一种能将三七皂苷R1和R2分别转化为人参皂苷Rg1和Rh1的热适应性改良木糖苷酶的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种木糖苷酶突变体muty311p及其应用，具体为一种能将三七皂苷r1和r2分别转化为人参皂苷rg1和rh1的热适应性改良木糖苷酶。

背景技术：

木聚糖是一种半纤维素，其主链主要由木糖经β-1,4糖苷键连接而成。藻类细胞壁中也有木聚糖，但其主链主要由木糖经β-1,3糖苷键连接而成。经内切木聚糖酶水解，木聚糖可降解为木寡糖。木糖苷酶可降解木寡糖，形成木糖。已发现的木糖苷酶基本都是β-1,4键糖苷水解酶(phuengmaungpetal.enzymeandmicrobialtechnology,2018,112:72–78.)。

三七皂苷有多种成分，其中，三七皂苷r1和r2含有木糖基团，其与相邻的葡萄糖基团以β-1,2糖苷键进行连接(图1)。由于在三七皂苷r1和r2中，木糖基团与葡萄糖基团相连，而不是由木糖基团与木糖基团相连，同时由于木糖基团与葡萄糖基团形成β-1,2糖苷键，而不是β-1,4糖苷键，所以已发现的能去除三七皂苷r1和r2中木糖基团的木糖苷酶非常稀少。

将三七皂苷r1和r2中的木糖基团去除，可以分别得到人参皂苷rg1和rh1。人参皂苷rg1和rh1具有抗癌、抗氧化、消炎、保肝等作用，在药品和保健品中具有应用价值。但是高温下微生物不易生长，高温下酶容易失活，因此，高温下的处理可有效防止污染。在70℃下，木糖苷酶jb13gh39只有9.9％的活性(linetal.journalofagriculturalandfoodchemistry,2018,66:9465–9472.)。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能将三七皂苷r1和r2分别转化为人参皂苷rg1和rh1的木糖苷酶突变体muty311p，突变体muty311p的热适应性获得了改良，其在70℃下具有41.5％的活性，比野生酶jb13gh39在70℃下的活性提高30％。该木糖苷酶突变体muty311p可应用于医药、保健品等行业。

为了实现该技术目标，本发明具体通过以下技术方案实现：

通过蛋白与底物的分子对接等生物信息学技术，本发明设计了木糖苷酶突变体muty311p，所述的突变体muty311p的氨基酸序列如seqidno.1所示，与数据库记录的木糖苷酶序列jb13gh39(序列号mg838204翻译蛋白序列；seqidno.3)相比，muty311p在jb13gh39的第311位点发生了突变，即jb13gh39的第311位点是氨基酸“y”，而在muty311p中对应的氨基酸是第297位点“p”。

所述突变体muty311p的最适ph为5.0，在ph4.0时约有42％的活性；最适温度为55℃，在70℃具有41.5％的酶活；该酶可降解三七皂苷r1和r2，产物分别为人参皂苷rg1和rh1，降解率在90％以上。

所述的突变体muty311p的编码基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明的另一目的在于提供一种包含木糖苷酶突变体muty311p编码基因的重组载体。

本发明的另一目的在于提供一种包含木糖苷酶突变体muty311p编码基因的重组菌。

本发明所述的木糖苷酶突变体muty311p的制备方法，具体包括以下步骤：

1)扩增或基因合成野生酶jb13gh39无信号肽的编码序列，如seqidno.4所示；

2)将1)中序列与表达载体peasy-e2进行连接，得到重组表达质粒peasy-e2-jb13gh39；

3)以重组质粒peasy-e2-jb13gh39为模板，设计突变引物进行突变和重组，得到含muty311p编码基因的重组质粒peasy-e2-muty311p；

4)用质粒peasy-e2-muty311p转化大肠杆菌bl21(de3)，获得包含muty311p编码基因的重组菌株；

5)培养重组菌株，诱导木糖苷酶突变体muty311p表达；

6)回收并纯化所表达的木糖苷酶突变体muty311p。

优选的，步骤(3)中所述的突变引物为：

5'atggagcaccagcccaacgccgcgcgatgccgtg3'；

5'ttgggctggtgctccattcggtgaaatagagt3'。

在本发明的另一方面，所述的木糖苷酶突变体muty311p在医药和保健品中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果为：

与野生酶jb13gh39相比，突变酶muty311p的热适应性获得了改良，其在70℃下具有41.5％的活性，比野生酶jb13gh39在70℃下的活性提高30％。

附图说明

图1：利用木糖苷酶突变体muty311p将三七皂苷r1和r2分别转化为人参皂苷rg1和rh1的示意图；

图2：在大肠杆菌中表达的野生酶jb13gh39及其突变体muty311p的sds-page分析，其中，m：蛋白质marker；w：纯化的野生酶jb13gh39；311：纯化的突变体muty311p；

图3：纯化的野生酶jb13gh39及其突变体muty311p水解木二糖(x2)、木三糖(x3)、木四糖(x4)、木五糖(x5)及木六糖(x6)的产物分析，其中，x1：木糖；ck：底物和失活的酶(煮沸10min)；s：反应组。

图4：纯化的野生酶jb13gh39及其突变体muty311p的ph活性；

图5：纯化的野生酶jb13gh39及其突变体muty311p的热活性；

图6：纯化的突变酶muty311p水解三七皂苷r1的hplc分析；a：人参皂苷rg1，b：三七皂苷r1，c：三七皂苷r1+muty311p；

图7：纯化的突变酶muty311p水解三七皂苷r2的hplc分析；a：人参皂苷rh1，b：三七皂苷r2，c：三七皂苷r2+muty311p。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明以下实施例中的实验材料和试剂：

菌株及载体：鞘氨醇单胞菌(sphingomonassp.)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cgmcc1.10968，由云南师范大学提供；大肠杆菌escherichiacolibl21(de3)和表达载体peasy-e2购于北京全式金生物技术有限公司。

酶类及其它生化试剂：nickel-ntaagarose购自qiagen公司，dna聚合酶、dntp及ii试剂盒购自南京诺维赞公司，三七皂苷r1和r2及人参皂苷rg1和rh1购自上海源叶生物科技有限公司，木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木六糖购自megazyme公司，pnp(p-nitrophenol)和pnpx(p-nitrophenyl-β-d-xylopyranoside)购自sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

lb培养基：peptone10g，yeastextract5g，nacl10g，加蒸馏水至1000ml，ph自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1野生酶jb13gh39表达载体的构建和转化

1)提取鞘氨醇单胞菌基因组dna

将培养2d的液体菌液离心取菌体，加入1ml溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，裂解液组成为：50mmtris，20mmedta，nacl500mm，2％sds(w/v)，ph8.0，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量te溶解，置于-20℃备用。

2)扩增或基因合成野生酶jb13gh39无信号肽的编码序列

根据genbank记录的木糖苷酶核苷酸序列mg838204，设计引物5'gcaactctctgcacggctccgg3'和5'ctttcgctccttgggtgcaattgac3'，以鞘氨醇单胞菌基因组dna为模板，进行pcr扩增。pcr反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，30个循环后72℃保温10min。

pcr结果得到木糖苷酶基因jb13gh39(seqidno.4)，并在该基因3’端引入突出的a碱基。将木糖苷酶基因jb13gh39和表达载体peasy-e2通过t-a方式相连接，获得含有jb13gh39的重组表达质粒peasy-e2-jb13gh39。将peasy-e2-jb13gh39转化大肠杆菌bl21(de3)，获得重组大肠杆菌菌株bl21(de3)/jb13gh39。木糖苷酶基因jb13gh39(seqidno.4)也可以通过基因合成得到。

实施例2突变酶muty311p表达载体的构建和转化

以重组质粒peasy-e2-jb13gh39为模板，根据南京诺唯赞生物科技有限公司突变试剂盒mutiifastmutagenesiskitv2方法进行突变和重组。

突变引物为5'atggagcaccagcccaacgccgcgcgatgccgtg3'和5'ttgggctggtgctccattcggtgaaatagagt3'，pcr反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，68℃退火30sec，72℃延伸3min，30个循环后72℃保温10min。

结果得到含muty311p编码基因的重组质粒peasy-e2-muty311p，用质粒peasy-e2-muty311p转化大肠杆菌bl21(de3)，获得包含muty311p编码基因的重组菌株bl21(de3)/muty311p。

实施例3野生酶jb13gh39和突变酶muty311p的制备

将重组菌株bl21(de3)/jb13gh39和bl21(de3)/muty311p以0.1％的接种量分别接种于lb(含100μgml^-1amp)培养液中，37℃快速振荡16h。

然后将此活化的菌液分别以1％接种量接种到新鲜的lb(含100μgml^-1amp)培养液中，快速振荡培养约2–3h(od600达到0.6–1.0)后，加入终浓度0.7mm的iptg进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的ph7.0mcilvaine缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12,000rpm离心10min后，吸取上清并用nickel-ntaagarose和0–500mm的咪唑分别亲和和洗脱目的蛋白。sds-page结果(图2)表明，野生酶jb13gh39和突变酶muty311p都得到了纯化，产物为单一条带。

实施例4纯化的野生酶jb13gh39和突变酶muty311p降解木寡糖的活性测定

对木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木六糖的活性测定方法采用薄层层析法(tlc)，反应体系含45μl0.5％(w/v)的底物，5μl适当稀释酶液(约1μg酶液)，在ph4.5及50℃下，反应150min后终止反应并分析水解产物(使用青岛海洋化工有限公司的高效薄层层析硅胶板g型)。

薄层层析步骤如下所示：

(1)配制展开剂(冰醋酸20ml，双蒸水20ml，正丁醇40ml，混匀)，取适量倒入展开槽，静置30min左右；

(2)将硅胶板放在110℃烘箱中活化30min，冷却后划线，点样(每次0.5μl，吹干，共点3次)；

(3)将点样的一端硅胶板朝下放入展开槽中，点样点不要没入展开剂；

(4)待展开剂到距硅胶板上沿1.5cm时，取出硅胶板，吹干，再展开一次；

(5)第二次展开结束后，硅胶板直接浸入适量显色剂(1g二苯胺溶于50ml丙酮中，溶解后加入1ml苯胺及5ml85％的磷酸，混匀，现用现配)；

(6)几秒钟后，立即取出硅胶板并放置于90℃烘箱中10–15min，使斑点显色。

结果表明：纯化的野生酶jb13gh39和突变酶muty311p都能水解木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木六糖，水解产物主要为木糖(图3)。

实施例5纯化的野生酶jb13gh39和突变酶muty311p的ph活性测定

将底物pnpx溶于缓冲液中，使其终浓度为2mm；反应体系含50μl适量酶液，450μl的2mm底物；底物在37℃下预热5min后，加入酶液再反应10min，然后加2ml1mna2co3终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定释放出的pnp；分别在ph3.0–8.0的mcilvainebuffer中进行酶促反应。

结果野生酶jb13gh39的最适ph为4.5，在ph4.0时具有85％的酶活，当ph从5.5增长到7.0，酶活从69％降到12％；突变酶muty311p的最适ph为5.0，在ph4.0时具有42％的酶活，当ph从5.5增长到7.0，酶活从94％降到28％(图4)。以上结果表明：野生酶jb13gh39在较低的ph下比突变酶muty311p具有更高的活性，反之，突变酶muty311p在较高的ph下比野生酶jb13gh39具有更高的活性。

实施例6纯化的野生酶jb13gh39和突变酶muty311p的热活性测定

将底物pnpx溶于缓冲液中，使其终浓度为2mm；反应体系含50μl适量酶液，450μl的2mm底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液再反应10min，然后加2ml1mna2co3终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定释放出的pnp；在ph4.5的mcilvainebuffer中，于0–70℃下进行酶促反应。

结果野生酶jb13gh39的最适温度为50℃，在20℃和70℃下分别具有52.8％和9.9％的活性；突变酶muty311p的最适温度为55℃，在20℃和70℃下分别具有17.7％和41.5％的活性(图5)。以上结果表明：野生酶jb13gh39在较低的温度下比突变酶muty311p具有更高的活性，反之，突变酶muty311p在较高的温度下比野生酶jb13gh39具有更高的活性。

实施例7纯化的突变酶muty311p降解三七皂苷r1和r2的测定

1)降解三七皂苷r1和r2

反应体系400μl，含终浓度为4mm的三七皂苷r1或三七皂苷r2、纯化的突变酶muty311p(约10μg)；缓冲液为mcilvainebuffer，ph4.5；在30℃下反应24h。以同样条件下处理但未加酶液的样品为对照。

2)样品萃取

反应后的样品及对照用正丁醇萃取。向400μl样品中加入400μl正丁醇萃取，静置数分钟分层后吸取上层液体；再用400μl正丁醇萃取第二次，吸取上层液体；最后用200μl正丁醇萃取第三次，吸取上层液体。蒸发去除样品中的萃取剂。

3)高效液相检测

用甲醇溶解样品。仪器：安捷伦1100hplc；色谱柱：agilenthypersilods5um4.0×250mm；检测波长203nm。

三七皂苷r1和人参皂苷rg1分析：流速1.0ml/min，流动相为20％乙腈：80％水，等度洗脱。

三七皂苷r2和人参皂苷rh1分析：

流速1.5ml/min；

流动相条件：

omin，20％乙腈：80％水，

20min，20％乙腈：80％水，

45min，46％乙腈：54％水，

55min，55％乙腈：45％水，

60min，55％乙腈：45％水。

经检测，三七皂苷r1被突变酶muty311p全部降解，产物为人参皂苷rg1(图6)；约94％的三七皂苷r2被突变酶muty311p降解，产物为人参皂苷rh1(图7)。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>云南师范大学

<120>一种能将三七皂苷r1和r2分别转化为人参皂苷rg1和rh1的热适应性改良木糖苷酶

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>536

<212>prt

<213>突变酶(muty311p)

<400>1

metgluleualaleualathrleucysthralaproalaargalaile

151015

alaproalaasparggluilethrvalaspleualaargalaglyarg

202530

proleuaspargphetyrasnpheservalglyserasptyrprogly

354045

thrleuileargthraspserglnalaglnleulysthralavalasp

505560

gluleuglypheargtyrleuargphehisglyilephehisaspval

65707580

leuglnthrvalargleuvalaspglylysthrvaltyrasptrparg

859095

glyileaspargleutyraspaspleuleualaargargileargpro

100105110

phevalgluleuserphethrproaspalaleualathrserprogln

115120125

thrilephetyrtrplysglyasnthrserhisprolysproaspgly

130135140

trpargasnleuileaspalaphevalarghisleuglualaargtyr

145150155160

glyproalagluvalargargtrptyrphegluvaltrpasnglupro

165170175

asnleuserglyphetrpgluglyalaaspglnlysalatyrpheglu

180185190

leutyraspserthralaargthrilelysalaileaspproaspleu

195200205

glnvalglyglyproalathralaglyalaalatrpvalprogluphe

210215220

leuasptyralaalaalahishisthrprovalaspphevalthrthr

225230235240

hissertyrglyvalaspglyglypheleuaspgluasnglylysser

245250255

aspthrlysleuseralaaspproasnalaileileglyaspvallys

260265270

lysvalargalaglnileseralaserpropheproasnleuproleu

275280285

tyrphethrglutrpserthrserprothrproargaspalavalhis

290295300

aspsertyrileseralaprotyrileleuserargilelysalaval

305310315320

alaglygluvalglnglymetsertyrtrpthrtyrseraspleuphe

325330335

glugluproglyproprothralapropheglnglyglypheglyleu

340345350

leuasnprogluglyilearglysproalaphephealatyrlystyr

355360365

leuasnalaleuaspglyargvalileprothralaaspalaglnval

370375380

metalathrthraspglyserserthrgluvalleuleutrpasptrp

385390395400

glnglnprolysglnprovalserasnargprophetyrthrlysleu

405410415

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420425430

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435440445

asnaspalatyrseralatyrileaspmetglyleuprolysthrleu

450455460

aspalaalaglnleuthrargleuglnglnleuthrargaspleupro

465470475480

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485490495

glumetprometargserasnaspilevalleuvalthrleuserpro

500505510

metserseralaserilealaprolysgluarglyslysglyglnphe

515520525

leugluhishishishishishis

530535

<210>2

<211>1611

<212>dna

<213>突变酶基因(muty311p)

<400>2

atggaattggcccttgcaactctctgcacggctccggcgagggcgattgcgcccgctgac60

cgcgaaattacggtcgatctagcgcgggcgggcagaccgctcgaccgcttctataatttc120

tccgtcggctccgattatccgggcacgctgatccgcaccgattcgcaggcgcagctcaaa180

accgcagtcgacgaactgggtttccgttatctccgcttccacgggatcttccacgacgtg240

ctgcagacggtgcgcctggttgatggcaagacggtatatgactggcgaggcatcgaccgg300

ctctatgacgatctgctggcgcgccgcatccgtccctttgtcgagctcagcttcacgcct360

gatgcgctcgcgacctcgccccagacgatcttttactggaagggcaatacctctcatccg420

aagcccgatggctggcgcaacctgatcgacgcgttcgttcgacatctcgaggcgcgctac480

ggccccgccgaggtgcgacgctggtatttcgaggtttggaacgagcccaatctcagcggc540

ttttgggagggcgcggatcaaaaggcctatttcgaactatacgattccaccgcgcgaacc600

atcaaggcgatcgacccggatctacaggtcggcggtccggcgacggcgggagcagcttgg660

gtgcccgagtttctcgactatgccgcggcccatcatacgccggtcgatttcgtcaccacg720

cacagctacggcgtcgatggcggctttctcgacgagaacggcaaaagtgacaccaagctg780

tcggccgatcccaacgcgatcatcggcgatgtgaagaaggtaagggcgcagatcagcgcc840

tcgccatttccgaacctgccactctatttcaccgaatggagcaccagcccaacgccgcgc900

gatgccgtgcacgattcctatatcagcgcaccttacatcctgtcgcggatcaaggcggtg960

gcaggcgaggtccaaggcatgagctattggacctattcggatctgttcgaggagccgggg1020

ccgcccacagcgcctttccagggcggcttcgggctgctcaatcccgaaggtatcagaaag1080

ccggccttcttcgcctacaaatatctgaacgcgctcgacgggcgcgttatcccgaccgca1140

gatgcacaggtgatggcgaccaccgatggttcctccacggaggtgttgctgtgggactgg1200

cagcaaccgaaacagcccgtcagtaaccggccgttctacaccaagctggtgccatccacc1260

caagcatcgccggcgagagtcgcgttcgagcatctgtggcccggccgttaccgggtgcgt1320

gcctatcgcaccggctatcgccataacgacgcttattcggcctatatcgatatgggcctg1380

ccgaagacgctcgatgcggcgcaattgaccaggttgcagcaacttactcgcgacctgccg1440

gtcgtcgatcgcatggcgacgatcgacggcaccggccaattcgatatcgagatgccgatg1500

cgaagcaatgatatcgtgctcgtcacgctgtcgcccatgtcatcggcgtcaattgcaccc1560

aaggagcgaaagaagggccaattcctcgagcaccaccaccaccaccactga1611

<210>3

<211>538

<212>prt

<213>野生酶(jb13gh39)

<400>3

metalametglyargserilemetileargargmetalametcysval

151015

alaleualaalathrleucysthralaproalaargalailealapro

202530

alaasparggluilethrvalaspleualaargalaglyargproleu

354045

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aspargleutyraspaspleuleualaargargileargpropheval

115120125

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130135140

phetyrtrplysglyasnthrserhisprolysproaspglytrparg

145150155160

asnleuileaspalaphevalarghisleuglualaargtyrglypro

165170175

alagluvalargargtrptyrphegluvaltrpasngluproasnleu

180185190

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

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