扩增和序列分析；

3)peniagonesp.抗菌肽hydramacin的重组表达与纯化。

本发明根据获得的序列信息，通过基因合成hydramacin基因的核苷酸序列，在pet-his载体构建了适用于原核表达的重组质粒，在大肠杆菌bl21(de3)plyss中进行重组蛋白表达，经纯化后的蛋白纯度高，为该蛋白的实际应用提供了基础。通过异源重组表达的hydramacin，可以克服原料来源难以获取，分离纯化过程复杂繁琐、产量低等不足，为该蛋白能广泛应用于临床医学、食品、禽畜、水产养殖业等领域奠定基础。

附图说明

图1为hydramacin基因重组表达的tricine-page电泳图谱。在图1中，m:蛋白marker；1：重组载体pet-his-hydramacin在菌株bl21(de3)plyss的未诱导表达；2：重组载体pet-his-hydramacin在菌株bl21(de3)plyss中的诱导表达；3：重组质粒pet-his-hydramacin在菌株bl21(de3)plyss中诱导表达超声破碎后上清；4：重组载体pet-his-hydramacin在菌株bl21(de3)plyss中诱导表达超声破碎后包涵体。

图2为pet-his-hydramacin纯化的tricine-page电泳图谱。在图2中，m:蛋白marker；1：经镍柱介质纯化所得的目的蛋白hydramacin。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(12、萨姆布鲁克，拉塞尔(著)，黄培堂(译)，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年，第三版)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。

为实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是：

1.peniagonesp.抗菌肽hydramacin的人工合成和序列分析；

根据获得的peniagonesp.抗菌肽hydramacin基因序列信息，由生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成peniagonesp.抗菌肽hydramacin的核酸序列。

2.peniagonesp.抗菌肽hydramacin基因的pcr扩增和序列分析

以人工合成的hydramacin为模板，用引物f和r扩增hydramacin基因(不含信号肽)：

f：cgggatccggtatcggcgattgttgggc(seqidno.4)；

r：cggaattctcagtagcactgacattgcc(seqidno.5)；

其中，划线部分ggatcc代表bamhi酶切位点，gaattc代表ecori酶切位点。

在50μl的反应体系中含0.5μl模板，1μl引物f(10μm)，1μl引物r(10μm),4μldntp(各2.5mm)，10μl5×primerstar^tmbuffer，0.5μlprimerstar^tmhsdnapolymerase(2.5u/μl)(takara公司)，用h2o将总体积补至50μl。pcr反应条件为：98℃1min；30cycles(98℃10s、58℃30s、72℃30s)；72℃10min；4℃保存。pcr产物经纯化后与t载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞top10中，菌落pcr后选取有dna片段的阳性克隆测序。

3.peniagonesp.抗菌肽hydramacin蛋白的表达与纯化

将含有hydramacin基因的质粒用bamhi和ecori酶切，胶回收hydramacin基因片段，同时将质粒pet-his用相同的酶进行酶切。将两者连接过夜(12～16h)。连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞top10中，提取质粒，测序验证。

将测序正确的质粒pet-his-hydramacin转化bl21(de3)plyss，37℃生长15h后菌落pcr验证质粒转化的正确性。挑选转化正确的菌落，接种到100ml含有100mg/l氨苄青霉素的lb培养基中，37℃摇培至a600＝0.6时，加入异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)至终浓度1mm，37℃诱导4～5h；将菌液收集至200ml的离心管中，8000g离心10min沉淀细菌细胞；将细菌细胞重新悬浮在20mlbindingbuffer缓冲液(50mm磷酸钠缓冲液，300mm氯化钠，ph＝7.4)中，超声波处理至菌液成半透明，再14000rpm离心20min，弃上清；将包涵体沉淀用含8m尿素的bindingbuffer缓冲液混匀溶解；待溶解完全后4000g离心5min，所得上清与平衡后的gehealthcarenisepharose(ge公司)室温结合过夜。纯化过程按照纯化试剂盒说明进行。纯化得到的融合蛋白his-hydramacin经15.5％的tricine-page电泳分析，其分子量约为9kda，纯度达90％以上(图1和2)。

序列表

<110>自然资源部第三海洋研究所

<120>一种超深渊来源抗菌肽hydramacin及其制备方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>249

<212>dna

<213>peniagonesp.

<400>1

atgaggtccgctattttgctcgttgtgttcgtggttctctacgcgaatgttcctccagcg60

tccgcgggtatcggcgattgttgggctacttggtctcgctgctcccaatggtccgactgg120

ggtactggttggctctggcaaagttgcaacgacagatgcaaggagctcggcagacgtggt180

ggcagttgtcaagatgtgtcatcttcctgtccatttagtagtcgtgcatggcaatgtcag240

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<211>183

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<213>peniagonesp.

<400>2

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<210>3

<211>60

<212>prt

<213>peniagonesp.

<400>3

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151015

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glyleuglyalaalaglyglysercysglyalavalsersersercys

354045

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<212>dna

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