一种基于两步PCR的高通量建库方法与流程

本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体地说，它涉及一种基于两步pcr的高通量建库方法。

背景技术：

作为最重要的分子生物学分析方法之一，dna测序不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学研究提供重要数据，而且在基因诊断和基因治疗等应用研究中也发挥着重要的作用。随着科学的发展，传统的sanger测序技术的局限性日益突出。自2005年以来，以roche公司的454技术、illumina公司的solexa技术和abi公司的solid技术为标志的高通量测序技术的相继诞生和发展。通过测序技术对目标序列进行测定，往往需要构建文库，构建文库的一般方法包括以下步骤：1）通过pcr扩增技术获得含待测定区域的核酸分子；2）在含待测定目标区域的核酸分子的两端分别连接不同的接头分子，获得测定文库；3）通用引物扩增连接产物，达到测序要求的量。但是，在步骤2）中，为了实现这两种接头分子与含待测定目标区域的核酸分子的定向连接，需要一次进行末端修复、连接反应，且为了保证获得文库分子的纯度，减少非目标产物的生成，在上述2步或3步反应中需要进行1至2次的分离纯化步骤，建库步骤繁杂，效率低。

因此，需要一种新的快速建库方法简化实验步骤，提高建库效率。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于两步pcr的高通量建库方法，旨在解决现有技术中步骤繁杂，建库效率低的问题。

一种基于两步pcr的高通量建库方法，包括如下步骤：

第1步，提取dna样本；

第2步，将dna样本在pcr扩增体系中，采用序列如seqidno.1-2所示的特异性正向引物和特异性反向引物对其进行扩增，得到扩增产物；

第3步，在第2步得到的扩增产物中加入核酸外切酶i进行酶切处理；

第4步，在第3步得到的酶切产物中采用特异性引物和通用引物进行扩增处理，使扩增片断上带有接头，得到带接头的文库；

第5步，对第4步得到的带接头折文库采用磁珠纯化，得到测序文库。

在一个实施方式中，第4步中的特异性引物的3’端与特异性正向引物5’端序列一致。

在一个实施方式中，第4步中的通用引物的3’端与特异性反向引物5’端序列一致。

在一个实施方式中，特异性引物序列如seqidno.3所示。

在一个实施方式中，通用引物序列如seqidno.4所示。

在一个实施方式中，第2步中的pcr扩增程序如下所示：

。

在一个实施方式中，第4步中的pcr扩增程序如下所示：

。

在一个实施方式中，所述的第3步中，酶切处理的参数是：37℃孵育1小时，95℃孵育5分钟；核酸外切酶i的规格是10,000u/ml。

在一个实施方式中，第5步，磁珠纯化的过程是将pcr产物与磁珠混合，除上清，再用乙醇洗涤磁珠，用洗脱液洗脱dna。

在一个实施方式中，所述的乙醇是80%乙醇。

本发明还提供了：

上述的建库方法所得到的dna测序文库。

上述的文库在高通量测序中的用途。

在一个实施方式中，所述的高通量测序是在life平台上进行的测序。

有益效果

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1、本发明方法无需特异性合成的测序接头。2、本发明方法使用的核酸外切酶i只水解单链dna。3、本发明方法用核酸外切酶i水解单链dna代替磁珠纯化，可以节省操作时间，缩短建库周期。4、本发明方法使用两步pcr方法建库，很大程度上节省操作时间，缩短建库周期。

附图说明

图1：本发明的建库流程图。

图2：构建得到文库片段大小图。

图3：测序扩增子数据图。

具体实施方式

实施例1

dna的提取和片段化

将一例健康人的血液样本经采集后，立即于2700xg，10min，收集上层血清于干净的tube管中，-80℃保存备用，采用qiagendneasyblood&tissuekit(qiagen,hilden,germany)抽提外周血dna，qiaampcirculatingnucleicacidkit抽提循环肿瘤dna。按说明书指示方法操作。使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测dna的质量和浓度。dna的260nm吸光率大于0.05以上，吸光率a260/a280比值在1.8到2之间为合格。将3微克高质量的基因组dna用低te缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书，将dna片段化，使片段长度为150-200碱基。使用beckmancoulterampurebeads试剂盒将dna过柱纯化。

pcr扩增待测序样本序列，得扩增产物

在200ulpcr管中取总量200ng、浓度为100ng/ul、体积2ul的基因组dna样本，加入8ulpcr基因特异引物、10ul酶混合液、10ul去离子水，pcr扩增体系为30ul，混匀后置于pcr仪上反应；

采用的特异性引物的正向引物序列如seqidno.1所示。

3’-ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagagactaccatctgctatgactgcatctgtaccaccaagagctgta-5’（seqidno.1）

采用的特异性引物的反向引物序列如seqidno.2所示。

3’-cctctctatgggcagtcggtgattatgccatcatgcgtagtcacgtctgtcaaactgcatgat-5’（seqidno.2）

pcr扩增待测序样本，pcr仪温度设定程序如下：

酶切

向得到的pcr产物中加入6ul核酸外切酶i和4ul核酸外切酶i缓冲液，在37℃孵育1小时，95℃孵育5分钟。核酸外切酶i(e.coliexoⅰ,2650a,大连宝生物工程有限公司)，规格为10,000u/ml；

pcr扩增引入测序接头

向酶切得到的dna中加入1ulpcr特异性引物seqidno.3、1ul通用引物seqidno.4（特异引物3’端与步骤（1）中正向引物5’端序列一致，通用引物3’端与步骤（1）中反向引物5’端序列一致）、24ul酶混合液、10ul去离子水，混匀后置于pcr仪上反应；特异性引物，视为区分不同样品设计的特异标示单个样本的引物，用于在美国测序公司life生产的测序仪上测序后筛选数据，pcr扩增引入测序接头，pcr仪温度设定程序如下：

这里的特异性引物的序列是：

3’-atgtcgagaaccaccatgtctacgtcagtatcgtctaccatcaagatcggaaatggccca-5’（seqidno.3）

通用引物的序列是：

3’-tagtacgtcaaactgtctgcactgatgcgtactaccgtattagtggctgaccctggacgtagtcg-5’（seqidno.4）

磁珠纯化

将pcr扩增引入测序接头的pcr产物，加入到装有56uldna纯化磁珠的1.5mlep管中，涡旋混匀，室温静置5分钟，然后将1.5mlep管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃掉上清液，加入当天配制的80%乙醇300ul清洗磁珠两遍，弃掉上清液，让磁珠风干，然后用30ulelutionbuffer洗脱dna；将上清液转移到新的装有24uldna纯化磁珠的1.5mlep管中，涡旋混匀，室温静置5分钟，然后将1.5mlep管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃掉上清液，加入当天配制的80%乙醇清洗磁珠两遍，弃掉上清液，让磁珠风干，然后用20ulelutionbuffer洗脱dna；，所得上清dna溶液吸至一新的1.5mlep管中；dna纯化磁珠为美国贝克曼库尔特有限公司（beckmancoulterinc.）生产的dna纯化磁珠。

检测文库质量为15.6ng/μl，符合上机要求；文库中片断大小分布如图2所示，从图中可以看到，主要的片断大小在600-700bp左右，大小和均匀性好。

再将得到的文库在life公司的测序平台进行测序，数据利用率68.8%，比对成功率89.4％、测序覆盖率达100%；扩增子的读段数如图3所示，可以看出，读段(reads)数均匀性好。

序列表

<110>广州市达信智能科技有限公司

<120>一种基于两步pcr的高通量建库方法

<130>无

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>75

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccatctcatccctgcgtgtctccgactcagagactaccatctgctatgactgcatctgta60

ccaccaagagctgta75

<210>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cctctctatgggcagtcggtgattatgccatcatgcgtagtcacgtctgtcaaactgcat60

gat63

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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