来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶的制作方法

本发明涉及一种溶菌酶，特别涉及一种来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶。

背景技术：

溶菌酶作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌消肿止痛及加快组织恢复功能等作用，也可与抗菌药物合用治疗病毒感染。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。溶菌酶可作为防腐剂，应用在食品包装方面。畜牧水产养殖业是我国农业的重要组成部分，当前农村经济的主要增长点之一，但传染性疾病对养殖业造成巨大威胁，制约其发展。针对此问题，现今国内普遍做法是将抗生素与饲料混在一起作为兽药使用。长期使用抗生素存在安全隐患，同时也产生了抗药性等一系列问题，寻找抗生素替代品是解决问题的一条非常有效的途径。

溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)，是一种碱性水溶性蛋白酶。它主要通过切断细胞壁肽聚糖中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰葡萄糖胺之间的糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，细菌裂解。溶菌酶可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与dna、rna脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。大多数溶菌酶对于革兰氏阳性菌的细胞壁破坏性较强，而对革兰氏阴性菌作用很弱。溶菌酶作为非特异性免疫因子，本身是一种天然蛋白质，既不会使病原菌产生耐药性，也不会使动物产生残留问题，是一种安全性很高的饲料酶制剂。

褶纹冠蚌(学名：cristariaplicata)俗称鸡冠蚌、湖蚌、绵蚌、水蚌等，为蚌科、冠蚌属，淡水底栖贝类，为中国沿海常见种。一般栖息于淡水缓流及静水水域的湖泊、河流以及沟渠和池塘的泥底或泥沙底里。褶纹冠蚌属大个体淡水贝类。成年个体比三角帆蚌的同龄个体大，壳长可达290mm，壳高170mm，壳宽100mm，最大个体壳长可达400mm以上。它壳质较厚，且坚硬壳后背缘向上扩展成巨大的冠，使蚌体外形略呈不等边三角形。壳面为黄褐色、黑褐色或淡青绿色；壳内面珍珠层呈乳白色、鲑白色、淡蓝色或七彩色。该蚌耐污水和低氧能力较强，喜栖于较肥的水域，生活在硬底或泥沙底的河流、湖泊、沟渠等水域中，它比三角帆蚌分布广泛，在我国几乎各地都出产。迄今为止，尚未有关于利用褶纹冠蚌基因开发重组溶菌酶及其抗菌活性的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶，具有较宽的ph值耐受范围，且对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有一定的抑菌效果，具有广泛的应用前景。为进一步研究新型绿色药物提供了参考和理论依据，同时为抗菌治疗提供高效、低毒、不易产生耐药性的药物，为开发具有自主知识产权的饲料添加剂奠定基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶，所述重组溶菌酶的编码序列为seqidno.1所示核苷酸序列。

来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶，所述重组溶菌酶的氨基酸序列为seqidno.2所示。

来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)从褶纹冠蚌组织中提取样品总rna；

(2)以提取的样品总rna为模板进行逆转录获得cdna文库；

(3)以的cdna文库为模板进行pcr扩增获得pcr扩增产物；

(4)pcr扩增产物用ecori和xhoⅰ酶切，然后与经同样酶酶切的peq-30表达载体相连接形成重组质粒；

(5)将重组质粒转化至大肠杆菌bl21de3中，培养后筛选获得重组菌；

(6)重组菌经iptg诱导表达，然后进行离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液，洗脱液采用分子筛离心脱盐，获得重组溶菌酶。

本发明通过优化表达条件，大量获得纯化的重组溶菌酶，并对其进行酶活性检测，探讨ph值、温度、金属离子、抑制剂或去污剂等因素对酶活性的影响。同时对重组溶菌酶的ph值耐受、温度耐受、抑菌种类也进行了探究。本发明的开展将有助于绿色环保药剂的应用，为进一步研究新型绿色药物提供了参考和理论依据，同时为抗菌治疗提供高效、低毒、不易产生耐药性的药物，为开发具有自主知识产权的饲料添加剂奠定基础。

步骤(3)中pcr扩增采用的引物如下：

正向引物：5’-aggaattcatggctgcacatgtcaactc-3’，

反向引物：5’-accctcgagtctggccaattttcgtattc-3’。

步骤(3)中pcr反应条件为：94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸60秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。

步骤(5)中将重组质粒转化至大肠杆菌bl21de3中采用热击法。

步骤(6)中iptg诱导表达的参数为：iptg浓度0.1mm/l，摇床转速200-220rpm，37℃培养4h。

本发明的有益效果是：具有较宽的ph值耐受范围，且对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有抑菌效果，尤其是对绿脓杆菌有较强的抑制作用，具有广泛的应用前景。

本发明为进一步研究新型绿色药物提供了参考和理论依据，同时为抗菌治疗提供高效、低毒、不易产生耐药性的药物，为开发具有自主知识产权的饲料添加剂奠定基础。

附图说明

图1是本发明的重组溶菌酶纯化后的sds-page检测结果图。

m表示蛋白marker；1表示未添加诱导剂iptg的菌液；2表示添加iptg诱导表达后的菌液；3表示未添加诱导剂iptg的重组菌菌液；4表示添加iptg诱导表达后的重组菌菌液；5表示重组蛋白。

图2是ph对酶活性的影响。

图3是重组溶菌酶对ph的耐受性。

图4是温度对酶活性的影响。

图5是重组溶菌酶的热稳定性。

图6是不同抑制剂和去污剂对酶活的影响。

图7是重组溶菌酶对不同菌的抑制效果。

图中：relativeactivity相对活性，temperature温度，time时间。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

试剂：蛋白胨、酵母提取物购自百思生物科技有限公司，1.5mtris-hclph8.8、1mtris-hclph6.8、temed、卡那霉素购自碧云天生物技术研究所，iptg、tris-base、甘氨酸、sds、30％arc-bis、ni-idaresin购自杭州诺杨生物技术有限公司，咪唑购自北京索莱宝科技有限公司，tritonx-100购自阿拉丁实业有限公司，proteinmarker、sds-page上样缓冲液、g-250蛋白快速染色试剂、bca蛋白定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，过硫酸铵、氯化钙、氯化镁、氯化锂、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购自天津市科密欧化学试剂有限公司，sds、tween-20购自阿拉丁实业有限公司，溶菌酶酶活测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，氯化钠购自高晶精细化工有限公司。

褶纹冠蚌购自杭州市杨家门农贸市场。

实施例：

来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用rna提取试剂盒(highpureffpetrnaisolationkit，罗氏)从褶纹冠蚌组织(肌肉组织)中提取样品总rna。

(2)以提取的样品总rna为模板进行逆转录(逆转录试剂盒，primescriptrtreagentkitperfectrealtime，takara)获得cdna文库。

(3)以的cdna文库为模板进行pcr扩增获得pcr扩增产物(目的基因)：

pcr反应体系如下：

cdna2μl，引物f(10umol/l)1μl，引物r(10umol/l)1μl，ddh2o6μl，mix(10×taqbuffer、mgcl2、dntp、taq酶)10μl；总体积20μl。mix(realtimepcrmastermix，厂家：toyobo，型号：qpk-101)。

pcr反应条件为：94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸60秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。

引物如下：

正向引物：5’-aggaattcatggctgcacatgtcaactc-3’(seqidno.3)，

反向引物：5’-accctcgagtctggccaattttcgtattc-3’(seqidno.4)。

(4)通过天根dna回收试剂盒回收pcr扩增产物，pcr扩增产物用ecori和xhoⅰ酶切，然后与经同样酶酶切的peq-30表达载体相连接形成重组质粒。

(5)将重组质粒通过化学转染热击法转化至大肠杆菌bl21de3中，并涂布于lb固体培养板上，30℃培养12小时；将长出的菌落通过pcr检验，确定基因连接成功，挑菌落到上海生工测序，确保基因正确后筛得重组菌。重组菌接种至lb液体培养基中，37℃培养过夜，得菌液。

(6)重组菌表达与纯化：

6.1准备好材料，超净台做好灭菌工作；

6.2取菌液50μl接于5ml培养基(lb液体培养基)中，再加入5μl卡那霉素，混合均匀，置于200-220rpm、37℃摇床培养过夜；

6.3把摇床培养后的5ml菌液接入新的250mllb液体培养基中，加入250μl卡那霉素，37℃培养；

6.4培养3小时待菌液od600＝0.6，加入50μl500mm/liptg至iptg终浓度为0.1mm/l，200-220rpm37℃培养4h；

6.5诱导表达的菌液于12000g，4℃离心3分钟；

6.6取沉淀，加入冰冷的15mlbuffera，冰浴条件下超声裂解细菌(70％，5s/5s，10分钟)；6.718000g，4℃离心5分钟；

6.8装在离子交换柱(镍柱，novagen公司,ge)中的介质应先用缓冲液平衡，然后加入离心后的上清液，4℃缓慢结合1-2h；

6.9用20mlbufferb洗柱，分5次，每次4ml，丢弃；

6.10再用20mlbufferc洗柱，分5次，每次4ml，丢弃；

6.11加入0.5mlbufferd，当液体接近流尽后关闭流液(丢弃)，然后加入0.5mlbufferd浸泡5分钟(此处可吹起介质使之悬浮)，收集洗脱液，该收集的洗脱液就是目的蛋白；

6.12重复6.11步骤2次；

6.13蛋白洗脱液经过分子筛(美国基因公司)离心脱盐，备用。

蛋白纯化所需溶液

buffera(ph＝7.9)：0.5mol/lnacl，10mmol/l咪唑，0.5％tritonx-100，20mmol/ltris-hcl；bufferb(ph＝7.9)：0.5mol/lnacl，20-40mmol/l咪唑，0.5％tritonx-100，20mmol/ltris-hcl；bufferc(ph＝7.9)：0.5mol/lnacl，20-40mmol/l咪唑，20mmol/ltris-hcl；

bufferd(ph＝7.9)：0.1mol/lnacl，250mmol/l咪唑，20mmol/ltris-hcl。

经测序，本发明重组溶菌酶的编码序列为seqidno.1所示核苷酸序列，重组溶菌酶的氨基酸序列为seqidno.2所示。

实验方法

1.1重组溶菌酶定量

纯化的重组溶菌酶通过聚丙烯酰氨凝胶电泳(sds-page)检测蛋白纯度。确定产物中含有重组溶菌酶后，利用bca蛋白定量分析试剂盒，采用微孔板法，对纯化的蛋白进行定量。bca蛋白定量参照康为试剂盒说明书。

1.2重组溶菌酶的活性检测

1.2.1重组溶菌酶的最适ph值和ph值耐受

在ph值依次为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的条件下，以溶壁微球菌为底物，进行酶活性的测定，分析重组溶菌酶的最适ph值。另外，在上述ph不同的溶液中分别加入等量的重组溶菌酶，耐受不同时间后测定酶活性。

1.2.2重组溶菌酶活性的最适温度和温度耐受

以溶壁微球菌为底物，在酶活性的最适ph值溶液中，位于不同的温度下(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)，检测重组溶菌酶的最适温度。同样，在不同温度下，重组溶菌酶耐受不同时间后检测酶活性。

1.2.3抑制剂或去污剂对重组溶菌酶活性的影响

以溶壁微球菌为底物，将适量的重组溶菌酶分别加入抑制剂或去污剂十二烷基硫酸钠(sds)、edta、chaps、pmsf、tween-20以及tritionx-100中，置于常温下10分钟，以最适ph值缓冲液中不加入抑制剂和去污剂的重组溶菌酶作为对照测定酶活性。

1.2.4金属离子对重组溶菌酶活性的影响

以溶壁微球菌微底物，将重组溶菌酶分别加入浓度为100mm、10mm、1mm的金属离子溶液中(k⁺、na⁺、mg²⁺、ca²⁺、mn²⁺、fe²⁺、fe³⁺)，置于常温下10分钟，以最适ph值缓冲液中不加金属离子的重组溶菌酶作为对照测定酶活性。

1.2.5重组溶菌酶的抑菌效果

本实验中主要通过对革兰氏阴性菌大肠杆菌(e.coli)和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(b.subiilis)进行抑菌实验，选用大肠杆菌(e.coli)、金黄色葡萄糖球菌(s.aureus)、枯草芽孢杆菌(b.subiilis)、绿脓杆菌(p.aeruginosa)等观察重组溶菌酶的抑菌效果，培养的以上细菌与溶菌酶混合反应30分钟后，测od值的变化。

2结果与分析

2.1重组溶菌酶及定量

如图1所示，含重组质粒的菌株添加iptg诱导后，在蛋白分子量大小约为27kd处有明显表达，即重组溶菌酶，通过亲和层析镍介质纯化，获得重组溶菌酶。为了对重组溶菌酶进行定量，采用bsa法进行定量后进行酶活测定。

2.2重组溶菌酶的最适ph和ph耐受

以溶壁微球菌为底物测定重组溶菌酶在不同ph缓冲液的相对酶活和酶在不同ph下的活力维持，结果见图2和图3。由图2可知该重组溶菌酶ph＝6时相对酶活力达到最高，ph＝3和ph＝9时相对酶活力分别为26％和29％，在ph＝5和ph＝6之间酶保持着较高的活性。由图3可知，重组酶在ph＝4到ph＝9之间溶液孵育60分钟，仍保持65％的活性，在ph＝8、ph＝9溶液中，酶处理120分钟后，仍保持45％以上的酶活，说明该酶在具有较广的ph耐受性。

2.3重组溶菌酶的最适温度和热稳定性

将酶液分别置于一系列不同的温度中反应(20℃-60℃)，结果表明(图4)：酶在30℃现出最佳的酶活性。将重组酶放在30℃、40℃、50℃、60℃(图5)下处理不同时间，结果表明，酶在小于40℃时有较好的稳定性，处理80分钟后仍有55％的活性，在60℃处理80分钟后保持43.08％的活性。

2.4抑制剂或去污剂对重组溶菌酶活性的影响

以溶壁微球菌为底物，将适量的重组溶菌酶分别加入不同的抑制剂和去污剂中，置于常温下10分钟，在最适ph值缓冲液中以不加入抑制剂和去污剂的重组溶菌酶作为对照测定酶活性。结果表明：tritionx-100和tween-20对酶活性均有促进作用，而sds、chaps、edta、pmsf对酶活性有抑制作用(图6)。

2.5金属离子对重组溶菌酶活性的影响

以溶壁微球菌微底物，将重组溶菌酶分别加入浓度为100mm、10mm、1mm的金属离子溶液中k⁺、na⁺、mg²⁺、ca²⁺、mn²⁺、fe²⁺、fe³⁺)，置于常温下10分钟，在最适ph值缓冲液中以不加金属离子的重组溶菌酶作为对照测定酶活性。结果表明(表1)在1mm金属离子k⁺、na⁺、mg²⁺、ca²⁺、mn²⁺、fe²⁺、对酶活性有不同程度的促进作用，且随着金属离子浓度的增高，其对酶活性的促进的效果就越低。

表1金属离子对重组溶菌酶活性的影响

2.6重组溶菌酶的抑菌实验

如图7所示，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金色葡萄球菌、绿脓杆菌lb培养并离心，pbs重悬在450nm下od为0.5，加50μl蛋白37℃下反应30min，在450nm处测吸光值，计算od减少率并绘图。重组溶菌酶对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金色葡萄球菌、绿脓杆菌的抑制率分别为7％、8.49％、10％、17.45％，说明重组溶菌酶对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌作用，尤其是对绿脓杆菌有较强的抑制作用。

3讨论和展望

本实验通过研究重组溶菌酶的性质，其反应最适ph为6.0，重组酶在ph＝4到ph＝9之间溶液孵育60分钟，仍保持65％的活性，在ph＝8、ph＝9溶液中，酶处理120分钟后，仍保持45％以上的酶活，说明该酶在具有较广的ph耐受性。在温度方面，其最适温度为30℃，且在40℃以下，酶活一直在90％以上。在离子方面1mm金属离子k⁺、na⁺、mg²⁺、ca²⁺、mn²⁺、fe²⁺、对酶活性有不同程度的促进作用。tritionx-100和tween-20对酶活性均有促进作用，而sds、chaps、edta、pmsf对酶活性有抑制作用，在抑菌方面，重组溶菌酶对大肠杆菌(e.coli)、金黄色葡萄糖球菌(s.aureus)、枯草芽孢杆菌(b.subiilis)、绿脓杆菌(p.aeruginosa)都有抑制效果。综上所述，该重组溶菌酶较宽的ph值耐受，且对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的不同抑菌效果，都展现了该重组溶菌酶具有广泛的应用前途。

传染性疾病给对水产殖业造成了巨大影响，严重地制约着其持续性发展。长期使用抗生素存在安全性和抗药性的隐患，溶菌酶作为非特异性免疫因子，是一种天然蛋白质，在对虾饲料中添加，可以解决养殖生产中因而导致对虾免疫力降低以及药物残留等问题，因此本发明可为溶菌酶的开发利用提供理论依据。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

sequencelisting

<110>浙江理工大学

<120>来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶

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<213>人工序列（artificialsequence）

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