蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶PpAmy1蛋白及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在蝶蛹金小蜂消化道中表达的消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白及其编码的核酸序列和应用。

背景技术：

淀粉酶是将淀粉或糖原分子水解成各种产物的酶，包括糊精和由葡萄糖单元组成的小分子聚合物，淀粉酶广泛分布在细菌、真菌、植物、动物中。这些分子分为三种类型：α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。α-淀粉酶是一类水解酶，它特异性地切割α-1，4-糖苷键，并将淀粉和糖原等糖聚合物水解成低聚糖，α-淀粉酶家族是糖苷水解酶、转移酶和异构酶的最大家族，包含30种不同的酶。基于α-淀粉酶的水解特性，α-淀粉酶在食品工业、酿造工业、发酵工业、纺织工业和医药工业中得到广泛应用。

迄今为止，在昆虫中只发现了α-淀粉酶。对许多以小麦粉为食的昆虫的研究表明，淀粉酶的作用对昆虫的生存有重要意义。害虫一直严重对全球农作物的安全生产造成严重的影响，每年都造成全球粮食产量约1/4的减产，经济损失巨大。在我国，2014年全国病虫害发生面积年约55亿亩/次，尽管每年通过防治病虫害可挽回粮食损失约占总产的15％～20％，但每年粮食损失仍然在300亿～500亿斤，可见害虫对农作物的产量和品质有很大的影响。害虫的防治一直主要依赖化学农药，随后又出现了抗药性、农药中毒、农药残留超标、污染严重等问题。人们一直探索寻找新的有效、安全、低毒的害虫防治方法，生物防治和转基因技术的出现，又提供了新思路去解决害虫造成的各种问题。植食性昆虫取食植物，而植物产生的抑制性分子可以防御昆虫，因而昆虫淀粉酶研究最吸引人的方面之一是昆虫与针对它们的植物防御的关系，即淀粉酶抑制剂。目前有研究致力于植物提取物的敏感性或抗性，主要是蛋白质抑制剂，尤其是谷物和豆科植物，目的是使转基因植物对靶标害虫具有抗性。

昆虫在幼虫和/或成虫阶段以根、植物汁液、叶子和种子为食，碳水化合物和蛋白质是幼虫生长和维持成虫寿命的必要营养物，存在于肠道的α-淀粉酶在碳水化合物代谢中起着重要作用，因而，α-淀粉酶是一种影响自身代谢和寿命的重要水解酶。对昆虫α-淀粉酶的研究不仅有助于昆虫的比较研究，了解不同昆虫淀粉酶的特性和作用，才能有效的进行生物防治，并应用到转基因抗虫技术中。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白基因ppamy1及其编码的蛋白质和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶蛋白ppamy1，其具有seqidno：2所示的氨基酸序列。

备注说明：seqidno：2包含了信号肽(mrvialvlaiaigvleadgh)。

作为本发明的蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白的改进：该蛋白、其保守性变异蛋白、其活性片段或其活性衍生物。

本发明还同时提供了编码上述蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白的基因，其核苷酸序列为seqidno：1所述；或者与seqidno：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40～55℃条件下与seqidno：1中的核苷酸序列杂交。

作为本发明的基因的改进：序列中包含seqidno：1中8～66个连续核苷酸。

本发明还同时提供了上述蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白的用途：用于制备蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白，该蛋白能用于蝶蛹金小蜂消化道淀粉或糖原水解代谢，从而影响蝶蛹金小蜂的寿命。即，该蛋白能水解寄生蜂在取食过程中获取的淀粉或糖原等大分子糖类，从而影响寄生蜂的寿命。

本发明所提供的蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白及其编码的核酸序列，使其能够应用其氨基酸序列、编码序列及其在开发成有应用价值的抗虫作物和生物农药并应用于农业害虫防治等多个领域。

本发明具体是通过以下技术方案实现的：本发明利用蝶蛹金小蜂基因组和转录组获得了消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白基因全部序列，对提取的蝶蛹金小蜂的rna进行反转录得到cdna，进行分子克隆、真核表达和非变性条件下纯化，获取真核表达的egfp-ppamy1(gfp和ppamy1融合表达)蛋白(氨基酸序列如seqidno：2所示)。使用rnai技术对ppamy1蛋白基因进行干扰(对照组为注射sigfp)，使ppamy1表达量下降，再饲喂淀粉后，寿命明显比对照组变短。

本发明所分离出的dna分子包括：编码具有蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与seqidno：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40～55℃条件下与seqidno：1中的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有seqidno：2所示的氨基酸序列的蛋白。更佳地，所述的序列具有seqidno：1中的核苷酸序列。

本发明分离出的蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白包括：具有seqidno：2氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异蛋白、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该蛋白是具有seqidno：2序列的蛋白。

本发明dna分子包含所述的dna分子中8-66个连续核苷酸。

本发明dna分子转化的宿主细胞是昆虫细胞。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”dna是指，该dna或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该dna片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白核酸序列指：编码具有蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白活性的核苷酸序列，如seqidno：1中的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，seqidno：1序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密码子的简并性，所以与seqidno：1中的核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出seqidno：1所述的序列。

还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与seqidno：1中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与seqidno：1中的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白相同功能的蛋白的seqidno：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白指：具有蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白酶活性的seqidno：2序列的蛋白。该术语还包括具有与蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白相同功能的seqidno：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在c末端和/或n端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地以5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白活性片段和活性衍生物。

在本发明中蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白保守性变异蛋白指：与seqidno：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白。

本发明还包括蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白或蛋白的类似物。这些类似物与天然淀粉酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然l－氨基酸的残基(如d氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ－氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述列举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白时，可以将蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白表达载体。

如本发明所述的“可操作地连于”指这样一种情况，即线性dna序列的某些部分能够影响同一线性dna序列其他部分的活性。例如，如果信号肽dna作为前体表达并参与蛋白的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)dna就是可操作地连于蛋白dna；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能够翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中宿主细胞为真核细胞。常见的真核宿主细胞指的是昆虫细胞系。

还可用northern印迹法技术或荧光定量pcr分析蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1基因产物的表达，即蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白的rna转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白核苷酸编码序列的8-66个连续氨基酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是pcr扩增后的产物，其中pcr扩增引物对应于蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白同源基因或同源蛋白。

本发明的蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得到有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。利用本发明的蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白发生相互作用的物质，或者受体等。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。本发明在调控蝶蛹金小蜂的寿命上具有明显作用，蝶蛹金小蜂寿命的延长对防治十字花科重要害虫菜粉蝶有重要的作用。我国农业害虫危害非常严重，使用化学农药的负面影响很大，本发明的蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白正是对农业害虫的生物防治上具有很大的应用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明的ppamy1真核表达纯化图；

注：m为标准蛋白，1道为sf9细胞系中纯化后的融合蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白使用抗体为α-淀粉酶抗体。2道为sf9细胞系中纯化后的egfp蛋白，3道为sf9细胞系中纯化后的融合蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白，使用抗体为6*histag抗体。

图2为本发明蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白基因干扰后，饲喂淀粉后生存曲线图。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、重组的pfastbachtb-ppamy1的表达和纯化

1.1、rna的提取

在leicamz16a显微镜(leica,germany)下，将雌蜂用75％酒精消毒并擦拭干净，将其消化道从腹部扯出，浸泡在载玻片上无菌的含1unit/μlrna酶抑制剂(toyobo,osaka,japan)的磷酸盐缓冲液(pbs)液滴中，收集消化道于trizol试剂中(invitrogen,california,usa)，rna提取方法如下：

1)收集的毒腺，加入1mltrizol，混匀，室温静置5min。

2)向离心管中加入0.2ml氯仿，振荡15s，混合液转入tiangen离心管中，静置3min。

3)4℃，12000g离心15min，取上清液，将其转入一新1.5ml的离心管中。

4)向离心管中加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

5)4℃，12000g离心10min，弃掉上清液。

6)向离心管中加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min，弃掉上清液。(此时加入无水乙醇，可于-80℃超低温冰箱中长期保存)。

7)晾干离心管，加入适量的无rna酶水溶解(65℃促溶)，分光光度计测量od260/od280的值，比值在1.8～2.0之间时，进行下一步实验。

1.2、cdna第一链合成

采用transscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix(transgen,beijing,china)试剂盒将1μgrna反转录成单链cdna模板，体系如下：

总rna：1μg

寡聚胸腺嘧啶核苷引物(oligo(dt)n)：0.5μl

随机引物：0.5μl

2×tsreactionmix：10μl

transscriptrt/rienzymemix:1μl

gdnaremover:1μl

rnase-freewater:to20μl

配好体系之后，25℃孵育10分钟后，在42℃孵育1h，最后85℃加热5分钟。

所得的cdna的核苷酸序列为seqidno：1所述。

1.3、重组蛋白的表达和纯化

真核表达通过杆状病毒系统进行，通过premierprimer5设计真核表达引物(前引物5’-3’：tttcagggcgccatgggatccaaggtgacgaattatagagaggata；后引物5’-3’：ctagtacttctcgacaagcttctacgatgctttcgcacctccgtaa。以上述合成cdna作为模板，pcr体系如下：

cdna：1μl

forwardprimer(10μm)：2μl

reverseprimer(10μm)：2μl

2×transstartfastpfupcrsupermix：25μl

ddh2o：20μl

totalvolume：50μl；

pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次；72℃延伸10min。

配制1％琼脂糖凝胶，pcr产物经电泳验证片段大小后，用axygengelextractionkit凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

通过clonexpressonestepcloningkit(vazyme,china)将pcr扩增获得的目的片段与线性化pfastbachtb质粒(酶切位点：bamhi和hindiii)进行同源重组，同源重组体系为：

5×ceiibuffer：4μl

线性化克隆载体(pfastbachtb质粒载体)：1μl

插入片段扩增产物：2μl

exnasetmii：2μl

反应条件为：37℃反应30分钟，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却15分钟，直接进行转化或者存储于-20℃待用；作为重组的pfastbachtb质粒。

真核表达过程：将重组的pfastbachtb质粒转化进trans5αchemicallycompetentcell(transgen,beijing,china)并通过菌落pcr和dna测序确定阳性菌落，测序由上海铂尚生物技术有限公司完成。将阳性克隆转化进dh10bactme.colicells(invitrogen,california,usa)并通过菌落pcr验证重组的pfastbachtb。对照组为未重组ppamy1的pfastbachtegfpt质粒。抽提重组的pfastbachtb和未重组的egfp质粒，使用转染试剂iireagent(invitrogen,california,usa)感染sf9细胞。收集3代病毒感染的300mlsf9细胞(2×10⁶cells/ml)，通过i-per^tminsectcellproteinextractionreagent(thermoscientific,wilmington,de,usa)进行细胞裂解，12,000×g离心20分钟，收集裂解液的上清。裂解液上清通过completehis-tagpurificationresin(roche,indianapolis,in,usa)和ni-ntabufferkit(novagen,ma,usa)进行蛋白的纯化。纯化后的蛋白进行westernblot的分析。最后，4℃条件下，使用float-a-lyzer○rg2dialysisdevice(spectrumlaboratories,usa)在pbs缓冲液(ph＝7.4)中对纯化后的可溶蛋白进行3次透析。蛋白浓度采用bsa法测定。

所得的蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白，其氨基酸序列为seqidno：2所示。

western-blot中，蛋白样品经12％sds-page后，通过mini-proteantetraelectrophoresissystem(bio-rad,hercules,ca,usa)湿转至硝酸纤维膜(sigma,st.louis,mo,usa)。一抗分别使用了两种，一种是6*histag标签抗体(图1,2道和3道)，用于确定真核表达的蛋白产物验证，另一种为α-淀粉酶抗体(图1，1道)用于确认真核表达的ppamy1为α-淀粉酶，使用时均稀释2000倍，二抗采用2000倍稀释的羊抗兔igg(h+l)(huaanbiotechnology,hangzhou,china)。最后通过tmbstabilizedsubstrateforhrp(promega,madison,wi,usa)进行显色，gs-800^tmcalibrateddensitometer进行扫描拍照。

所得结果如图1所述，由图1可知，纯化的目的蛋白ppamy1条带单一，片段大小正确，并且能被其抗体特异性识别，可以用于后续的功能研究。

实施例2

1.1以蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白基因和gfp蛋白基因的核苷酸序列为模板，在广州锐博生物公司设计sirna，分别名为sippamy1和sigfp。

1.2选80头黄蛹期蝶蛹金小蜂，平均分成两组，分别注射sippamy1和sigfp，注射体积为50nl，浓度为2000ng/μl，在黄蛹期注射一次。等待羽化成蜂。

1.3蝶蛹金小蜂羽化后，选取60头蜂，分处理组和对照组各30头蜂，分别饲喂1％淀粉溶液(每天更换，保证足够的总量)，并统计每天死亡的个数，直至全部死亡。

结果如图2所示，sippamy1组寿命比sigfp组短，且差异显著。因此，可得知本发明的蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白能帮助代谢淀粉或糖原，从而影响蝶蛹金小蜂的寿命。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>蝶蛹金小蜂消化道α-淀粉酶ppamy1蛋白及应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1491

<212>dna

<213>蝶蛹金小蜂(pteromaluspuparum)

<400>1

atgagggtgatcgcgctggtgcttgcgatcgcgatcggtgttttggaggcggatggacat60

aaggtgacgaattatagagaggataggaccacgatggttcatcttttcgagtggaagtgg120

aacgatatagccaaggagtgtgaggactttttggcgccgaggggctacgctggtgttcag180

gtctccccgatccaagagaacgtggtgatcggcaagcgtccctggtacgaacgttaccaa240

ccgatttcctacgaatggacgacccgttccggtaccgagaaagaatttagatcgatggta300

aagcgctgcaacaaagtcggtgttcgcatctacgtggacattctgttaaatcacatgagc360

ggaaaccacgagaacgcgaaaggtactggtggctccaaagctaacaccttcaaattgcac420

tatcctgccgtgccctataaccagaccaatttccataaaatctgtggtataaataactac480

caagatgccaacaacgtcagaaactgcgagctggtgggtttgcacgatctggaccagagt540

caggagtacgtgagggaaatgatcgtaacgatgatgaacaaggctgtcgatgccggtgtt600

gccggtttccgcgtcgatgcagccaagcacatgtggccgaaggaccttaaaaacatctac660

tctcgagtcaagaacgtgagcgtcgaacagggcttaccaaacaacagtcgtcccttcatc720

ttccaagaggtgatagactacggcggtgaagccatctccaagtacgagtacaatgaattt780

gcagccgtgaccgaattcaaatacggatcagaactcagcaacgcctttttgggcagaaac840

caactcaagtggctggccaactggggagaagcctggggtctactgcccaggagtgacgct900

cttgtcttcatcgacaatcacgatactcagaggagcaatggtgacactccaatcacgtac960

aagaattccaagctctacaagatggctgtggcgtttatgctggcccatccctatggcatc1020

cctcgggtgatgagttcgttcgacttcagcgactttgagaaaggtccacccgccgacagc1080

aaaggcaacattatatctccgaagataaacgaggacaacacatgtggtaatggctggata1140

tgcgagcaccgatggagacagatctacaacatggttagcttccggaactacgtgcgcgac1200

gagccgaaagttagtttctggtgggacaacggaaactatcagatttccttctgcagaggc1260

aagaaaggctttatcgctatcaacgccgacaaggtagatctgaagcagaagctgacagtc1320

tgtttgccagctggagtctactgtgatattatctcgggagagcttggaaaggacggaaag1380

tgcactggaaaatctgtcatcgttgacaggaagggacaggctgacgtggtgattggcgtc1440

ggtgaggaggacggtgttcttgctatttacggaggtgcgaaagcatcgtag1491

<210>2

<211>496

<212>prt

<213>蝶蛹金小蜂(pteromaluspuparum)

<400>2

metargvalilealaleuvalleualailealaileglyvalleuglu

151015

alaaspglyhislysvalthrasntyrarggluaspargthrthrmet

202530

valhisleupheglutrplystrpasnaspilealalysglucysglu

354045

asppheleualaproargglytyralaglyvalglnvalserproile

505560

glngluasnvalvalileglylysargprotrptyrgluargtyrgln

65707580

proilesertyrglutrpthrthrargserglythrglulysgluphe

859095

argsermetvallysargcysasnlysvalglyvalargiletyrval

100105110

aspileleuleuasnhismetserglyasnhisgluasnalalysgly

115120125

thrglyglyserlysalaasnthrphelysleuhistyrproalaval

130135140

protyrasnglnthrasnphehislysilecysglyileasnasntyr

145150155160

glnaspalaasnasnvalargasncysgluleuvalglyleuhisasp

165170175

leuaspglnserglnglutyrvalargglumetilevalthrmetmet

180185190

asnlysalavalaspalaglyvalalaglypheargvalaspalaala

195200205

lyshismettrpprolysaspleulysasniletyrserargvallys

210215220

asnvalservalgluglnglyleuproasnasnserargpropheile

225230235240

pheglngluvalileasptyrglyglyglualaileserlystyrglu

245250255

tyrasngluphealaalavalthrgluphelystyrglysergluleu

260265270

serasnalapheleuglyargasnglnleulystrpleualaasntrp

275280285

glyglualatrpglyleuleuproargseraspalaleuvalpheile

290295300

aspasnhisaspthrglnargserasnglyaspthrproilethrtyr

305310315320

lysasnserlysleutyrlysmetalavalalaphemetleualahis

325330335

protyrglyileproargvalmetserserpheasppheseraspphe

340345350

glulysglyproproalaaspserlysglyasnileileserprolys

355360365

ileasngluaspasnthrcysglyasnglytrpilecysgluhisarg

370375380

trpargglniletyrasnmetvalserpheargasntyrvalargasp

385390395400

gluprolysvalserphetrptrpaspasnglyasntyrglnileser

405410415

phecysargglylyslysglypheilealaileasnalaasplysval

420425430

aspleulysglnlysleuthrvalcysleuproalaglyvaltyrcys

435440445

aspileileserglygluleuglylysaspglylyscysthrglylys

450455460

servalilevalasparglysglyglnalaaspvalvalileglyval

465470475480

glyglugluaspglyvalleualailetyrglyglyalalysalaser

485490495