一种人原肌球蛋白受体激酶A突变体及应用的制作方法

本发明属于基因工程药物领域，具体涉及原肌球蛋白受体激酶a突变体及其突变体在肿瘤治疗中的应用。

背景技术：

原肌球蛋白受体激酶a(tropomyosinreceptorkinasea，trka)，又被成为神经营养因子酪氨酸激酶受体1型(neurotrophictyrosinekinasereceptortype1，ntrk1)，是由ntrk1基因编码的140kda跨膜糖蛋白。trka是神经生长因子(ngf)的特异性高亲和力受体，介导ngf大多数生物功能，为其功能性受体。ngf结合trka受体可导致受体二聚化，激活内在激酶活性，从而引起多种信号通路的激活，包括ras/mapk，pi3k/akt和plcγ通路，介导神经、血管和肿瘤等多种病理生理功能。

研究表明，ngf-trka与肿瘤发生、增殖、血管生成以及转移相关。ngf及其trka表达于包括前列腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、食管癌和肺癌等在内的多种实体肿瘤。trka在恶性肿瘤中通过多种机制激活，主要是结构重排和表达的改变。首先，受体编码基因ntrk1重排和trka的激活被发现于多种肿瘤。ntrk1基因重排产生嵌合癌基因，导致酪氨酸激酶组成性激活。vaishnavi等在肺癌患者中发现了新的基因融合，其中含有编码高亲和力受体trka的ntrk1基因。基因融合导致了trka激酶活性的组成性激活，从而具有致癌作用。再次，ngf与trka的过度表达增加了癌细胞的迁移性，并且与肿瘤的淋巴结转移、远距离播散、高tnm分期、低分化、低存活率相关。其次，trka的异常不仅表现在结构和表达水平上，还表现在肿瘤细胞内信号通路的异常。trka受体的激活与pi3k/akt和丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，mapk)通路的激活有关，而这两条通路是强有力的存活信号，可同时阻断内源性和外源性凋亡信号通路。因此trka的激活极有可能通过激活mapk等通路刺激细胞增殖，从而促进肿瘤生长。由此可见，以trka受体为靶点，应用trka抑制剂阻断其信号通路已成为肿瘤治疗提供新方法。

针对trka受体，已着手开发的trka抑制剂有：最早进入临床试验的trk抑制剂cephalon的cep-751和cep-701。这些药物是吲哚咔唑类化合物k252a的衍生物，通过竞争trk受体胞内结构域的atp结合位点，抑制受体酪氨酸激酶活性，同时对flt3和蛋白激酶c(pkc)也有抑制作用。该类化合物具有抗肿瘤活性。astrazeneca的高效选择性小分子trka/b激酶抑制剂，细胞分析中对于trka的ec50约为2nm。az-23具有良好的水溶性、口服生物利用活性以及药物代谢动力学特性。az-23的激酶抑制特性与lestaurtinib以及其他吲哚咔唑类似物不同，例如没有检测到对血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，pdgf)及蛋白激酶c(proteinkinasec，pkc)的抑制作用，提示其临床活性及毒性也很可能不同。虽然az-23具有较高的选择性，但也不是绝对的trk受体特异性抑制剂。

2017年11月26日，fda批准larotrectinib(loxo-101，商品名vitrakvi)上市。体外研究：在先前的研究中，评价浓度为1000nm且atp浓度约为km的loxo-101对非trk激酶组的脱靶激酶抑制作用。结果表明，loxo-101仅对一种非trk激酶(tnk2)具有大于50％的抑制，ic50为576nm。体内研究：动物研究发现，loxo-101能够抑制体内肿瘤生长。用loxo-101每日口服治疗注射km12细胞的无胸腺裸鼠2周，观察到剂量依赖性的肿瘤抑制，表明loxo-101具有抑制体内肿瘤生长的能力。临床试验：2014年进行了晚期实体瘤患者的多中心i期剂量递增研究(clinicaltrials.gov编号：nct02122913)，以评价loxo-101的安全性和pk。患者每天一次或两次剂量递增连续给药28天。初步pk和安全性数据表明，loxo-101的游离血浆水平处于抑制trk致癌基因的生物学相关浓度。用loxo-101治疗观察到快速临床肿瘤消退。

尽管如此，现有的trka抑制剂不是绝对的trka受体特异性抑制剂，可能导致脱靶效应，易产生耐药性。而trka特异性抗体，通过抑制过表达的trka，从而阻止trka激酶活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖活化和迁移，达到抗肿瘤的效果，具有特异性强的特点。然而由于trka特异性抗体只能引起被动免疫反应，所以都存在着用药剂量大、副作用多等缺点。与被动免疫相比，能够引起机体产生主动免疫反应的疫苗类药物，在用药量、安全性以及病人依从性方面都具有较大优势。由于trka是自体蛋白，机体的自身免疫耐受现象成为trka疫苗制备的重要障碍，所以提高其免疫原性成为相关治疗性疫苗制备的关键技术。可以采用目前常用的添加佐剂的方法来提高免疫原性，但是难以有效地诱导特异性抗体的产生；又或者可以对trka进行改造，融合某些外源的t细胞抗原表位等来提高免疫原性，此方法虽能产生抗体，但是对外源片段要求高，且trka的改造位点局限，因此应用受限。

技术实现要素：

发明目的

本发明针对现有技术的缺陷，设计了一种人源性的原肌球蛋白受体激酶a突变体，用于抑制胃癌，前列腺癌，乳腺癌，胰腺癌，直肠癌，肺癌，甲状腺癌等肿瘤细胞的生长。

技术方案

本发明的技术方案是提供一种人原肌球蛋白受体激酶a突变体，所述的突变体是原肌球蛋白受体激酶a原型一个或几个位点的氨基酸突变，所述的氨基酸突变位点位于原肌球蛋白受体激酶a配体结合区域。所述的原肌球蛋白受体激酶a配体结合区域包括leu486，gly488，his489，ile490，phe521，lys544，glu560，leu564，val573，phe589，gly667，asp668，phe669，gly670。

所述的原肌球蛋白受体激酶a为人源性的，原肌球蛋白受体激酶a突变体的氨基酸序列为：

sglqghiienpqyfsdacvhhikrrdivlkwelgegafgkvflaechnkmlvvcaaalkearqdfqreaelltmlqhqhivrffgvctegrpllmvfeymrhgdlnrflrshgpdakllaggedvapgplglgqllavasqvaagmvylaglhfvagrdlatrnclvgqglvvkigvafgmsrdiystdyyrvggrtmlpirwmppesilyrkfttesdvwsfgvvlweiftygkqpwyqlsn

编码所述人原肌球蛋白受体激酶a突变体基因的核苷酸序列为：

tctggtttacaaggccatattatcgaaaatcctcagtatttttccgatgcttgtgttcaccatataaaacgtcgcgacattgtcttgaagtgggagcttggagaaggggccttcggtaaagtatttctcgcagagtgccacaacaagatgctagtggcggtttgtgctgccgcactgaaagaagcgcgacaagatttccagcgggaggctgaattattgactatgcttcaacatcagcacatcgtcagatttttcggcgtatgcaccgagggaaggcccctcctaatggtgtttgaatacatgcgtcatggggacctgaatcgcttcttacgatcacacggtccagatgccaagttgcttgcaggcggagaggacgttgcgccggggcctctcggtctaggccaactgttagctgtcgcctcgcaggtagcagcgggaatggtgtatttggctgggcttcattttgttgccggtcgggatctcgcaacaagaaactgtctagtcggccaaggactggtagtgaaaataggggttgcgttcggtatgagtagggacatttacagcacggattattaccgtgtcggcggacgcactatgttacccatccgatggatgccaccggaatctatattgtatcggaagtttaccacagagtccgacgtatggtcattcggggtggttctttgggaaatttttacgtacggtaaacagccttggtatcaactctcgaattaatag

本发明的人原肌球蛋白受体激酶a在抗肿瘤药物中的应用，用于治疗胃癌，前列腺癌，乳腺癌，胰腺癌，直肠癌，肺癌，甲状腺癌。

有益效果

经过pbr322-mntrk1质粒构建，将pbr322-mntrk1质粒转化到e.colidh5α感受态细胞，筛选出高表达原肌球蛋白受体激酶a突变体的菌体，通过蛋白的表达和纯化，得到纯度为98％的原肌球蛋白受体激酶a突变体。本发明的原肌球蛋白受体激酶a突变体的氨基酸序列为在原肌球蛋白受体激酶a的原型蛋白的序列中进行了有针对性的突变，该氨基酸序列为全新的序列，同时，编码该突变体的基因核全新的序列。

本发明的原肌球蛋白受体激酶a突变体用于治疗多种肿瘤，包括肺癌、甲状腺癌、胃癌、直肠癌、乳腺癌和子宫癌。试验结果显示，本发明的原肌球蛋白受体激酶a突变体在体外和体内均能诱导产生相应的抗体，抗体的体内效价为1：1000000。原肌球蛋白受体激酶a突变体相应的抗体具有抑制多种肿瘤细胞的作用，其主要作用于原肌球蛋白受体激酶a阳性的肿瘤细胞，按照抑瘤率的顺序，分别为mgc-803(trka阳性，胃癌)>lncap(trka阳性，前列腺癌)>mcf-7(trka阳性，乳腺癌)>miapaca(trka阳性，胰腺癌)>hct116(trka阳性，直肠癌)>a549(trka阳性，肺癌)>ftc-133(trka阳性，甲状腺癌)。

安全性评价结果显示，本发明的原肌球蛋白受体激酶a突变体对原肌球蛋白受体激酶a阳性的肿瘤细胞无细胞毒性，小鼠尾静脉注射的耐受性试验结果表明，本发明的突变体无毒性，推算出临床成人静脉注射的最大耐受日用量为4.17mg/kg。

附图说明

图1trka野生型氨基酸序列三极结构示意图

图2ntrk1突变型基因电泳图，1-4泳道为ntrk1突变型基因。

图3pbr322-mntrk1质粒图

具体实施方式

实施例1

pbr322-mntrk1质粒构建

(1)根据trka野生型氨基酸序列(图1)，通过软件分析，筛选出序列中的活性区域。突变该区域中的一个或多个氨基酸，突变后的原肌球蛋白受体激酶a突变体的氨基酸序列为seqidno：1。

(2)ntrk1突变型基因(mntrk1)的设计：根据原肌球蛋白受体激酶a突变体的氨基酸序列，将编码原肌球蛋白受体激酶a的野生型基因(ntrk1)定点突变，该基因的核苷酸序列为seqidno：2。

(3)所设计的ntrk1突变型基因由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所设计的基因在公司提供的质粒hf392上。根据基因序列设计引物，并用计算机软件oligo进行合理性评估。引物序列ⅰ：上游引物p-f(5′-tctggtttacaaggccatattatcga-3′)和下游引物p-r(5′-ctattaattcgagagttgataccaag-3′)。在5’端导入hindⅲ和ecori限制酶切位点。以质粒hf392为模板，扩增系统：10×pcr缓冲液，0.2mmol/ldntp，100ng模板dna，总体积100μl，扩增条件为93℃40秒，55℃30秒，72℃1分30秒，共35个循环。最后72℃延伸10分钟。得到的pcr产物经hindⅲ和ecori酶切后，进行凝胶电泳，回收胶，得到ntrk1突变型基因(图2)。

(3)pbr322-mntrk1质粒构建：将回收的mntrk1后，与用ecori酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的后pbr322质粒连接，得到pbr322-mntrk1质粒(图3)。

实施例2

原肌球蛋白受体激酶a突变体的高表达菌株筛选

(1)将pbr322-mntrk1质粒转化到e.colidh5α感受态细胞，接种于含氨苄西林的lb培养基中，37℃振荡过夜，次日将活化菌经1％的比例重新接种于新的培养液中，于37℃继续培养振荡，待其吸光度a值(曾称光密度od值)(600nm)达0.5～2时，加入iptg至终浓度为1mmol/l，继续培养5小时，留样鉴定，筛选高表达菌体。

(2)原肌球蛋白受体激酶a突变体的检测：离心收集高表达菌体，经超声破碎，离心收集沉淀。用含0.5％tritonx-100的50mmol/ltris-hcl(ph8.0)、1mmol/ledta溶液洗涤2～3次，10000r/min离心取沉淀。用间接elisa法检测沉淀物中原肌球蛋白受体激酶a突变体的蛋白浓度，第一抗体为抗trka的单克隆抗体(mcab)，第二抗体为酶标抗鼠iggmcab，得到原肌球蛋白受体激酶a突变体的蛋白浓度。再用考马斯亮蓝法测定总蛋白的浓度，计算出原肌球蛋白受体激酶a突变体的纯度。从而筛选出高表达原肌球蛋白受体激酶a突变体的菌体。

实施例3

原肌球蛋白受体激酶a突变体的表达和纯化

将获得的原肌球蛋白受体激酶a突变体培养液，离心取菌体沉淀，超声破碎，离心取上清，对上清液进行纯化。首先将上清液通过qsepharosefastflow在akta蛋白纯化仪的监控下，

使用含有浓度为0.2mnacl的ph8.0、20mm的tris-hcl缓冲液洗脱主蛋白。其次将含有主蛋白的洗脱液通过ni-nta进行纯化，分别采用50mm咪唑、500mm咪唑的ph8.0、20mm的tris-hcl缓冲液洗脱杂蛋白以及主蛋白。将所得蛋白纯化液进行间接elisa法和马斯亮蓝法测定，检测纯度达到98％。

实施例4

原肌球蛋白受体激酶a突变体体外活性检测

取新鲜人外周血5ml，按照说明书使用淋巴分离液离心分离，最终获得10⁶个/ml人淋巴单个核细胞。将分离获得的细胞液平均分装在六孔板中，培养箱培养4h后，分别加入羊抗人igm共刺激剂2μg/ml及实施例3得到的高纯度原肌球蛋白受体激酶a突变体20μg/ml，和原型的原肌球蛋白受体激酶a。培养箱培养96h分别取200μl细胞液，离心取上清进行elisa实验。结果显示(表1)，原型原肌球蛋白受体激酶a不产生抗体，而原肌球蛋白受体激酶a突变体刺激细胞产生抗体，蛋白原型组与突变体组相比，有统计学差异(p<0.01)。

表1细胞产生抗体od值

实施例5

实施例3得到的高纯度原肌球蛋白受体激酶a突变体诱导小鼠产生原肌球蛋白受体激酶a抗体的效价测定。

采用icr小鼠作为受试动物，取20只小鼠，雌雄各半，体重为18-22g，于试验第1，14和28天皮下多点注射含实施例3制备的突变体的弗氏佐剂(第1天用弗氏佐剂为完全弗氏佐剂和突变体以1:1比例混合；第14和28天用弗氏佐剂为不完全弗氏佐剂和突变体以1:1比例混合)。第42天，采用眼底静脉丛取血，进行elisa试验，测定本发明实施例1制备的突变体诱导小鼠产生原肌球蛋白受体激酶a抗体igg的效价。

效价测定步骤：(1)抗原包被：trka作为抗原，用包被液l：8000稀释，100μl/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中。4℃放置过夜，洗涤液洗3次；(2)封闭：加l00μl/孔封闭液(含1％牛血清白蛋白，0.1％tween20的pbs)，室温放置1h，用洗涤液洗3次；(3)将免疫小鼠血清按照倍比稀释成不同的稀释倍数，(4)将稀释倍数的小鼠血清及空白阴性对照品分别加入到反应板中，100μl/孔，37℃，反应2h，用洗涤液洗3次；(5)加酶标抗抗体：兔抗鼠igg-hrp，用封闭液l：8000稀释，100μl/孔，加盖37℃恒温箱温育1h，用洗涤液洗3次；(6)显色：tmb底物溶液100μl/孔，室温暗处放置10min；(7)终止反应：加50μl/孔终止液；(8)用酶标仪测定450nm处吸光值，当检测样品吸光度/阴性样品吸光度>2.5时，为阳性反应，以检测阳性反应的最大稀释度为小鼠血清抗体的效价。

结果显示实施例1制备的突变体诱导小鼠产生trka抗体的效价为1：1000000。

实施例6

实施例3得到的高纯度原肌球蛋白受体激酶a突变体抗体对细胞增殖的作用

(1)制备抗体的专业公司根据实施例3得到的高纯度原肌球蛋白受体激酶a突变体抗体制备特异性识别人的原肌球蛋白受体激酶a突变体的单克隆抗体。

(2)采用制备得到的原肌球蛋白受体激酶a突变体的单克隆抗体进行mtt细胞增殖试验，评价该抗体对trka阳性的细胞增殖作用。

试验细胞：mcf-7(trka阳性，乳腺癌)，miapaca(trka阳性，胰腺癌)，lncap(trka阳性，前列腺癌)，a549(trka阳性，肺癌)，ftc-133(trka阳性，甲状腺癌)，mgc-803(trka阳性，胃癌)，hct116(trka阳性，直肠癌)和u937(trka阴性，组织细胞淋巴瘤细胞)；

分组：1：抗体组(效价分别为：1：1000、1：10000、1：100000)；2：空白组。

步骤：

(1)分别收集对数期肿瘤细胞细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，5000个细胞/孔。

(2)5％co2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入不同效价的原肌球蛋白受体激酶a突变体的单克隆抗体，设5个复孔，同时设对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、mtt、二甲基亚砜)。

(3)5％co2，37℃孵育48小时，每孔加入20ulmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h。

(4)终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150uldmso，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od570nm处测量各孔的吸光值。计算肿瘤细胞增殖抑制率(％)＝(对照组吸光度值一实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100。

结果：表2显示本发明trka突变体制备的抗体对肿瘤细胞的抑制率，该抗体对trka阳性的肿瘤细胞均有效。另外，按照抑制率的顺序：mgc-803(trka阳性，胃癌)>lncap(trka阳性，前列腺癌)>mcf-7(trka阳性，乳腺癌)>miapaca(trka阳性，胰腺癌)>hct116(trka阳性，直肠癌)>a549(trka阳性，肺癌)>ftc-133(trka阳性，甲状腺癌)，可见该抗体对不同肿瘤的抑制率不同。

表2本发明trka突变体制备的抗体对肿瘤细胞的抑制率(％)

实施例7

实施例3得到的高纯度原肌球蛋白受体激酶a突变体的细胞毒性评价。

采用cck8法，测定本发明的实施例3得到的高纯度原肌球蛋白受体激酶a突变体分别对mcf-7(trka阳性，乳腺癌)，miapaca(trka阳性，胰腺癌)和lncap(trka阳性，前列腺癌)的细胞毒性。

步骤：

(1)将不同种类的细胞分别制成细胞混悬液，在96孔板中在加入100μl的细胞悬液，细胞浓度为5*10⁵个/孔。将培养板在培养箱预培养24小时(37℃，5％co2)。

(2)加药：分别向培养板加入培养基或原肌球蛋白受体激酶a突变体，设5个复孔，并将培养板在培养箱孵育48小时。

(3)cck8检测：

弃去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100ul培养基，向每孔加入10μlcck8溶液。其中预留的pbs孔加入cck8作为空白组(含血清+cck8，不含细胞)。将培养板在培养箱内孵育1-4h。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

(4)细胞活性计算：细胞活力(％)＝[od(加药)-od(空白)]/[od(0加药)-od(空白)]×100(od(加药)：具有细胞、cck8溶液和药物溶液的孔的吸光度；od(空白)：具有培养基和cck8溶液而没有细胞的孔的吸光度；od(0加药)：具有细胞、cck8溶液而没有药物的孔的吸光度细胞活力)。

结果显示，实施例3得到的高纯度原肌球蛋白受体激酶a突变体对三种trka阳性的细胞mcf-7，miapaca和lncap的细胞活力分别为106.8，106.8和95.5％(表3)，与培养基阴性相比，没有统计学差异(p＞0.05)，由此可见，实施例3得到的高纯度原肌球蛋白受体激酶a突变体本身不与trka阳性的细胞反应，无细胞毒性。

表3细胞毒性评价

实施例8

实施例3得到的高纯度原肌球蛋白受体激酶a突变体的急性毒性试验。

采用小鼠尾静脉注射的急性毒性试验评价本发明原肌球蛋白受体激酶a突变体的在体毒性。

方法：将icr小鼠40只，雌雄各半，体重为18-22g，随机分为对照组和实验组，每组20只，实验组采用最大浓度(10mg/ml)、最大容积(0.1ml)的原肌球蛋白受体激酶a突变体一次性小鼠尾静脉注射，对照组给予等量生理盐水，观察小鼠给药后2周内的行为、外观、进食、排泄物、主要脏器的大体和病理学改变以及死亡情况，并计算小鼠对纳米银的最大耐受量。

试验结果：原肌球蛋白受体激酶a突变体一次性小鼠尾静脉注射后，行为无异常，摄食量、体重等与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)，各主要脏器无明显异常改变，2周内无死亡。由此推算，临床成人静脉注射的最大耐受日用量为4.17mg/kg。

序列表

<110>周越

<120>一种人原肌球蛋白受体激酶a突变体及应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>243

<212>prt

<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

serglyleuglnglyhisileilegluasnproglntyrpheserasp

151015

alacysvalhishisilelysargargaspilevalleulystrpglu

202530

leuglygluglyalapheglylysvalpheleualaglucyshisasn

354045

lysmetleuvalvalcysalaalaalaleulysglualaargglnasp

505560

pheglnargglualagluleuleuthrmetleuglnhisglnhisile

65707580

valargphepheglyvalcysthrgluglyargproleuleumetval

859095

pheglutyrmetarghisglyaspleuasnargpheleuargserhis

100105110

glyproaspalalysleuleualaglyglygluaspvalalaprogly

115120125

proleuglyleuglyglnleuleualavalalaserglnvalalaala

130135140

glymetvaltyrleualaglyleuhisphevalalaglyargaspleu

145150155160

alathrargasncysleuvalglyglnglyleuvalvallysilegly

165170175

valalapheglymetserargaspiletyrserthrasptyrtyrarg

180185190

valglyglyargthrmetleuproileargtrpmetproprogluser

195200205

ileleutyrarglysphethrthrgluseraspvaltrpserphegly

210215220

valvalleutrpgluilephethrtyrglylysglnprotrptyrgln

225230235240

leuserasn

<210>2

<211>738

<212>dna

<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>2

tctggtttacaaggccatattatcgaaaatcctcagtatttttccgatgcttgtgttcac60

catataaaacgtcgcgacattgtcttgaagtgggagcttggagaaggggccttcggtaaa120

gtatttctcgcagagtgccacaacaagatgctagtggcggtttgtgctgccgcactgaaa180

gaagcgcgacaagatttccagcgggaggctgaattattgactatgcttcaacatcagcac240

atcgtcagatttttcggcgtatgcaccgagggaaggcccctcctaatggtgtttgaatac300

atgcgtcatggggacctgaatcgcttcttacgatcacacggtccagatgccaagttgctt360

gcaggcggagaggacgttgcgccggggcctctcggtctaggccaactgttagctgtcgcc420

tcgcaggtagcagcgggaatggtgtatttggctgggcttcattttgttgccggtcgggat480

ctcgcaacaagaaactgtctagtcggccaaggactggtagtgaaaataggggttgcgttc540

ggtatgagtagggacatttacagcacggattattaccgtgtcggcggacgcactatgtta600

cccatccgatggatgccaccggaatctatattgtatcggaagtttaccacagagtccgac660

gtatggtcattcggggtggttctttgggaaatttttacgtacggtaaacagccttggtat720

caactctcgaattaatag738