mRNA及其制备方法和应用与流程

本发明属于mrna分子技术领域，具体涉及一种mrna及其制备方法和应用。

背景技术：

随着核酸技术的发展，基因治疗越来越成为医药行业的热点。作为一种重要的基因疗法，mrna药物越来越受到市场的青睐。mrna分子被递送到细胞内可产生各种蛋白，包括可溶性蛋白、膜蛋白和细胞内蛋白，尤其是可以产生传统制药方法五和获得的蛋白。与dna基因治疗相比，mrna是一种瞬时表达的工具，具有更好的生物安全性和成药性。随着分子生物学、基因工程、生物化学的发展和完善，人们可以在体外合成大量的mrna药物分子，这为基于mrna的基因疗法带来了巨大的机遇。

目前常见的mrna的合成方法为体外逆转录法，具体合成路线详见图1所示，即用t7、t3或sp6rna聚合酶转录带有其启动子的双链dna模板获得长单链mrna分子，通过优化转录反应体系中的mg²⁺、三磷酸核苷酸(rntp)的浓度，一个拷贝dna模板能产生几十到数百个拷贝的mrna分子，因此，该方法最大的有限是可以规模化合成大量的mrna产物，同时可以对mrna产物进行同位素标记或者荧光染料标记，并且转录长度不受限制等。但是同时这套合成方法也存在技术限制和缺点，其一就是价格昂贵，合成mrna长度超过100nt时，其合成效率会大幅度降低，其二是现有合成技术水平合成的mrna药物分子均一性不高，特别是在mrna产物3’端进行polya加尾反应时，由于不可控造成副产物序列增多，增加了纯化的难度，并会进一步导致高成本。此外，随着科研和市场的发展，以往的合成方法已经逐渐不能满足科研试验和药物研发对mrna的需求，越来越多的mrna生物研究和药物研发中需要用到毫克级甚至克级的mrna，与此同时对rna产品的质量、纯度也提出了更高的要求。

技术实现要素：

针对现有mrna药物分子合成方法合成效率低、副产物序列多、合成的分子均一性差、难以纯化等问题，本发明提供一种mrna的制备方法。

进一步地，本发明还提供上述mrna的制备方法获得的mrna及其用途。

为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种mrna的制备方法，包括以下步骤：

步骤s01.提供dna转录模板；

所述dna转录模板由正义链和反义链组成，其中，所述正义链包含启动子以及连接在所述启动子序列上的目标dna序列，所述启动子序列不含有终止密码子，所述目标dna序列与目标mrna序列相同，所述目标dna序列末端连接有聚多腺苷酸序列；

步骤s02.在rna聚合酶的作用下，对所述dna转录模板进行体外转录，在所述启动子序列的引导下，转录出mrna。

相应地，一种mrna，所述mrna采用如上所述的制备方法制备得到。

以及，一种生物药物，所述生物药物中含有mrna，所述mrna为如上所述的mrna。

本发明的有益效果在于：

相对于现有技术，本发明提供的mrna的制备方法，创造性地构建了mrna转录模板，先将腺嘌呤直接连在dna转录模板正义链的末端，提高转录稳定性，解决了现有mrna合成后再于3’端进行poly-a序列加尾反应时副产物序列增多而出现分子均一性差的问题，并且该制备方法还具有制备效率高、产物便于纯化等优势，可以极大的提高生产效率，降低生产成本。此外，采用本制备方法，可以合成具有高纯度的任意基因的mrna。

本发明提供的mrna，由于其是采用上述方法制备得到，因而其具有分子均一性好等特点，因此其质量、纯度相对于常规的mrna而言更高，能够极大的满足mrna生物研究和药物研发中对mrna毫克级甚至克级别的需求。

通过本发明的制备方法获得的mrna，分子均一性好，稳定性强，纯度高，具有良好的成药性和疗效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为现有mrna的合成方法的合成线路示意图；

图2为本发明提供的mrna的制备方法的制备线路示意图；

图3为本发明实施例1和对比例1制备的mrna的分子均一性检测图谱；

图4为本发明对比例1制备的mrna(绿色荧光蛋白gfpmrna)转染293t细胞12h后的镜检图；

图5为本发明实施例1制备的mrna(绿色荧光蛋白gfpmrna)转染293t细胞12h后的镜检图；

图6为本发明实施例1和对比例1制备的mrna在皮肤组织修复的药物活性对比图；

其中，图示中plasmiddna表示质粒dna；5’utr表示5’端非转录区域；3’utr表示3’端非转录区域；genesequence表示基因序列；codingsequence(cds)表示编码序列；cap表示mrna帽子状结构；start表示启动子；stop表示终止密码子；poly-atail表示多聚腺苷酸尾；poly-asequence表示多聚腺苷酸序列。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供一种mrna的制备方法。

该mrna的制备方法包括以下步骤：

步骤s01.提供dna转录模板；

所述dna转录模板由正义链和反义链组成，其中，所述正义链包含启动子序列以及连接在所述启动子序列上的目标dna序列，所述启动子序列不含有终止密码子，所述目标dna序列与目标mrna序列相同，所述目标dna序列末端连接有聚多腺苷酸序列；

步骤s02.在rna聚合酶的作用下，对所述dna转录模板进行体外转录，在所述启动子序列的引导下，转录出mrna。

下面对本发明的技术方案做详细的解释说明：

步骤s01中，dna转录模板中，正义链上的启动子序列选自t3启动子序列、t7启动子序列、sp6启动子序列中的任一种。在体外转录中，这几类启动子的转录效率最高。

上述目标dna序列末端连接的聚多腺苷酸序列(poly-asequence)长度为100bp～300bp。如果长度过长，会影响mrna分子的翻译效果，长度过短，则会影响mrna分子的稳定性。

优选地，上述dna转录模板可以采用如下方式两种方式之一进行制备：

(1)合成所述dna转录模板的两条引物，pcr扩增得到dna转录模板。

(2)采用限制性内切酶线性化质粒dna模板获得所述dna转录模板。

上述方式(1)涉及的两条引物为：

forwardprimer：5’-taatacgactcactatagg-3’；

reserveprimer：5’-cttcctactcaggctttattcaaagacca-3’。

pcr扩增的条件为：

按下列组份配制pcr反应液

pfu(5u/μl)0.5μl；

10×pfupcrbuffer(mg2+plus)5μl；

dntpmixture(10mmeach)1μl；

模板dna(质粒5-20ng，基因组100-500ng)xμl；

引物1(forwardprimer)：(20μm)1μl；

引物2(reserveprimer)：(20μm)1μl；

灭菌蒸馏水upto50μl。

上述方式(2)中，限制性内切酶没有特别的要求，只要在poly-a序列下游的限制性内切酶均可以使用。所述质粒dna模板改造至pcdna3.1，在此基础上加入5’utr、3’utr以及poly-a序列。

对上述方式(1)和(2)获得的dna转录模板，还包括对其进行进一步的纯化处理。具体的纯化处理方法包括采用异丙醇对获得的dna转录模板进行沉淀处理，随后采用无内病毒素水溶解，由此得到纯化的dna转录模板，通过使用无内毒素水进行溶解，确保后期产物中不含有内毒素，从而达到成药的要求。

步骤s02中，rna聚合酶可以选自原核生物聚合酶，也可以选自真核生物聚合酶。

在进行体外转录时，以三磷酸核苷混合物(rntp)及其化学修饰物为原料。三磷酸核苷混合物中含有三磷酸腺苷(atp)、三磷酸鸟苷(gtp)、三磷酸胞苷(ctp)、三磷酸尿苷(utp)。

化学修饰物包括n6-甲基腺苷、肌苷、5甲基胞嘧啶核苷、假尿嘧啶核苷、5羟甲基胞嘧啶、n1甲基腺苷、mrna帽子状结构。

上述进行体外转录时，在37℃下反应4～6h。

由上述方法可以制备得到纯度高的任意基因的mrna。

本发明提供的mrna的制备方法，先将腺嘌呤直接连在dna转录模板正义链的末端，创造性的构建了mrna转录模板，解决了现有mrna合成后在3’端进行poly-a序列加尾(获得多聚腺苷酸尾)反应时副产物序列增多而出现分子均一性差的问题，并且该制备方法还具有制备效率高、产物便于纯化等优势，可以极大的提高生产效率，降低生产成本。

基于上述制备方法获得的mrna，本发明还提供一种生物材料，如生物药物，所述生物药物中含有mrna，所述mrna采用如上所述的mrna的制备方法制备得到，这些生物材料可以作为生物药物，用在细胞、组织、器官等的医疗中。

为了验证本发明mrna的制备方法，下面通过多个实验进行验证。

实施例1

实施例1提供一种绿色荧光蛋白质mrna(即gfpmrna)的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

s11.在rnase-free的pcr管中，按次序加入下列成分：

注：所述dna模板为线性化的gfp质粒，其是在pcdna3.1质粒的基础上改造，并采用内切酶pmel酶切线性化得到；此为20μl反应体系的用量，其他反应体系，各成分的用量可按比例增减。

s12.37℃反应4-6h。

s13.75℃加热10min灭活rna聚合酶。

s14.取2μl产物电泳检测转录效果。

s15.在体外转录体系中加入1μlrnase-free的dnase去除模板dna(5u/μl)。

s16.37℃反应30min。

s17.用rnase-free水补水到100μl。

s18.用100μltris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的dnase和rna聚合酶。

s19.加入75％乙醇，充分震荡后12000rpm离心10min，弃上清。

s110.所得沉淀晾干后溶于rnase-free水中于-80℃长期保存。

对比例1

对比例1提供一种绿色荧光蛋白质mrna(即gfpmrna)的制备方法，该常规制备方法包括以下步骤：

d11.在rnase-free的pcr管中，按次序加入下列成分：

注：所述dna模板为线性化的gfp质粒，其是在pcdna3.1质粒的基础上改造，并采用内切酶pmel酶切线性化得到；

此为20μl反应体系的用量，其他反应体系，各成分的用量可按比例增减。

d12.37℃反应4-6h。

d13.75℃加热10min灭活rna聚合酶，取2μl产物电泳检测转录效果。

d14.加入4μlpolya聚合酶，20μl酶反应液，10μlmncl2和10μlatp，37℃反应1h。

d15.在体外转录体系中加入1μlrnase-free的dnase去除模板dna(5u/μl)。

d16.37℃反应30min。

d17.用rnase-free水补水到100μl。

d18.用100μltris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的dnase和rna聚合酶。

d19.加入75％乙醇，充分震荡后12000rpm离心10min，弃上清。

d110.所得沉淀晾干后溶于rnase-free水中于-80℃长期保存。

对实施例1和对比例1制备的mrna进行性能表征，具体包括产物分子均一性、翻译效率及药物活性。

(一).产物分子均一性表征

通过毛细管电泳对实施例1和对比例1得到的产物进行产物分子均一性的测定。具体结果如图3所示。

从图3可知，对比例1得到的产物分子分布较广，除了有目的mrna产物，还有大量的反应副产物，而实施例1中，仅目的mrna分子条带，无反应副产物产生，由此可知，本发明实施例1获得的mrna分子均一性高。

(二).翻译效率表征

对实施例1和对比例1得到的mrna进行翻译效率表征，具体是将得到的mrna分别对293t细胞进行转染，转染12h时进行镜检，具体结果如图4、5所示。

从图4可知，对比例1中传统合成方法合成的绿色荧光蛋白mrna转染293t细胞12h蛋白翻译结果；从图5可知，实施例1本发明合成方法合成的绿色荧光蛋白mrna转染293t细胞12h蛋白翻译结果。由此可见本发明的mrna的制备方法获得的绿色荧光蛋白mrna翻译效率更高。

(三).药物活性表征

分别对实施例1和对比例1获得的mrna对皮肤组织进行修复处理。具体为7-8周龄小鼠，用5mm直径生物取样器在皮肤上打孔，形成5mm直径的全皮层移除创口。实施例1，用本发明合成方法合成的mrna与转染试剂、纤维蛋白预混成胶状生物材料，涂于创口处以促进创口愈合。对比例1，用传统合成方法合成的mrna与转染试剂、纤维蛋白预混成胶状生物材料，涂于创口处以促进创口愈合，具体结果如图6所示。

从图6可知，将mrna分别加入到受伤的皮肤组织后，两者的皮肤组织没有差异，第3天观察实施例1与对比例2的皮肤创口均开始愈合，第14天观察实施例1皮肤创口已完全愈合而对比例1皮肤创口还未完全愈合。由此可见，本发明的制备方法制备的mrna在皮肤组织的修复过程中，药效更持久，并且疗效更好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。