专利名称：一种高通量的功能筛选和目标重组子的pcr检出体系的建立方法
技术领域：
本发明主要涉及一种方法，尤其涉及一种高通量的功能筛选和目标重组子的PCR检出体系的建立方法。
背景技术：
宏基因组文库的筛选通常有两种方法:功能筛选和序列筛选。功能筛选法根据重组克隆产生的新活性进行筛选，可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质。但工作量大，效率低，往往分析成千上万个克隆仅能获得不到10个活性克隆。而序列筛选法根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或PCR引物，通过PCR扩增筛选阳性克隆子，该法有可能筛选到某一类结构或功能的蛋白质中的新分子，其缺点是必须对相关基因序列有一定的了解，较难发现全新的活性物质，也很难获得全序列。
发明内容
本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供高通量的功能筛选和目标重组子的PCR检出体系的建立方法。本发明是通过以下技术方案实现的:一种高通量 的功能筛选和目标重组子的PCR检出体系的建立方法，包括以下步骤:将功能筛选和序列筛选相结合，先利用纤维素酶作用底物经高通量的功能筛选，初筛出数个阳性克隆，再由兼并引物对阳性克隆子进行菌液PCR扩增，PCR扩增出目的条带的克隆子再进行下一步测序确定。一种高通量的功能筛选和目标重组子的PCR检出体系的建立方法，本发明的方法是用于山羊瘤胃微生物DNA宏基因组文库中纤维素酶新基因的筛选。本发明的优点是:该检测体系简化实验程序，降低了实验的劳动量，增加了筛选出新基因的机会。
图1为兼并引物的PCR产物。
具体实施例方式实施例1将构建成功的文库克隆影印到含0.1%七叶苷和0.25%柠檬酸高铁铵的LA平板上培养15h，菌落周围显黑色的即为阳性克隆。设计纤维素酶保守序列引物:F:5’-CTGCCA(ct) CCGGCT (ag) TGCTc (agct) GC-3，； R: 5，-GCCG (gc) AG (ag) GAGAGG (ct) GC(gc) TACCA-3’，挑取阳性克隆58个菌落，分别溶于50 μ L无菌的蒸馏水中，煮沸5分钟，12000rpm离心，分别取上清3 μ L为模板，兼并引物进行PCR扩增，PCR反应的条件为:94°C预变性lmin，94°C变性40sec，50°C退火40sec，72°C延伸1.5min，30个循环，最后72°C延伸6min。PCR结束后电泳检测扩增的条带，其中26个扩增获得目的条带。纯化，连接T载体，进行序列测定，去除引物区域的氨基酸序列后，26条基因氨基酸序列进行Blast比对分析，每条基因与已知纤维素酶氨基酸序列相似性均大于45 %，通过简并引物PCR扩增得到的26条基因序列为纤维素酶新基因。可以进行后续的进一步研究。Blast分析26条基因与数据库中已知纤维素酶的相似性；
权利要求
1.一种高通量的功能筛选和目标重组子的PCR检出体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤: 将功能筛选和序列筛选相结合，先利用纤维素酶作用底物经高通量的功能筛选，初筛出数个阳性克隆，再由兼并引物对阳性克隆子进行菌液PCR扩增，PCR扩增出目的条带的克隆子再进行下一步测序确定。
2.一种如权利要求1所述的高通量的功能筛选和目标重组子的PCR检出体系的建立方法，其特征在于本发明的方法是用于山羊瘤胃微生物DNA宏基因组文库中纤维素酶新基因的筛 选。
全文摘要
本发明公开了一种高通量的功能筛选和目标重组子的PCR检出体系的建立方法，包括以下步骤将功能筛选和序列筛选相结合，先利用纤维素酶作用底物经高通量的功能筛选，初筛出数个阳性克隆，再由兼并引物对阳性克隆子进行菌液PCR扩增，PCR扩增出目的条带的克隆子再进行下一步测序确定。该检测体系简化实验程序，降低了实验的劳动量，增加了筛选出新基因的机会。
文档编号C12Q1/68GK103215355SQ201310111678
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月1日 优先权日2013年4月1日
发明者许发芝 申请人:安徽农业大学