一种人源溶菌酶编码基因及其在毕赤酵母中表达的方法和应用与流程

本发明属于分子生物技术领域，具体而言，涉及一种人源溶菌酶及编码基因其在毕赤酵母gs115中的大量表达和应用。

背景技术：

溶菌酶是一种分子量为14.4kda的抗菌酶，在杀菌方面效果显著。溶菌酶通过破坏细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，瓦解细菌(主要为革兰氏阳性菌)的细胞壁结构，促使细胞破裂，从而导致细菌死亡。由于其杀菌效果良好，主要应用于医疗、食品、饲料和科学研究中。根据分子结构、来源和分子量的不同，溶菌酶可以分为6类：植物溶菌酶、微生物溶菌酶、噬菌体溶菌酶以及3种动物类型的溶菌酶(c型、g型和i型)，其中动物溶菌酶和噬菌体溶菌酶最常见，而研究最多的鸡溶菌酶和人源溶菌酶属于动物溶菌酶的c型溶菌酶。有文献报道，虽然鸡溶菌酶是目前使用最广的一种溶菌酶，但人源溶菌酶的活性和热稳定性均强于鸡溶菌酶。然而，已有的人源溶菌酶在多种表达宿主中进行异源表达时，普遍存在表达量比较低的情况，使其在工业化推广应用方面存在问题。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明的第一个目的在于通过优化人源溶菌酶编码基因序列，从而提供一种人源溶菌酶及其编码基因和重组载体、转化体以及遗传工程化的宿主细胞。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：

一种人源溶菌酶的编码基因，该编码基因具有seqidno.2所示的核苷酸序列。需要说明的是，本发明涉及的人源溶菌酶，其具有seqidno.1所示的氨基酸序列。

一种重组载体，包括上述的人源溶菌酶的编码基因。进一步优选地，所述重组载体是在phbm905m载体的cpoi和noti位点插入所述人源溶菌酶的编码基因,再通过生物砖技术将整个人源溶菌酶的表达框重复构建获得6-12或6-8拷贝。

本发明还提供两种转化体，转化体可以为重组菌，包含上述重组载体。例如，将人源溶菌酶编码基因插入载体phbm905m的cpoi和noti位点得到的重组表达载体，及含有基因多拷贝表达框的重组表达载体转化至毕赤酵母gs115得到重组菌。另外一种转化体为以人源溶菌酶6拷贝gs115重组菌，再次转入辅助因子(ero1、pdi1)进行共表达的一种新型重组菌。

本发明还提供多对引物，用于扩增上述的人源溶菌酶编码基因全长及共表达所需的各种辅助因子。

一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有上述的重组载体。进一步优选地，所述遗传工程化的宿主细胞还包含插入辅助因子ero1或/和pdi1基因序列的重组载体。所述重组载体为载体pgapzb的ecori和agei位点插入目标基因得到的重组表达载体。

人源溶菌酶属于真核基因，研究发现其存在翻译后修饰。而本发明人选用的毕赤酵母gs115存在真核基因具有的翻译后修饰特点，且能够进行分泌表达和高密度发酵，满足工业化应用的条件。因此，我们选择毕赤酵母gs115作为出发菌株进行人源溶菌酶的表达。

最后，本发明还提供了上述的人源溶菌酶在制备杀菌剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下几点的进步性：

(1)利用体外构建无抗生素筛选标记的多拷贝的方法，实现了人溶菌酶的高量表达，且拷贝数与表达量并不是成正比；

(2)不同辅助因子的共表达，实现了人溶菌酶表达量的进一步提高，其中ero1促进作用最强；

(3)人溶菌酶表达量和活性均为目前报道最高。

附图说明

图1为人源溶菌酶多拷贝构建验证dna电泳图，其中泳道1/2/3/4/5/6分别为人溶菌酶1拷贝、2拷贝、3拷贝、4拷贝、6拷贝、12拷贝质粒。

图2为人源溶菌酶多拷贝构建质粒酶切验证dna电泳图，其中泳道1/2/3/4/5/6分别为用xbai和bamhi双酶切1拷贝、2拷贝、3拷贝、4拷贝、6拷贝、12拷贝。

图3为人源溶菌酶6拷贝和12拷贝菌株表达的sds-page检测图，其中泳道1和2分别为12拷贝和6拷贝。

图4为辅助因子和人源溶菌酶共表达sds-page检测图，其中泳道1/2/3/4分别为人溶菌酶6拷贝菌株、辅助因子bip共表达菌株、辅助因子ero1共表达菌株、辅助因子pdi1共表达菌株。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、人源溶菌酶基因序列密码子优化

将来源于人源溶菌酶基因的序列进行一定程度的密码子优化：a、减少连续的a/t/g/c碱基出现几率，避免产生茎环结构；b、在整个基因序列中，增加一些稀有密码子，特别是翻译起始阶段，来降低核糖体的延伸速率。优化后的人源溶菌酶基因序列如seqidno.2所示，整个序列和原始序列相比优化率达23.2％。

实施例2、表达载体的构建及蛋白质表达

1、基因序列的人工合成

seqidno.2所示的核苷酸序列委托上海生物工程有限公司按照本领域的常规技术进行基因人工合成，基因插入质粒载体puc57中，保存，备用。

2、基因序列的扩增

根据seqidno.2所示的核苷酸序列设计引物对(hlyz-f、hlyz-r)

正向引物的下划线部分为cpoi的酶切位点，反向引物的下划线部分为noti酶切位点，此位点的序列设计符合t4dna聚合酶作削的方法所产生的粘性末端。

pcr反应体系：

pcr反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30轮循环扩增，最后72℃延伸10min。

用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，并用dna纯化试剂盒(genemark公司生产)纯化。

3、重组表达载体的构建

1)将上述纯化的pcr产物用t4dna聚合酶作削的方法处理，然后进行溶液回收产物。

2)将质粒phbm905m用cpoi和noti双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

3)将步骤1)的溶液回收产物和步骤2)的酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌gold后涂布于含有100μg/ml氨苄抗生素的lb平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用引物hlyz-f和hlyz-r进行菌落pcr，筛选到含有人源溶菌酶基因的重组菌，抽提重组菌的质粒并进行测序验证。结果表明，在phbm905m的cpoi和noti酶切位点之间插入了人源溶菌酶的dna片段，该片段包括seqidno.2的自5′端起第4至393位的核苷酸，插入方向正确。将该重组质粒命名为phbm905m-hlyz。

4、人源溶菌酶多拷贝质粒的构建

重组载体phbm905m-hlyz表达框的5’端含有xbai酶切位点，3’端含有spei和bamhi酶切位点。因xbai和spei为同尾酶，故利用xbai/bamhi两种酶双酶切得到表达框，spei/bamhi两种酶双酶切得到线性化的载体，再把酶切回收得到的片段和载体通过t4dna连接酶连接就可以得到我们所需的人源溶菌酶2拷贝质粒，命名为phbm905m-hlyz-2c。如此类推，通过这3种酶酶切酶连的方法，我们可以得到3拷贝，4拷贝，6拷贝以及更高的12拷贝质粒，分别命名为phbm905m-hlzy-3c，phbm905m-hlzy-4c，phbm905m-hlyz-6c，phbm905m-hlyz-12c。

如图1所示，构建成功的多拷贝质粒，其分子量大小会呈现一个梯度变化，随着拷贝数增加，分子量也会增强。因多拷贝表达框两端均有xbai和bamhi酶切位点，故用这两个酶去切割多拷贝质粒，构建正确的多拷贝质粒切割下来的表达框条带会根据表达框的大小呈倍数关系，如2拷贝质粒会是1拷贝的2倍大小，6拷贝是1拷贝的6倍大小。无论多少拷贝，酶切后总有一个骨架dna大小不变，如图2所示。

5、工程菌的制备

将质粒phbm905m-hlyz的1c、2c、3c、4c、6c、12c分别用sali线性化酶切后，溶液回收酶切产物。然后在1.5kv的条件下电转化gs115感受态后涂布组氨酸缺陷型md平板，28℃培养2天。再将md平板上的菌转接到ypd平板上，做好标记。然后进行一次酵母菌落pcr，缩小筛选范围，将筛选到的菌取适量进行摇瓶甲醇诱导表达。

取适量的单菌落接种于50mlbmgy培养基中培养36h左右，使其od600接近15左右，再将bmgy培养基通过低温离心换成25mlbmmy培养基，并每隔24h加入250μl甲醇进行诱导表达，使其终浓度为1％。每隔24h取样并加入等量的甲醇，所取培养液于10000rpm、4℃条件下离心5min左右收集上清，于4℃冰箱中储存。

在人溶菌酶表达的实验中，人溶菌酶1拷贝、2拷贝、3拷贝、4拷贝无法得到有效表达，得不到人溶菌酶1拷贝，2拷贝，3拷贝，4拷贝的表达菌株。而只有当人溶菌酶构建到6拷贝时，才能看到人溶菌酶目的条带。另外，为了研究人溶菌酶表达框更多时是否能够进一步提高人溶菌酶表达量，我们构建12拷贝质粒去表达人溶菌酶。然而如图3所示，人溶菌酶6拷贝的表达量要高于12拷贝的表达量，因此人溶菌酶的表达量并不会随着表达框的增加而增加，且6拷贝的蛋白质浓度能够达到0.19mg/ml,针对溶壁微球菌的活性达到了11500u/ml，而12拷贝的蛋白质浓度为0.16mg/ml,针对溶壁微球菌的活性仅为10500u/ml。

实施例3、辅助因子基因及相关载体的构建

1、辅助因子基因扩增

通过网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，查找毕赤酵母gs115来源的bip、ero1和pdi1基因序列并设计引物进行基因扩增(引物列表)，这些基因分别构建在pgapzb载体的ecori和agei酶切位点之间。正向引物的下划线部分为ecori的酶切位点及其在载体左端的同源序列，反向引物的下划线部分为agei酶切位点及其在载体的右端同源序列，此位点的序列设计符合t5外切核酸酶构建载体的方法。

pcr反应体系：

pcr反应条件：98℃预变性6min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸(1kb/30s)，30个循环，最后72℃延伸10min。

用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，并用dna纯化试剂盒(genemark公司生产)纯化。

2、重组表达载体的构建

1)将质粒pgapzb用ecori和agei双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

2)将回收纯化的dna片段(bip、ero1和pdi1)和步骤1)的酶切产物用t5外切酶的方法(xiayongzhenetal.nucleicacidsresearch,2018)进行转化大肠杆菌gold后，涂布于含有25μg/mlzeocin的低盐lb平板，37℃过夜培养，将得到的转化子分别用上述的正向引物和反向引物进行菌落pcr，筛选到含有辅助因子基因的重组菌，提取重组菌的质粒，进行测序验证。结果表明，在pgapzb载体的ecori和agei酶切位点之间分别插入了bip、ero1和pdi1辅助因子片段，插入方向正确，将重组质粒分别命名为pgapzb-bip、pgapzb-ero1、pgapzb-pdi1。

实施例4、辅助因子和人源溶菌酶共表达重组菌株

将质粒pgapzb-bip、pgapzb-ero1、pgapzb-pdi1分别用avrii线性化酶切后，溶液回收酶切产物。然后在1.5kv的条件下电转化人源溶菌酶6拷贝基因的gs115感受态后，涂布含有100μg/mlzeocin的ypd平板，28℃培养2天。再将ypd(zeocin)平板上的菌转接到ypd平板上，并做好标记。然后进行一次酵母菌落pcr，缩小筛选范围。将筛选到的菌取适量进行摇瓶甲醇诱导表达。后续人源溶菌酶的表达步骤按照实施例2中的第5点进行甲醇诱导表达。

结果如图4显示：1为人溶菌酶6拷贝对照，2/3/4分别为在人溶菌酶6拷贝菌株的基础上，过表达bip、ero1和pdi1时人溶菌酶的表达情况。在过表达的三个辅助因子中，bip的过表达无法有效促进人溶菌酶的表达，而pdi1和ero1的过表达有明显的促进作用，且ero1的促进效果最好。过表达ero1的人溶菌酶6拷贝菌株，蛋白质浓度达到了0.25mg/ml,针对溶壁微球菌的活性达到了15120u/ml，相对于6拷贝溶菌酶表达对照菌株，表达量提高了近31％，活性也提高了近31％。

最后应说明的是，以上所述仅为本发明的部分实施例而已，并不用于限制本发明。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，单对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖北大学

<120>一种人源溶菌酶编码基因及其在毕赤酵母中表达的方法和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>131

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metlysvalphegluargcysgluleualaargthrleulysargleu

151015

glymetaspglytyrargglyileserleualaasntrpmetcysleu

202530

alalystrpgluserglytyrasnthrargalathrasntyrasnala

354045

glyaspargserthrasptyrglyilepheglnileasnserargtyr

505560

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65707580

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859095

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100105110

trpargasnargcysglnasnargaspvalargglntyrvalglngly

115120125

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130

<210>2

<211>396

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgaaagtattcgagagatgtgagcttgctagaacacttaagaggcttggcatggacgga60

taccgtggcatcagtctagctaactggatgtgccttgccaagtgggagtccggatataac120

acaagagccacaaattacaatgctggtgatcgttccactgactacggtatctttcagata180

aacagtagatattggtgcaatgatggaaagactccaggagctgtaaacgcctgtcacctg240

tcttgttctgccctattgcaagataacatagctgatgcagtagcttgcgctaagagggta300

gttcgtgatcctcaaggtataagggcatgggtggcttggagaaataggtgccagaaccgt360

gatgtacgtcagtacgttcagggatgtggtgtttaa396