一种基于双极性脉冲电场诱导细胞融合的方法与流程

本发明涉及一种细胞融合技术领域，特别是涉及一种基于双极性脉冲电场诱导细胞融合的方法。

背景技术：

细胞融合能够实现远源杂交，其意义在于打破了仅仅依赖有限杂交重组基因创造新种的界限，有可能形成有性杂交方式无法获得的新型的杂交动物或植物细胞，扩大了遗传物质的重组范围。

细胞融合是生物制备的基本途径。细胞能否有效融合是决定生物制备是否可行的关键，甚至成为制约生物制备技术发展的瓶颈。因此，如何发展和改进现有的细胞融合方法、提升细胞融合的效果和效率，已成为国内外生物制备领域的一个研究热点。

根据电融合的基本原理，细胞膜上出现足够数量和尺寸的孔洞(即细胞电穿孔)，是细胞融合的先决条件。而细胞要发生电穿孔，细胞的跨膜电压必须大于其细胞膜穿孔所需的电压阈值。细胞融合的基本步骤是：首先，细胞在电融合之前，两个待融合的细胞必须先有紧密的接触。然后通过对电极槽施加高频率(1-2mhz)的正弦交流电压，使细胞在介电泳力的牵引下，依次排列成串。介电泳的基本原理是基于细胞中的离子的极化，在高频率交流电场内，会受到电场互相吸引，形成串珠状态。待细胞排列成串状后，需要通过高速的开关切换，将高频正弦电压切换到低频窄脉冲电压，以使细胞发生电穿孔，使细胞接触区域形成熔融状态。由于传统的单极性脉冲脉冲细胞电融合，对彼此紧贴的两个细胞施加若干个低场强的单极性微秒脉冲。场强过低，细胞膜无法达到跨膜电位阈值，不会产生电穿孔。而场强增高，虽然在一定程度上可以提高融合率，但是与之并存的是细胞死亡率的增加，从而会限制细胞融合率。传统的单极性微秒脉冲在作用细胞融合的时候容易对细胞造成较大的损伤，较高的死亡率会导致细胞融合率处于一个很低的水平。由于双极性脉冲具有正负电荷的累积效应，对细胞膜存在正向充电和反向充电的过程，相同参数下，对细胞造成的损伤要比单极性脉冲对细胞的损伤小。因此本发明采用双极性脉冲电场作用细胞融合，通过减小细胞的死亡率，从而提高细胞融合率。仿真和实验结果表明，相同参数条件下，双极性脉冲作用后细胞融合率远远高于单极性脉冲作用后的细胞融合率。此外，双极性脉冲作用下的细胞死亡率远低于单极性脉冲作用下的细胞死亡率，并且具有极显著性差异。双极性脉冲电融合比单极性脉冲具有明显的优势。本发明旨在为细胞电融合提供一种高效的新型物理手段，对于推进细胞电融合技术的发展具有重要意义。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题，特别创新地提出了一种基于双极性脉冲电场诱导细胞融合的方法。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种基于双极性脉冲电场诱导细胞融合的方法，包括以下步骤：

s1，将不同或者相同尺寸的细胞和融合液置于细胞培养槽内；

s2，将正弦交流电压施加于细胞培养槽的两极，细胞将排队且彼此紧贴；

将正弦交流电压施加于细胞培养槽的两极的方法为：

控制器分别同时向场效应管k1～k9以及场效应管s1～sn发送导通和截止命令，其中控制器向场效应管k8和场效应管k9发送导通命令，向其余场效应管发送截止命令；此时脉冲第二产生电路向负载电阻r2输出高频高压正弦交流电压；

s3，通过脉冲切换开关，将培养槽两极上所施加的正弦交流电压切换为双极性脉冲电压，槽内细胞发生微小电穿孔；

正弦交流电压切换为双极性脉冲电压的方法包括以下步骤：

s31，控制器分别同时向场效应管k1～k9以及场效应管s1～sn发送导通和截止命令，其中，控制器向场效应管s1发送导通信号，向其余场效应管发送截止命令；电源s分别给电容c1～cn充电；

s32，控制器分别同时向场效应管k1～k9以及场效应管s1～sn发送导通和截止命令，其中控制器向场效应管s1～sn、场效应管k2以及场效应管k5～k7发送导通命令，向其余场效应管发送截止命令；此时电容c1～cn上的电荷通过负载电阻r2释放，在负载电阻r2上输出正极性的脉冲方波；

s33，控制器分别同时向场效应管k1～k9以及场效应管s1～sn发送导通和截止命令，其中控制器向场效应管s1～sn、场效应管k3～k4以及场效应管k6～k7发送导通命令，向其余场效应管发送截止命令；此时电容c1～cn上的电荷通过负载电阻r2释放，在负载电阻r2上输出负极性的脉冲方波；

s4，继续通过脉冲切换开关，将双极性脉冲电压切换为正弦电压，作用于已经处于穿孔状态的槽内细胞，己处于开孔状态的细胞上的孔进一步增大，彼此紧贴的两个细胞的外膜彼此连接，两细胞内遗传物质互相融合，最终形成一个完整的融合细胞；

双极性脉冲电压切换为正弦电压的方法为：

控制器分别同时向场效应管k1～k9以及场效应管s1～sn发送导通和截止命令，其中控制器向场效应管k8和场效应管k9发送导通命令，向其余场效应管发送截止命令；此时脉冲第二产生电路向负载电阻r2输出高频高压正弦交流电压；

s5，当脉冲施加完毕后，控制器分别同时向场效应管k1～k9以及场效应管s1～sn发送导通和截止命令，其中控制器向场效应管s1～sn以及场效应管k1发送导通命令，向其余场效应管发送截止命令，电容c1～cn上残余的电荷通过放电电阻r1进行释放。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤s1中的细胞包括大细胞或/和小细胞，所述大细胞的半径范围为5～15um，所述大细胞的半径是小细胞半径的1～20倍；

所述大细胞的密度为2×10⁶～5×10⁷个/l，所述小细胞的密度是大细胞密度的五倍。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤s1中的细胞为植物细胞或/和动物细胞；若为植物细胞，融合前需对植物细胞进行去壁处理后再进行融合。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤s2中正弦交流电压的参数：频率0～2mhz，持续时间0～100s；在槽内形成的电场100～500v/cm。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤s3中的双极性脉冲是通过电容充放电实现的。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤s3中双极性脉冲参数：作用个数1～100个，脉冲间隔0.l～10s，波形为双极性脉冲方波，脉冲宽度50ns～100ms；在槽内形成电场0～10kv/cm。

在本发明的一种优选实施方式中，双极性脉冲方波为纳秒脉冲电场、微秒脉冲电场或毫秒脉冲电场。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤s1中的融合液包括体积比为(0.5～2.5)：(0.5～2.5)：(1～4)的pm缓冲液、酶液和cpw盐溶液；

所述pm缓存液由mgcl2、cacl2、山梨醇和三蒸水配制而成；所述mgcl2的浓度为0.04～0.3mmol/l，cacl2的浓度为0.03～0.5mmol/l，葡萄糖的浓度为100～500mmol；

所述酶液由cellulaseonzukar-10、mecerozymer-10和甘露醇配制而成；所述cellulaseonzukar-10的浓度为0.45％～2.5％，mecerozymer-10的浓度为0.45％～2.5％，甘露醇的浓度为9％～29％；

所述cpw盐溶液由kh2po4、kno3、cacl2·2h20、mgso4·7h20、ki和cuso4·5h20配制而成；所述kh2po4的浓度为10～25mg/l，kno3的浓度为70.0～100.0mg/l，cacl2·2h20的浓度为1100.0～1500.0mg/l，mgso4·7h20的浓度为200.0～250.0mg/l，ki的浓度为0.05～0.45mg/l，cuso4·5h20的浓度为0.015～0.15mg/l。

在本发明的一种优选实施方式中，正极性的脉冲方波与负极性的脉冲方波的幅值相同或者不同。

值得说明的是：

1)正弦交流电压作用的终止条件：观察到细胞排队；正弦交流电压到微秒脉冲电压的切换时间在2μs内。

2)双极性脉冲作用的终止条件：通过施加双极性脉冲的个数来控制；

例如：预计施加4个双极性脉冲，当施加到4个双极性脉冲后，就立即切换到正弦交流电压)。

综上所述，本发明的技术效果是十分显著的，本发明具有以下优点：

1)传统的细胞电融合采取的是单极性微秒脉冲电融合，但是单极性微秒脉冲具有一定的缺陷。由于单极性微秒脉冲作用下，对细胞膜的破坏作用较大，细胞可能还未进行融合就早已处于过度穿孔的死亡状态。而本发明中的方案使用的双极性脉冲作用细胞电融合，利用了双极性脉冲对细胞杀伤效应较小的优势，能在保证细胞死亡率较低的前提下，使细胞膜表面发生电穿孔。

2)基于双极性微秒脉冲电融合的方法，相比于传统的单极性微秒脉冲细胞电融合，能够有效地提高细胞融合的成功率。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为单极性微秒脉冲电融合示意图。

图2为双极性微秒脉冲电融合示意图。

图3为本发明的工作流程图。

图3中：

a为电融合之前，细胞散乱在细胞悬液中；

b为在正弦交流电场作用下，细胞彼此紧密接触，细胞间形成接触区域；

c为细胞的接触区域在脉冲电场的作用下，在接触区域产生电穿孔；

d为接触区域的膜扩张后，两细胞进行融合，遗传物质进行交换。

图4为双极性脉冲电融合中施加的电压波形示意图。

图5为细胞在正弦电压作用下发生的双向电泳排队图。

图6为本发明的融合后杂交瘤细胞培养实物图。

图6中：

(a)～(c)为单极性脉冲在不同场强下的异种细胞融合后的培养结果；

(d)～(f)为双极性脉冲在不同场强下的异种细胞融合后的培养结果。

图7为本发明电路连接示意图。

图7中：

a为高压产生电路电路连接示意图；

b为切换电路电路连接示意图；

c为脉冲切换电路电路连接示意图；

d为第二脉冲产生电路电路连接示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提供了一种基于双极性脉冲电场诱导细胞融合的方法，包括以下步骤：

s1，将不同或者相同尺寸的细胞和融合液置于细胞培养槽内；

s2，将正弦交流电压施加于细胞培养槽的两极，细胞将排队且彼此紧贴；

将正弦交流电压施加于细胞培养槽的两极的方法为：

控制器分别同时向场效应管k1～k9以及场效应管s1～sn发送导通和截止命令，其中控制器向场效应管k8和场效应管k9发送导通命令，向其余场效应管发送截止命令；此时脉冲第二产生电路向负载电阻r2输出高频高压正弦交流电压；

s3，通过脉冲切换开关，将培养槽两极上所施加的正弦交流电压切换为双极性脉冲电压，槽内细胞发生微小电穿孔；

正弦交流电压切换为双极性脉冲电压的方法包括以下步骤：

s31，控制器分别同时向场效应管k1～k9以及场效应管s1～sn发送导通和截止命令，其中，控制器向场效应管s1发送导通信号，向其余场效应管发送截止命令；电源s分别给电容c1～cn充电；

s32，控制器分别同时向场效应管k1～k9以及场效应管s1～sn发送导通和截止命令，其中控制器向场效应管s1～sn、场效应管k2以及场效应管k5～k7发送导通命令，向其余场效应管发送截止命令；此时电容c1～cn上的电荷通过负载电阻r2释放，在负载电阻r2上输出正极性的脉冲方波；

s33，控制器分别同时向场效应管k1～k9以及场效应管s1～sn发送导通和截止命令，其中控制器向场效应管s1～sn、场效应管k3～k4以及场效应管k6～k7发送导通命令，向其余场效应管发送截止命令；此时电容c1～cn上的电荷通过负载电阻r2释放，在负载电阻r2上输出负极性的脉冲方波；

s4，继续通过脉冲切换开关，将双极性脉冲电压切换为正弦电压，作用于已经处于穿孔状态的槽内细胞，己处于开孔状态的细胞上的孔进一步增大，彼此紧贴的两个细胞的外膜彼此连接，两细胞内遗传物质互相融合，最终形成一个完整的融合细胞；

双极性脉冲电压切换为正弦电压的方法为：

控制器分别同时向场效应管k1～k9以及场效应管s1～sn发送导通和截止命令，其中控制器向场效应管k8和场效应管k9发送导通命令，向其余场效应管发送截止命令；此时脉冲第二产生电路向负载电阻r2输出高频高压正弦交流电压；

s5，当脉冲施加完毕后，控制器分别同时向场效应管k1～k9以及场效应管s1～sn发送导通和截止命令，其中控制器向场效应管s1～sn以及场效应管k1发送导通命令，向其余场效应管发送截止命令，电容c1～cn上残余的电荷通过放电电阻r1进行释放。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤s1中的细胞包括大细胞或/和小细胞，所述大细胞的半径范围为5～15um，所述大细胞的半径是小细胞半径的1～20倍；

所述大细胞的密度为2×10⁶～5×10⁷个/l，所述小细胞的密度是大细胞密度的五倍。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤s1中的细胞为植物细胞或/和动物细胞；若为植物细胞，融合前需对植物细胞进行去壁处理后再进行融合。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤s2中正弦交流电压的参数：频率0～2mhz，持续时间0～100s；在槽内形成的电场100～500v/cm。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤s3中的双极性脉冲是通过电容充放电实现的。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤s3中双极性脉冲参数：作用个数1～100个，脉冲间隔0.l～10s，波形为双极性脉冲方波，脉冲宽度50ns～100ms；在槽内形成电场0～10kv/cm。

在本发明的一种优选实施方式中，双极性脉冲方波为纳秒脉冲电场、微秒脉冲电场或毫秒脉冲电场。

在本发明的一种优选实施方式中，步骤s1中的融合液包括体积比为(0.5～2.5)：(0.5～2.5)：(1～4)的pm缓冲液、酶液和cpw盐溶液；

所述pm缓存液由mgcl2、cacl2、山梨醇和三蒸水配制而成；所述mgcl2的浓度为0.04～0.3mmol/l，cacl2的浓度为0.03～0.5mmol/l，葡萄糖的浓度为100～500mmol；

所述酶液由cellulaseonzukar-10、mecerozymer-10和甘露醇配制而成；所述cellulaseonzukar-10的浓度为0.45％～2.5％，mecerozymer-10的浓度为0.45％～2.5％，甘露醇的浓度为9％～29％；

所述cpw盐溶液由kh2po4、kno3、cacl2·2h20、mgso4·7h20、ki和cuso4·5h20配制而成；所述kh2po4的浓度为10～25mg/l，kno3的浓度为70.0～100.0mg/l，cacl2·2h20的浓度为1100.0～1500.0mg/l，mgso4·7h20的浓度为200.0～250.0mg/l，ki的浓度为0.05～0.45mg/l，cuso4·5h20的浓度为0.015～0.15mg/l。

在本实施方式中，正极性的脉冲方波与负极性的脉冲方波的幅值相同或者不同。例如正极性的脉冲方波为300v时，负极性的脉冲方波为-300v，此时正极性的脉冲方波与负极性的脉冲方波的幅值相同；正极性的脉冲方波为300v时，负极性的脉冲方波为-250v或-350v，此时正极性的脉冲方波与负极性的脉冲方波的幅值不相同。

实施例：

基于双极性脉冲电场诱导细胞融合的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将不同尺寸的细胞和融合液置于细胞培养槽内；

1.1)选择细胞

大细胞为：鼠源骨髓瘤细胞，半径为7.75±0.25μm；

小细胞为：鼠源b淋巴细胞，半径为3.85±0.35μm；

1.2)选择融合液(培养液)

所述电融合的融合液主要成分是葡萄糖，钙离子，镁离子。所述步骤s1中的融合液包括体积比为1：1：2的pm缓冲液、酶液和cpw盐溶液；

所述pm缓存液由mgcl2、cacl2、葡萄糖和三蒸水配制而成；所述mgcl2的浓度为0.05mmol/l，cacl2的浓度为0.05mmol/l，葡萄糖的浓度为200mmol/l；

所述酶液由cellulaseonzukar-10、mecerozymer-10和甘露醇配制而成；所述cellulaseonzukar-10的浓度为0.5％，mecerozymer-10的浓度为0.5％，甘露醇的浓度为10％；

所述cpw盐溶液由kh2po4、kno3、cacl2·2h20、mgso4·7h20、ki和cuso4·5h20配制而成；所述kh2po4的浓度为15mg/l，kno3的浓度为80.0mg/l，cacl2·2h20的浓度为1200.0mg/l，mgso4·7h20的浓度为210.0mg/l，ki的浓度为0.1mg/l，cuso4·5h20的浓度为0.025mg/l。

1.3)选择培养槽

选择长方体型培养槽，培养槽间距为3.81mm，容积为2ml；

培养槽内：大细胞的细胞密度约1×10⁶/l，小细胞的密度是大细胞的五倍。

2)将正弦交流电压作用于细胞培养槽的两极，细胞将排队且彼此紧贴；

所述正弦交流电压的参数为：电场200v/cm，1mhz，持续时间40s。

如图5所示，即为细胞在正弦交流电压作用下发生的双向电泳排队示意图。

正弦交流电压作用的终止条件：观察到细胞排队，正弦排队电压到双极性微秒脉冲电压的切换时间在2μs内。

3)通过脉冲切换开关，将培养槽两极上所施加的正弦交流电压切换为双极性脉冲电压，槽内细胞的细胞膜上发生电穿孔；

所述双极性脉冲电压的参数为：场强2kv/cm，个数2个，脉冲间隔1s，脉冲宽度40μs；

4)继续通过脉冲切换开关，将双极性脉冲电压切换为正弦交流电压，作用于已经处于穿孔状态的槽内细胞，使彼此紧贴的两个细胞的外膜彼此连接，两细胞内遗传物质互相融合，最终形成一个完整的融合细胞；

所述正弦交流电压的参数为：电场200v/cm，1mhz，持续时间10s。

正弦交流电压作用的终止条件：观察到细胞开始融合，双极性微秒脉冲电压到正弦排队电压的切换时间在2μs内。

对比例：

现有技术中，采用单极性微秒脉冲的方法进行细胞融合；如图1所示即为单极性微秒脉冲作用于细胞融合的孔密度图；图中深色部分表示细胞穿孔的部位，单极性微秒脉冲作用两个不同尺寸的细胞融合时，由于单极性脉冲对细胞杀伤效应较大，导致细胞大面积穿孔，两细胞可能还未融合就已经处于死亡状态，从而抑制了融合率的提升。

本发明中，采用双极性脉冲的方法进行细胞融合；如图2所示即为双极性微秒脉冲作用于细胞融合的孔密度图，图中深色部分表示细胞穿孔的部位。双极性微秒脉冲作用两个不同尺寸的细胞融合时，由于双极性脉冲对细胞膜上的电荷具有正负累积效应，可以在保证细胞死亡率较低的情况下，在细胞膜的表面产生电穿孔。

本发明中如图3和图4所示的本发明工作流程图和施加电压的波形示意图。采用了：首先使用正弦交流电压，使溶液中散乱分布的细胞在介电泳力的作用下依次排列成串；通过施加双极性脉冲，使两细胞的接触区域处的细胞膜产生电穿孔；继而施加正弦交流电压，以便于处于熔融状态的细胞紧密接触，进而进行融合。

本发明中如图6所示的本发明的融合后杂交瘤细胞培养实物图。图6中(a)～(c)分别为单极性脉冲在不同场强下的异种细胞融合后的培养结果。图6中(d)～(f)分别为双极性脉冲在不同场强下的异种细胞融合后的培养结果。对比可以发现，同等脉冲参数条件下，双极性脉冲作用下的细胞融合率要明显高于单极性脉冲作用下的细胞融合率。

经过对比可以很明显的发现，本发明中利用双极性脉冲的优势，利用利用降低细胞死亡率的思路进而提升细胞融合效率，通过设置双极性脉冲参数，可以有效的促使不同尺寸细胞间发生融合，提高不同尺寸细胞的融合效率。

如图7所示，产生双极性脉冲方波和正弦波的电路连接为：电源s的第一端(电源的正极)与场效应管s1的漏极相连，场效应管s1的源极与二极管d1的正极相连，场效应管s1的栅极与控制器的第1充放电信号输出端相连，二极管d1的负极分别与电容c1的第一端、场效应管s2的漏极和二极管d2的正极相连，场效应管s2的栅极与控制器的第2充放电信号输出端相连，电容c1的第二端分别与二极管dn+1的正极、放电电阻r1的第二端、场效应管k3的源极和场效应管k5的源极相连，二极管d2的负极分别与电容c2的第一端、场效应管s3的漏极和二极管d3的正极相连，场效应管s3的栅极与控制器的第3充放电信号输出端相连，场效应管s2的源极分别与二极管dn+1的负极、二极管dn+2的正极和电容c2的第二端相连，场效应管s3的源极分别与二极管dn+2的负极、二极管dn+3的正极和电容c3的第二端相连，……，二极管dn的正极分别与二极管dn-1的负极、场效应管sn的漏极和电容cn-1的第一端相连，二极管d2n的正极分别与二极管d2n-1的负极、场效应管sn的源极和电容cn的第二端相连，场效应管sn的栅极与控制器的第n充放电信号输出端相连，二极管dn的正极分别与场效应管sn+1的漏极和电容cn的第一端相连，场效应管sn+1的栅极与控制器的第n+1充放电信号输出端相连，二极管d2n的负极分别与场效应管sn+1的源极、电源的第二端(电源的负极)场效应管k1的漏极、场效应管k2的漏极和场效应管k4的漏极相连，场效应管k1的源极与放电电阻r1的第一端相连，场效应管k2的源极分别与场效应管k3的漏极和场效应管k6的源极相连，场效应管k6的漏极与场效应管k7的漏极相连，场效应管k7的源极分别与负载电阻r2的第一端和场效应管k8的源极相连，场效应管k8的漏极与场效应管k9的漏极相连，场效应管k9的源极与脉冲第二产生电路的信号第一输出端相连，场效应管k4的源极分别与场效应管k5的漏极、负载电阻r2的第二端和脉冲第二产生电路的信号第二输出端相连；场效应管k1的栅极与控制器的第1信号输出端相连，场效应管k2的栅极与控制器的第2信号输出端相连，场效应管k3的栅极与控制器的第3信号输出端相连，场效应管k4的栅极与控制器的第4信号输出端相连，场效应管k5的栅极与控制器的第5信号输出端相连，场效应管k6的栅极与控制器的第6信号输出端相连，场效应管k7的栅极与控制器的第7信号输出端相连，场效应管k8的栅极与控制器的第8信号输出端相连，场效应管k9的栅极与控制器的第9信号输出端相连。

当n取3时，其连接关系为：

电源的正极与场效应管s1的漏极相连，场效应管s1的源极与二极管d1的正极相连，场效应管s1的栅极与控制器的第1充放电信号输出端相连，二极管d1的负极分别与电容c1的第一端、场效应管s2的漏极和二极管d2的正极相连，场效应管s2的栅极与控制器的第2充放电信号输出端相连，电容c1的第二端分别与二极管d4的正极、放电电阻r1的第二端、场效应管k3的源极和场效应管k5的源极相连，二极管d2的负极分别与电容c2的第一端、场效应管s3的漏极和二极管d3的正极相连，场效应管s3的栅极与控制器的第3充放电信号输出端相连，场效应管s2的源极分别与二极管d4的负极、二极管d5的正极和电容c2的第二端相连，场效应管s3的源极分别与二极管d5的负极、二极管d6的正极和电容c3的第二端相连，二极管d3的负极分别与场效应管s4的漏极和电容c3的第一端相连，场效应管s4的栅极与控制器的第4充放电信号输出端相连，二极管d6的负极分别与场效应管s4的源极、电源的负极、场效应管k1的漏极、场效应管k2的漏极和场效应管k4的漏极相连，场效应管k1的源极与放电电阻r1的第一端相连，场效应管k2的源极分别与场效应管k3的漏极和场效应管k6的源极相连，场效应管k6的漏极与场效应管k7的漏极相连，场效应管k7的源极分别与负载电阻r2的第一端和场效应管k8的源极相连，场效应管k8的漏极与场效应管k9的漏极相连，场效应管k9的源极与脉冲第二产生电路的信号第一输出端相连，场效应管k4的源极分别与场效应管k5的漏极、负载电阻r2的第二端和脉冲第二产生电路的信号第二输出端相连；场效应管k1的栅极与控制器的第1信号输出端相连，场效应管k2的栅极与控制器的第2信号输出端相连，场效应管k3的栅极与控制器的第3信号输出端相连，场效应管k4的栅极与控制器的第4信号输出端相连，场效应管k5的栅极与控制器的第5信号输出端相连，场效应管k6的栅极与控制器的第6信号输出端相连，场效应管k7的栅极与控制器的第7信号输出端相连，场效应管k8的栅极与控制器的第8信号输出端相连，场效应管k9的栅极与控制器的第9信号输出端相连。在本实施方式中，将负载电阻r2替换为细胞培养槽。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。