一种抑制肿瘤细胞增殖和迁移的Zyxin基因shRNA及重组载体与应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种可以抑制zyxin基因的表达，进而抑制肿瘤细胞增殖和迁移的shrna，具体涉及一种抑制肿瘤细胞增殖和迁移的zyxin基因shrna及其重组载体，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

zyxin(zyx)基因属于lim蛋白家族，主要分布于局部粘附(fa)并能够在细胞质或细胞核间穿梭。zyxin的c末端有三个串联的lim结构域，这三个结构域和很多特殊的蛋白存在相互作用，并与局部粘附有关(schmeichel,k.l.,&beckerle,m.c.(1994).thelimdomainisamodularprotein-bindinginterface.cell,79(2),211-219)；而n末端富含脯氨酸，介导肌动蛋白极化作用。zyxin参与肌动蛋白骨架动力学，细胞移动和信号传导在局部粘附区域,肌动蛋白极化过程中，actin调节蛋白如arp2/3复合体，ena/vasp蛋白都起到很重要的作用(beckerle,m.c.(1998).spatialcontrolofactinfilamentassembly:lessonsfromlisteria.cell,95(6),741-748.).zyxin是局部黏附(fa)区域机械力传导系统重要的组成部分。机械信号通过zyxin聚集以及ena/vasp招募传导肌动蛋白极化信号。

有研究表明，zyxin的n末端与α-actinin存在相互作用，该末端的缺失导致zyxin在fa聚集减少和异位。在tgf-beta1作用下，zyxin调节细胞骨架重组促进细胞迁移，进而诱导细胞发生上皮间质转化(emt)，在emt过程中，zyxin能够通过调节细胞间连接区域的肌动蛋白膜，使得细胞在emt过程中能够调节细胞移动，从组织中完全分离和迁移(sperry,r.b.,bishop,n.h.,bramwell,j.jetal(2010).zyxincontrolsmigrationinepithelial-mesenchymaltransitionbymediatingactin-membranelinkagesatcell-celljunctions.jcellphysiol,222(3),612-624.)。所以特异性的沉默zyxin能够对某些癌细胞增殖和迁移过程中的功能研究和机制分析起到至关重要。

核糖核酸干扰(rnainterference,rnai)作为一种基因沉默技术，已被证明可高效和特异地阻断体内特定基因的表达，从而导致细胞特异基因的沉默，使细胞表现某种基因表型的缺失。目前该技术在肿瘤的基因治疗及新药的研发等方面已经显示出广阔前景。主要策略是在体外构建能够表达rnai的载体，然后迁移到细胞内转录rnai的策略。常用的载体有逆转录病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒表达系统相比于其他表达系统，具有免疫原性低、感染效率高、感染时间长、感染效果稳定、且能感染分裂相细胞和非分裂相细胞等优点。

在国外慢病毒载体技术已广泛应用到临床研究阶段，是生物医药研究领域在临床肿瘤的应用技术研究的主要手段。

结直肠癌平均五年生存率为67％，但约半数以上结直肠癌患者在原发灶确诊时或行根治性切除术后发生转移,一旦发生远处转移，五年生存率仅为13％。虽然，新型分子靶向药物的应用以及治疗方案的不断改进，但转移仍然是影响结直肠癌患者治疗效果和预后的关键因素，是结直肠癌患者最主要的死因。

目前尚无对zyxin基因在肠癌细胞中增殖和迁移中的作用的报道。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种抑制肿瘤细胞增殖和迁移的zyxin基因shrna，为此本发明提供如下沉默人源zyxin基因表达的shrna：

zyxin-shrna1以seqidno:1序列作为特异性沉默人源zyxin基因表达的靶点序列，并包含其互补性碱基序列seqidno:2：

seqidno:1cttccacatgaagtgttacaa

seqidno:2ttgtaacacttcatgtggaag。

靶序列及其互补碱基序列，通过序列ctcgag环形loop成茎环区、以回文形式相连接而形成发夹结构,再加上启动gatccg和终止序列ttttta，形成特异性沉默人源zyxin基因表达的zyxin-shrna1核苷酸shrna序列(seqidno:3)：

seqidno:3gatccgcttccacatgaagtgttacaactcgagttgtaacacttcatgtggaagttttta

本发明的另一个目的是提供一种含shrna序列的重组表达载体，所述的重组表达载体是如seqidno:3所述的shrna与慢病毒载体构建而成。所述的慢病毒载体为plent-u6-gfp-puro。进一步的，所述能够特异性沉默zyxin基因表达的shrna经由慢病毒载体表达。

具体而言，这个过程包括：将编码zyxin基因小分子干扰rna的上述zyxin-shrna1核苷酸shrna序列克隆入慢病毒载体，构建zyxin基因干扰重组慢病毒载体，大量制备重组质粒，纯化提取载体质粒。进而，该zyxin基因干扰重组慢病毒载体经过病毒共转染包装成为有感染力的病毒颗粒后，经纯化和浓缩收集，完成zyxin基因shrna慢病毒包装。上述zyxin基因shrna慢病毒感染人结直肠癌细胞，并最终表达所述shrna，并特异性的抑制肿瘤细胞中的zyxin基因的表达。

本发明的第三个目的是提供所述zyxin基因shrna在制备抗肿瘤药物或试剂中的应用，尤其在制备抗结直肠肿瘤细胞药物或试剂中的应用。本发明提供的慢病毒重组载体能够高效侵染结直肠肿瘤细胞并抑制结直肠肿瘤细胞的zyxin基因，显著降低zyxin基因的蛋白水平的表达，进而显著的抑制结直肠肿瘤细胞的生长、增殖和迁移能力，促进结直肠肿瘤细胞的凋亡。

增殖和迁移是恶性肿瘤最普遍的生物学特征，也是影响患者生存和预后的关键因素。为了抑制结直肠癌的增殖和转移，本发明提供了一种zyxin基因的shrna，可用于抑制肿瘤细胞的zyxin基因的表达，并抑制结直肠肿瘤细胞的生长。zyxin基因shrna载体则可用于制备所述zyxin基因的shrna。比起瞬时表达载体，zyxin基因shrna慢病毒重组载体则能够高效侵染靶细胞，并进行长时间的稳定表达特异性抑制zyxin基因的shrna，能够显著抑制zyxin基因在蛋白水平的表达，进而抑制结直肠肿瘤细胞的增殖和迁移能力，进一步地可以用作治疗结直肠肿瘤的药物或制剂的基础。因此慢病毒介导的zyxin基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床治疗方式，为恶性肿瘤的治疗提供了一条途径，在结直肠肿瘤治疗研发中具有重要意义。

附图说明

图1是plent-u6-gfp-puro慢病毒载体图谱。

图2是westernblot方法检测三种zyxin-shrna慢病毒(shrna1、shrna2和shrna3)感染hct116细胞沉默zyxin基因从而干扰zyxin蛋白表达的效果。从结果可以看出shrna1能有效沉默zyxin基因表达，并且比其他shrna有更显著的沉默效果。

图3是检测慢病毒侵染人hct116细胞系细胞增殖能力结果(hct116-shzyx：转染zyx干扰慢病毒的hct116细胞组。hct116-ctrl：hct116细胞对照组)。转染干扰慢病毒hct116细胞(方点)体外培养3天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组hct116细胞(圆点)的增殖速度。

图4是transwell迁移和侵袭结果(hct116-shzyx：转染zyx干扰慢病毒的hct116细胞组。hct116-ctrl：hct116细胞对照组)。a.transwell侵袭和迁移实验：hct116-shzyx细胞侵袭和迁移能力均较hct116-ctrl细胞下降。b.hct116-ctrl和hct116-shzyx细胞transwell侵袭和迁移实验统计分析图，*,p<0.01；**,p<0.01。

图5是裸鼠成瘤实验，(hs：转染zyx干扰慢病毒的hct116细胞成瘤组。hc：hct116细胞对照成瘤组)。a.皮下成瘤小鼠。b.皮下瘤块大小。c.皮下瘤块生长曲线。d.组皮下瘤块重量。e.皮下瘤块he染色和ihc染色。缩写：he，苏木素-伊红染色；ihc，免疫组织化学。*,p<0.01。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步描述，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2008中所述的条件。

实施例1：zyxin基因高效干扰慢病毒的筛选与制备

特异性沉默zyxin(zyx)的shrna设计、表达载体的构建及慢病毒包装和有效株筛选和验证包括以下步骤：

第一步，shrna片段序列设计

根据人源zyxin基因序列，筛选zyxin基因的3段短序列作为靶序列，并设计相应的互补碱基序列组成3种shrna：zyxin-shrna1、zyxin-shrna2和zyxin-shrna3。上述3种shrna靶序列，及其相应的互补碱基的序列如下：

zyxin-shrna1靶序列：

seqidno:1cttccacatgaagtgttacaa

zyxin-shrna1互补碱基序列：

seqidno:2ttgtaacacttcatgtggaag

zyxin-shrna2靶序列：

seqidno:4ctgggtcacaaccaaatcaaa

zyxin-shrna2互补碱基序列：

seqidno:5tttgatttggttgtgacccag

zyxin-shrna3靶序列：

seqidno:6cagttccaagtccagtaccaa

zyxin-shrna3互补碱基序列：

seqidno:7ttggtactggacttggaactg

靶序列seqidno:1及其互补碱基序列seqidno:2通过ctcgag序列连接成环形loop茎环区、以回文形式相连接，从而形成发夹结构,再在上述序列的前后连接上启动(gatccg)和终止序列(ttttta)，形成特异性沉默人源zyxin基因表达的shrna：zyxin-shrna1(seqidno:3)

靶序列seqidno:4及其互补碱基序列seqidno:5以同样的方式形成特异性沉默人源zyxin基因表达的第二个shrna：zyxin-shrna2(seqidno:8)。靶序列seqidno:6及其互补碱基序列seqidno:7也以同样的方式形成特异性沉默人源zyxin基因表达的第三个shrna：zyxin-shrna3(seqidno:9)。另外一个随机的靶序列及其互补碱基序列以同样的方式形成一个阴性对照shrna：shrna-control(seqidno:10)

zyxin-shrna1、zyxin-shrna2、zyxin-shrna3和shrna-control的具体序列如下：

zyxin-shrna1核苷酸序列(seqidno:3):

gatccgcttccacatgaagtgttacaactcgagttgtaacacttcatgtggaagttttta

zyxin-shrna2核苷酸序列(seqidno:8):

gatccgctgggtcacaaccaaatcaaactcgagtttgatttggttgtgacccagttttta

zyxin-shrna3核苷酸序列(seqidno:9):

gatccgcagttccaagtccagtaccaactcgagttggtactggacttggaactgttttta

shrna-control核苷酸序列(seqidno:10):

gatccgcacccagtccgccctgagcaaattcaagagatttgctcagggcggactgggtgcttttta

第二步，shrna沉默载体的构建

将人工合成的zyxin-shrna1、zyxin-shrna2、zyxin-shrna3和shrna-control的sense和antisense序列通过变性、退火形成双链dna。将沉默载体plent-u6-gfp-puro双酶切后,利用回收试剂盒回收线性化载体，将回收片段与退火所得的上述3种shrna基因片断及其对照分别插入plent-u6-gfp-puro慢病毒载体的bamhi和mlui位点，由u6启动子调控表达，并进行连接、转化、鉴定阳性克隆、测序得到构建成功的沉默载体(图1)。具体步骤如下：

1、载体酶切

将克隆所需载体进行酶切，酶切体系如下：

加样混匀后置于37℃酶切1-2h(勿加ap)，反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切，并用胶回收试剂盒回收载体。

2、退火

收到引物后先瞬时离心，将引物干粉中加入(nmol数*10)μlh2o，稀释成100μm的母液。退火反应体系如下：

反应程序：

4、连接

将退火产物稀释100倍，与酶切好的载体连接，连接体系如下：

混匀后瞬时离心，22℃连接2h.

5、转化

连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于相应抗性的lb平板上进行筛选；转化的具体步骤：

(1)从-80℃取出提前制备好的dh5a感受态置于冰浴中

(2)待dh5a感受态细胞融化后，取1μl连接产物于20μldh5a感受态细胞中，充分混匀，冰浴中静置30分钟。

(3)将离心管放入42℃水浴锅中40秒(期间不要摇动离心管)，然后快速移至冰浴中，静置2分钟。

(4)向离心管中加入200μl的无菌的lb培养基(不加抗生素)，混匀后置于摇床中37℃，200rpm，振摇1小时。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

(5)涂布到相应抗性的固体培养基平皿中

(6)37℃培养箱中培养过夜。

6、测序

挑取单菌落培养后提取质粒测序验证。

第三步，人源zyx基因shrna慢病毒包装

培养对数生长期的菌液大量制备重组质粒，用中提质粒试剂盒提取质粒，转染hek293细胞并培养，收集含病毒的上清液，纯化并收集慢病毒。具体步骤如下：

1.大量制备重组质粒

1)将对数生长期的菌液2ml加入100ml含100ug/mlamp的lb培养基中；

2)37℃300rpm震荡摇菌过夜；

3)用康为世纪中提质粒试剂盒提取质粒(步骤参照试剂盒说明，见附录2)

2.shrna慢病毒包装，收毒及纯化

将培养hek293细胞t75瓶中的培养基吸净，加入2ml4度冰箱取出的0.25％胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3ml37度水浴中预热的10％dmem，移液枪用10ml移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15ml离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5ml离心管中，加入450ul10％dmem，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4(得每大格细胞数)，再乘以10(10倍稀释)，即为实际n万/ml细胞浓度。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺200-400万/100mm皿；若第三天转染，铺100-200万/100mm皿。每个100mm皿中加10ml10％dmem培养基。转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。

3.包装病毒

optimem需在37度水浴中预热，pei转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。转染每个100mm培养皿的complex成分如下：

mixturei：

mixtureii：

组成成分体积

pei(1ug/ml)44ul

optimem培养基500ul

mixturei和mixtureii室温孵育5-10min，混合mixturei和mixtureii，涡旋并室温孵育15-30min，再将其加到100mm培养皿的hek293细胞中。培养12-18h后更换细胞培养液

4.慢病毒收集

转染后72h，将100mm培养皿中所有细胞用300ul的pbs收于15ml离心管中。打开恒温水浴锅至37℃，将15ml离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。

5.慢病毒纯化

加benonase酶处理(每10ml病毒粗提物中加入1ul--benonase酶-e1014)，37℃孵育1h，除去病毒液中的细胞基因组及残留的质粒dna。4000rpm，4℃，离心10min，取上清。

取出上步得到的慢病毒原液，加入pbs补充到4ml，用0.45um的滤膜过滤。加入1/4病毒体积的bufferp，充分混匀，于4℃放置过夜。3000rpm，4℃离心30min，弃上清，可观察到明显的病毒沉淀。离心的同时，将树脂柱放入到15ml锥形试管中，1000rpm离心2min。扯掉柱子底部，将柱子放入到15ml试管中，拧松帽子，让buffer能随重力流下。一旦液体停止流动，加入4mlbuffers，让其随重力流下。加4mlbuffers溶解重悬病毒沉淀。3000rpm，4℃离心5min.将澄清的上清液转移到一个干净的试管中，再一次3000rpm，4℃，离心5min.将澄清的上清液转移到干净的试管。将上步得到的澄清的病毒液加入到4mlcentrifugaldevice中，3000rpm离心15-20min，直到样品体积达到300ul左右。将病毒样品转移到一个干净的管子里，再加100ul的buffers清洗浓缩管，收集病毒。将上步得到的病毒样品，一滴一滴的加入到柱子中，让其随重力结合到树脂上。加入4mlbuffers入树脂中，溶出慢病毒。将上步得到的4ml慢病毒样品液体，加入到4mlcentrifugaldevice中，3000rpm离心10-30min，约有500ul左右慢病毒浓缩液出来。收集最终得到的纯化后的病毒，于-80℃保存。

第四步，稳转株筛选及人源zyxin基因shrna慢病毒有效验证

对人源hct116细胞，加入shrna慢病毒和对照感染，培养。收集细胞，检测感染效率，提取蛋白做wb验证干扰效率，筛选其中最有效的shrna慢病毒。从wb结果可以看出zyxin-shrna1(图2中的shrna1)能有效沉默zyxin基因表达，并且比其他shrna有更显著的沉默效果(图2)。筛选zyxin-shrna1及对照慢病毒分别感染人源hct116细胞，挑取单克隆，扩大培养细胞，保存用于所述其他实验。具体步骤如下：

1.人源zyxin基因shrna慢病毒有效验证实验

从包装好的3个shrna慢病毒中筛选一个有明显干扰效率的shrna慢病毒。第一天在6孔细胞培养板接种若干孔，每个孔内接种20-40万个人源hct116细胞，铺板时细胞的融合率为50％左右，每孔培养液体积为2ml，进行病毒感染时细胞的融合率约为70％左右。第二天将第一部分已经包装好的shrna慢病毒在冰上融化并分装，标好试用装和对照组。在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的10ul病毒液，混匀后放于二氧化碳培养箱(37℃、5％co2)孵育过夜。第三天病毒感染细胞6小时后，更换培养液。第五天在荧光显微镜下观察慢病毒感染效率并拍照，收集细胞，提蛋白做wb验证，选取其中有效的shrna慢病毒做后续单克隆筛选实验。

2.人源zyxin基因shrna慢病毒筛选单克隆步骤

在6孔细胞培养板接种2个孔，每个孔内接种20-40万个人源hct116细胞，铺板时细胞的融合率为50％左右，每孔培养液体积为2ml，进行病毒感染时细胞的融合率约为70％左右。将筛选好的人源zyxin基因shrna慢病毒及对照慢病毒分别感染人源hct116细胞，24h后，加入1μg/ml嘌呤霉素(puromycin)筛选。每两天换液，继续加puromycin。6天后换液，不再加puromycin。将细胞以合适密度(1:10，1:100，1:500,1:1000四个密度)分到10cm培养皿中，2周后挑取2株单克隆至24孔板，待细胞扩增后取一部分用westernblot检测干扰效果，保留成功干扰的细胞，部分细胞冻存，其余细胞扩大培养，用于后续实验。

实施例2：检测稳定转染慢病毒hct116细胞的增殖能力

取用实施例1提供的，生长状态良好并处于对数生长期的zyxin-shrna1慢病毒感染的人源hct116细胞及其对照，按4×10³/ml接种与96孔板中，每组设置5个复孔，置于培养箱中培养，分别于24h、48h、72h和96h后，每孔加入10ulcck-8，充分混匀后置于培养箱中继续培养2～4h，用酶标仪测波长为450nm的od值，取实验结果的平均值作为最终实验结果，并绘制生长曲线。

结果见附图3，结果表明转染干扰慢病毒hct116细胞(附图3中的hct116-shzyx)体外培养的第三天后，增殖速度减缓，显著低于对照组hct116细胞(附图3中的hct116-ctrl)的增殖速度(p<0.05)。

实施例3:检测稳定转染干扰慢病毒hct116细胞的迁移能力

将transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

取用实施例1提供的，生长状态良好并处于对数生长期的zyxin-shrna1慢病毒感染的人源hct116细胞及其对照，以无血清dmem培养液调整细胞数为1×10⁶细胞/ml，取100ul细胞接种于transwell上室内，每组设3个复室。下室加入含15％fbs的dmem培养液500ul，37℃、5％co2培养24h后，将滤膜上层的细胞用棉签抹去，滤膜以甲醇固定5min。用结晶紫染色15min。在100倍光镜下选择上下左右中5个不同视野的穿过膜的细胞数，求平均值，绘制统计图。

结果见附图4，结果表明转染干扰慢病毒hct116细胞(附图4中的hct116-shzyx)细胞侵袭和迁移能力均较对照组(附图4中的hct116-ctrl)细胞显著下降(p<0.01)。

实施例4:抑制裸鼠成瘤实验

将实施例1提供的，生长状态良好并处于对数生长期的zyxin-shrna1慢病毒感染的人源hct116细胞及其对照细胞，在实验接种前2小时制成细胞悬液，密度调为1×10⁷/0.2ml；在裸鼠背部靠近右前肢皮下注射0.2ml细胞悬液，spf级饲养环境下继续饲养裸鼠。每隔三天检测裸鼠体重和肿瘤细胞移植位置变化、皮下结节形成以及直径变化。采用颈椎脱臼法处死每组裸鼠。于肿瘤细胞接种后4周处死小鼠，随后剥离肿瘤和称重，采用钝性分离法，保证移植瘤包膜完整；用相机拍照存证后，将肿瘤放入固定液中。

结果见附图5，结果表明植瘤27天结束后，从照片看转染干扰病毒载体hct116细胞的干扰组(附图5中的hs)4周后的裸鼠的肿瘤(附图5.a)和剥离(附图5.b)的皮下瘤块明显小于对照组(附图5中的hc)，称重的重量也表明干扰组的皮下瘤块重量明显小于对照组(附图5.d)。转染干扰病毒载体hct116细胞(附图5.c中的hs)可以抑制移植瘤生长，与对照组(附图5.c中的hc)比较，干扰组移植瘤体积从第12天即表现出差异。取组织做用zyxin抗体做免疫组织化学实验表明干扰组中zyxin蛋白表达降低(附图5.e)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种抑制肿瘤细胞增殖和迁移的zyxin基因shrna及其重组载体与应用

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(unknow)

<400>1

cttccacatgaagtgttacaa21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(unknow)

<400>2

ttgtaacacttcatgtggaag21

<210>3

<211>60

<212>dna

<213>人工序列(unknow)

<400>3

gatccgcttccacatgaagtgttacaactcgagttgtaacacttcatgtggaagttttta60

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(unknow)

<400>4

ctgggtcacaaccaaatcaaa21

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(unknow)

<400>5

tttgatttggttgtgacccag21

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(unknow)

<400>6

cagttccaagtccagtaccaa21

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(unknow)

<400>7

ttggtactggacttggaactg21

<210>8

<211>60

<212>dna

<213>人工序列(unknow)

<400>8

gatccgctgggtcacaaccaaatcaaactcgagtttgatttggttgtgacccagttttta60

<210>9

<211>60

<212>dna

<213>人工序列(unknow)

<400>9

gatccgcagttccaagtccagtaccaactcgagttggtactggacttggaactgttttta60

<210>10

<211>66

<212>dna

<213>人工序列(unknow)

<400>10

gatccgcacccagtccgccctgagcaaattcaagagatttgctcagggcggactgggtgc60

ttttta66