一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在产乳果糖中的应用的制作方法

本发明涉及一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在产乳果糖中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

乳果糖(lactulose)是一种不易消化的二糖，其成品为黄色澄明液体，甜度相当于乳糖，但小于蔗糖，约48％-60％蔗糖，口感凉醇，粘度低，热量低，安全性高，稳定性好。此外，乳果糖可增值双歧杆菌的活性，是一种良好的双歧杆菌促进因子，因而，乳果糖在医药行业、食品和动物饲料领域得到了广泛的应用。

商业化的乳果糖主要是通过化学法制备的，但是化学法需要添加大量的催化剂，反应所需要的条件一般也比较激烈，得到的产物副产品较多，这些混合物给后续的产品分离带来了很大的不便。相比之下，生物酶法制备乳果糖具有很多优势，其反应条件温和，卫生安全，符合低碳经济和绿色环保的要求。

目前主要用于催化乳糖生成乳果糖的酶主要有糖苷水解酶(glycosidehydrolase，ec3.2.1)和纤维二糖差向异构酶(ces，ec5.1.3.11)。其中，纤维二糖差向异构酶(ces)能够直接催化单一乳糖生产乳果糖，是目前最高效的乳果糖制备用酶，因而受到了广泛的研究。然而，野生型的纤维二糖差向异构酶活力较低，一般通过构建基因工程菌的方式提高其表达水平。

目前，在大肠杆菌、毕赤酵母中异源表达纤维二糖差向异构酶均出现过相关报道，但效果并不理想。2016年，韩亮等将caldicellulosiruptorsaccharolyticus来源的的纤维二糖差向异构酶cscem基因进行密码子优化，然后进行全基因合成，再将其引入到载体ppic9k中，构建重组质粒ppic9k-cscem，并转化入毕赤酵母gs115，得到酵母工程菌株，该菌株经甲醇诱导144h后，摇瓶发酵液上清酶活达到0.42u/ml(见韩亮，杨瑞金，赵伟等，纤维二糖差向异构酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究[j].工业微生物，2016，46(1):16-21)；以大肠杆菌为宿主时，2015年，汪明明等以e.colibl21(de3)为宿主，异源表达caldicellulosiruptorsaccharolyticus来源的纤维二糖差向异构酶，在重组菌菌体培养至od600＝0.6时加入终浓度为10g/l的乳糖，25℃下诱导20h，最终发酵液中csce酶活达0.801u/ml(见汪明明，杨瑞金，华霄等，乳糖诱导纤维二糖差向异构酶的表达及热处理纯化[j].食品与发酵工业，2015，41(3):1-7)。且大肠杆菌、毕赤酵母都不是食品安全级菌株，由这些菌株获得的重组酶若要进一步应用于食品领域，其安全性存疑。

因此，提供一种条件温和、易于纯化、卫生安全、环保、活力较高的纤维二糖差向异构酶生产方法，对于工业制备乳果糖具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种纤维二糖差向异构酶突变体，含seqidno.1所示的氨基酸序列。以嗜热厌氧菌(dictyoglomusthermophilum)来源的纤维二糖差向异构酶(ncbi:wp_012547288.1)为野生酶，该纤维二糖差向异构酶突变体是将第8位的天冬氨酸突变为谷氨酰胺，第26位的赖氨酸突变为天冬氨酸，第99位的异亮氨酸突变为组氨酸，第161位的天冬氨酸突变为谷氨酸，第181位的赖氨酸突变为亮氨酸，第197位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，第204位的赖氨酸突变为丝氨酸，第231的苯丙氨酸突变为谷氨酸，第292位的亮氨酸突变为精氨酸，突变位点包括d8q、k26d、i99h、d161e、k181l、f197y、k204s、f231e和l292r。

本发明的第二个目的是提供编码上述纤维二糖差向异构酶突变体的基因，含seqidno.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含上述基因的载体或细胞。

本发明的第四个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，表达上述纤维二糖差向异构酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，以枯草芽孢杆菌cctccno:m2016536为表达宿主。所述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，已于2016年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016536，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

所述枯草芽孢杆菌cctccno:m2016536已公开于专利cn201611025858.9中。

在本发明的一种实施方式中，以pbsmul3为表达载体，pbsmul3的核苷酸序列如seqidno.5所示。

本发明的第五个目的是提供一种生产纤维二糖差向异构酶的方法，应用了上述重组枯草芽孢杆菌进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，是挑取单菌落接种到lb培养基中，35-39℃、200-220rpm，培养8-10h；将培养液按5-10％的接种量接种到tb培养基中，先于35-39℃、200-220rpm，培养1.5-3h，当菌体od600在0.5-1.0时转至30-34℃、200-220rpm进行摇瓶诱导发酵45-50h，发酵液经超声破碎后离心，上清即为重组纤维二糖差向异构酶。

本发明的第六个目的是提供一种生产乳果糖的方法，以乳糖为底物，以上述纤维二糖差向异构酶突变体或表达上述纤维二糖差向异构酶突变体的细胞为催化剂。

在本发明的一种实施方式中，初始反应温度为75-82℃，起始ph为7.0-7.5，乳糖浓度为350-450g/l，加酶量控制为15-25u/ml反应体系；设置温度为75-82℃、转速140-160r/min，反应1-4h。

本发明的第七个目的是提供上述纤维二糖差向异构酶突变体或表达纤维二糖差向异构酶突变体的细胞在食品、饲料或制药领域中的应用。

本发明通过将嗜热厌氧菌来源的纤维二糖差向异构酶突变体基因连接到表达载体pbsmul3载体上，构建重组质粒pbsmul3-ce^(-)，并转化枯草芽孢杆菌bacillussubtiliscctccno:m2016536，得到重组枯草芽孢杆菌bacillussubtiliscctccno:m2016536/pbsmul3-ce^(-)。以此枯草芽孢杆菌为菌种，发酵生产纤维二糖差向异构酶，获得的重组酶酶活可达8.0u/ml，酶活至突变前的4.4倍。将重组ce用于制备乳果糖，具有良好的效果。在80℃、ph7.5、加酶量20u/ml、底物浓度400g/l的反应条件下，ce催化乳糖生成乳果糖的产量为207g/l，转化率可达51.87％，比突变前转化率提高了21％。

附图说明

图1：pbsmul3-ce^(-)重组菌摇瓶发酵sds-page电泳，1：破壁上清液；m：标准蛋白质中分子量marker。

图2：不同反应时间下生成乳果糖的含量。

图3：突变体(枯草芽孢杆菌表达)酶转化hplc色谱图。

图4：野生型(枯草芽孢杆菌表达)酶转化hplc色谱图。

图5：突变体(大肠杆菌表达)酶转化hplc色谱图。

具体实施方式

(一)培养基

lb培养基(g/l)：蛋白胨10g/l，酵母提取物5，nacl10。

tb培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，k2hpo4·3h2o16.43，kh2po42.31。

(二)酶活的定义及测定方法

将0.9ml乳糖溶液(100g/l)、0.1ml酶液、ph8.5的50mmol/ltris-hcl混合均匀，于80℃下反应20min，然后煮沸15min终止反应后，hplc法测定乳果糖含量。以等量ph8.5的50mmol/ltris-hcl缓冲液代替酶液作为空白对照。

酶活力单位(u)定义为每分钟催化产生1μmol乳果糖所需的酶量。

酶活计算公式：酶活(u/ml)＝稀释倍数×转化生成的乳果糖的量(μg/ml)/转化时间(min)。

(三)hplc检测乳果糖含量

hplc色谱条件为：agilent1200hplc色谱仪，agilent自动进样器，shodextmasahipaktmnh2p-504e色谱柱，agilent示差检测器流，流动相采用82％(v/v)乙腈和18％的磷酸盐的混合溶液(磷酸缓冲液：称取无水磷酸二氢钠1.15g，用水溶解后定容至1000ml)，柱温设定为40℃，流速为0.8ml·min^-1。采用外标法，根据峰的保留时间和峰面积来确定乳果糖的产量。

实施例1：重组质粒pbsmul3-ce^(-)的构建过程

合成嗜热厌氧菌来源的纤维二糖差向异构酶(ncbi:wp_012547288.1)基因，将基因片段连接到pet-24a载体上，得到质粒pet-24a-ce。以质粒pet-24a-ce为模板，设计正反向引物为f1/r1(序列信息分别如seqidno.3、seqidno.4所示)扩增ce基因片段。pcr得到的目的片段ce与pmd-19tsimple载体连接后转化至e.colijm109，挑选单克隆转化子至lb液体培养基中培养8-10h，提取质粒，双酶切验证正确后进行基因测序，测序正确的质粒记为pmd-19t-ce。使用限制性内切酶hindⅲ和bamhι对质粒pmd-19t-ce进行双酶切，胶回收得到ce片段，在t4连接酶的作用下将目的基因ce与表达载体pbsmul3在16℃过夜连接，将连接产物转化至e.colijm109，抽提质粒后测序正确的重组质粒记为pbsmul3-ce。以pbsmul3-ce为模板，通过定向突变得到pbsmul3-ce^(-)，纤维二糖差向异构酶突变体突变位点包括d8q、k26d、i99h、d161e、k181l、f197y、k204s、f231e和l292r。

实施例2：重组质粒pbsmul3-ce^(-)的转化

将质粒pbsmul3-ce^(-)转化到提前制备好的bacillussubtiliscctccno:m2016536中，得到基因工程菌bacillussubtiliscctccno:m2016536/pbsmul3-ce^(-)，涂布含卡那霉素(100μg/ml)抗性的lb平板上，经37℃培养10-12h。挑选单菌落至含卡那霉素(100μg/ml)抗性的10ml液体lb培养基中，37℃培养8h，保存甘油管，贮存于-80℃冰箱。验证正确后进行摇瓶发酵产酶。

实施例3：摇瓶发酵产酶

将实施例2中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于lb培养基中，在37℃下培养8h后以5％接种量转接至50mltb发酵培养基中，先放至37℃、200rpm恒温培养2h，在菌体od600在0.5-1.0时转至33℃、200rpm进行摇瓶诱导发酵48h。发酵结束后，将发酵液经超声破碎后离心，上清即为重组ce。测得重组酶活力可达8.0u/ml，蛋白电泳结果显示在43kda处有一条与理论分子量一致的条带(图1)。

实施例4：酶转化

在初始反应温度85℃，起始ph8.5，乳糖浓度为400g/l的情况下，加酶量控制为20u/ml反应体系。设置水浴摇床温度为80℃、转速150r/min，每隔1h取样煮沸终止反应，直至反应达到平衡。用hplc检测产物的含量。

在上述条件下进行酶转化反应，如图2所示，当反应进行到4h后转化率可达到51％，产量为200g/l色谱峰图见图3。

对比例1野生型纤维二糖差向异构酶在枯草芽孢杆菌中重组表达

以野生型纤维二糖差向异构酶基因ce为目的基因，在枯草芽孢杆菌中重组表达。其余条件同实施例1-4。得到的重组酶酶活为1.8u/ml，重组酶催化乳糖生成乳果糖的产量为123g/l，转化率为30.75％。如图4所示。

对比例2野生型纤维二糖差向异构酶在大肠杆菌中重组表达

以野生型纤维二糖差向异构酶基因ce为目的基因，在大肠杆菌中重组表达。其余条件同

实施例1-4。得到的重组酶酶活为1.2u/ml，重组酶催化乳糖生成乳果糖的产量为115g/l，转化率为28.9％。如图5所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在产乳果糖中的应用

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>389

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

metaspleulyshisleulysglngluilephegluglnleuasnasn

151015

lysileileprophetrpgluasnleuaspaspgluasnasnglygly

202530

tyrilesertyrvalglypheaspleulysproaspprotyralapro

354045

lysglyleuvalleuthrserargileleutrpphepheserargleu

505560

tyrasnglnleuarglysgluglupheilegluphealaasphisala

65707580

tyrglupheleuthrasplysleuleuasplysgluasnglyglyphe

859095

phetrphisvalasptyrlysglyaspproleuasplysarglyshis

100105110

leutyrglyglnalaphealaleutyrglyleuserglutyrtyrlys

115120125

alathrlyslyslysgluserleugluleuserleugluleutyrlys

130135140

thrileglugluargcyslysaspasnileglytyrlysglugluphe

145150155160

gluglulystrpthrprolysgluasnileilevalserglutyrgly

165170175

ileilecysgluleusermetasnthrleuleuhisleuleugluala

180185190

tyrthrasnleutyrthralathrtyraspleuservalarglysglu

195200205

leugluasnleuileileleuphelysglulysiletyrasnprolys

210215220

thrasphisleutyrvalglupheaspasnlysmetlysproileile

225230235240

aspalailesertyrglyhisaspileglualathrtrpleuileasp

245250255

glualaleuargtyrilegluasnasnthrleuilelysaspmetthr

260265270

gluileasnleuargilealagluargvalleugluglualapheglu

275280285

asnasnserargleuasnglulysvalargglygluvalasnlysasp

290295300

argvaltrptrpvalglnalaglualaleuleuglypheleuasnala

305310315320

tyrglnlysthrlysserasplyspheleulysalavalleuserleu

325330335

trpglupheileasnasnpheleuleuasplysargproasnglyglu

340345350

trppheasnlysleuaspgluasncysilepropheprometproglu

355360365

valaspleutrplyscysprotyrhisasnglyargmettyrleuglu

370375380

valileargargile

385

<210>2

<211>1167

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

atggatcttaaacatcttaaacaagaaatctttgaacaacttaataacaaaatcattccg60

ttttgggaaaatctggatgatgaaaacaatgggggctatattagctatgtcggctttgat120

cttaaacccgatccgtatgcacctaaaggacttgtcctgacgtctcgcatcctgtggttc180

ttcagccggttgtataatcaactgcgcaaagaagagtttatcgaatttgcggatcatgcg240

tatgaatttctgacagataaactgctggataaagaaaatggcggcttcttctggcatgtc300

gattataagggagatccgttagataaacgcaaacatctgtatggccaagcgtttgcgctg360

tatggcctttcagaatattacaaggcgacgaagaaaaaggaatctctggaactgagcctt420

gaactttacaaaacaatcgaagaacggtgcaaagataatatcggctataaggaagaattt480

gaagaaaagtggacacctaaagaaaatattattgtctcagaatatggcattatttgcgaa540

ctttctatgaatacgttacttcatctgcttgaagcgtatacgaatttgtatacagcaact600

tacgatcttagcgttcgcaaagaactggaaaatctgatcatcctgtttaaagaaaaaatc660

tataatcctaaaacggatcatctgtatgtggaattcgataacaagatgaaaccgattatc720

gatgcgattagctatggccatgatattgaagcgacgtggttgattgatgaagcacttcgg780

tatatcgaaaataacacacttatcaaagatatgacggaaatcaacttacgcatcgcggaa840

cgggtcctggaagaagcgtttgaaaataactcacggcttaacgaaaaagttcggggcgaa900

gtcaacaaagatagagtgtggtgggtccaagcagaagcgctgttgggctttcttaatgca960

tatcaaaaaacgaaatcagataaatttcttaaagcagtgctgagcctgtgggagtttatc1020

aacaactttctgttagataaacgccctaatggcgaatggtttaacaaactggatgaaaat1080

tgcattccgtttccgatgccggaagtcgatttgtggaaatgcccgtatcataatggccgc1140

atgtatcttgaagtcattcgtcgcatt1167

<210>3

<211>46

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

aagcttaaggaggatattatggatcttaaacatcttaaagatgaaa46

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

ggatccttaaatgcgacgaatgacttcaaga31

<210>5

<211>5748

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

aagcttctagattctcaaaaaatactacctgtcccttgctgatttttaaacgagcacgag60

agcaaaacccccctttgctgaggtggcagagggcaggtttttttgtttcttttttctcgt120

aaaaaaaagaaaggtcttaaaggttttatggttttggtcggcactgccgacagcctcgca180

gagcacacactttatgaatataaagtatagtgtgttatactttacttggaagtggttgcc240

ggaaagagcgaaaatgcctcacatttgtgccacctaaaaaggagcgatttaggcggcgtt300

ctgtttctgcttcggtatgtgattgtgaagctggcttacagaagagcggtaaaagaagaa360

ataaaaaagaaatcatcttttttgtttggaaagcgagggaagcgttcacagtttcgggca420

gctttttttataggaacattgatttgtattcactctgccaagttgttttgatagagtgat480

tgtgataattttaaatgtaagcgttaacaaaattctccagtcttcacatcggtttgaaag540

gaggaagcggaagaatgaagtaagagggatttttgactccgaagtaagtcttcaaaaaat600

caaataaggagtgtcaagaaagcttggtaataaaaaaacacctccaagctgagtgcgggt660

atcagcttggaggtgcgtttattttttcagccgtatgacaaggtcggcatcaggtgtgac720

aaatacggtatgctggctgtcataggtgacaaatccgggttttgcgccgtttggcttttt780

cacatgtctgatttttgtataatcaacaggcacggagccggaatctttcgccttggaaaa840

ataagcggcgatcgtagctgcttccaatatggattgttcatcgggatcgctgcttttaat900

cacaacgtgggagaattcctgttataaaaaaaggatcaattttgaactctctcccaaagt960

tgatcccttaacgatttagaaatccctttgagaatgtttatatacattcaaggtaaccag1020

ccaactaatgacaatgattcctgaaaaaagtaataacaaattactatacagataagttga1080

ctgatcaacttccataggtaacaacctttgatcaagtaagggtatggataataaaccacc1140

tacaattgcaatacctgttccctctgataaaaagctggtaaagttaagcaaactcattcc1200

agcaccagcttcctgctgtttcaagctacttgaaacaattgttgatataactgttttggt1260

gaacgaaagcccacctaaaacaaatacgattataattgtcatgaaccatgatgttgtttc1320

taaaagaaaggaagcagttaaaaagctaacagaaagaaatgtaactccgatgtttaacac1380

gtataaaggacctcttctatcaacaagtatcccaccaatgtagccgaaaataatgacact1440

cattgttccagggaaaataattacacttccgatttcggcagtacttagctggtgaacatc1500

tttcatcatataaggaaccatagagacaaaccctgctactgttccaaatataattccccc1560

acaaagaactccaatcataaaaggtatatttttccctaatccgggatcaacaaaaggatc1620

tgttactttcctgatatgttttacaaatatcaggaatgacagcacgctaacgataagaaa1680

agaaatgctatatgatgttgtaaacaacataaaaaatacaatgcctacagacattagtat1740

aattcctttgatatcaaaatgaccttttatccttacttctttctttaataatttcataag1800

aaacggaacagtgataattgttatcataggaatgagtagaagataggaccaatgaatata1860

atgggctatcattccaccaatcgctggaccgactccttctcccatggctactatcgatcc1920

aataagaccaaatgctttacccctattttcctttggaatatagcgcgcaactacaaccat1980

tacgagtgctggaaatgcagctgcaccagccccttgaataaaacgagccataataagtaa2040

ggaaaagaaagaatggccaacaaacccaattaccgacccgaaacaatttattataattcc2100

aaataggagtaaccttttgatgcctaattgatcagatagctttccatatacagctgttcc2160

aatggaaaaggttaacataaaggctgtgttcacccagtttgtactcgcaggtggtttatt2220

aaaatcatttgcaatatcaggtaatgagacgttcaaaaccatttcatttaatacgctaaa2280

aaaagataaaatgcaaagccaaattaaaatttggttgtgtcgtaaattcgattgtgaata2340

ggatgtattcacatttcaccctccaataatgagggcagacgtagtttatagggttaatga2400

tacgcttccctcttttaattgaaccctgttacattcattattcattacacttcataatta2460

attcctcctaaacttgattaaaacattttaccacatataaactaagttttaaattcagta2520

tttcatcacttatacaacaatatggcccgtttgttgaactactctttaataaaataattt2580

ttccgttcccaattccacattgcaataatagaaaatccatcttcatcggctttttcgtca2640

tcatctgtatgaatcaaatcgccttcttctgtgtcatcaaggtttaattttttatgtatt2700

tcttttaacaaaccaccataggagattaaccttttacggtgtaaaccttcctccaaatca2760

gacaaacgtttcaaattcttttcttcatcatcggtcataaaatccgtatcctttacagga2820

tattttgcagtttcgtcaattgccgattgtatatccgatttatatttatttttcggtcga2880

atcatttgaacttttacatttggatcatagtctaatttcattgcctttttccaaaattga2940

atccattgtttttgattcacgtagttttctgtattcttaaaataagttggttccacacat3000

accaatacatgcatgtgctgattataagaattatctttattatttattgtcacttccgtt3060

gcacgcataaaaccaacaagatttttattaatttttttatattgcatcattcggcgaaat3120

ccttgagccatatctgacaaactcttatttaattcttcgccatcataaacatttttaact3180

gttaatgtgagaaacaaccaacgaactgttggcttttgtttaataacttcagcaacaacc3240

ttttgtgactgaatgccatgtttcattgctctcctccagttgcacattggacaaagcctg3300

gatttacaaaaccacactcgatacaactttctttcgcctgtttcacgattttgtttatac3360

tctaatatttcagcacaatcttttactctttcagcctttttaaattcaagaatatgcaga3420

agttcaaagtaatcaacattagcgattttcttttctctccatggtctcacttttccactt3480

tttgtcttgtccactaaaacccttgatttttcatctgaataaatgctactattaggacac3540

ataatattaaaagaaacccccatctatttagttatttgtttggtcacttataactttaac3600

agatggggtttttctgtgcaaccaattttaagggttttccaatactttaaaacacataca3660

taccaacacttcaacgcacctttcagcaactaaaataaaaatgacgttatttctatatgt3720

atcaagataagaaagaacaagttcaaaaccatcaaaaaaagacaccttttcaggtgcttt3780

ttttattttataaactcattccctgatctcgacttcgttctttttttacctctcggttat3840

gagttagttcaaattcgttctttttaggttctaaatcgtgtttttcttggaattgtgctg3900

ttttatcctttaccttgtctacaaaccccttaaaaacgtttttaaaggcttttaagcgtc3960

tgtacgttccttaaggaattattccttagtgctttctaggttaatgtcatgataataatg4020

gtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtccgcggaacccctatttgtatt4080

tatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgc4140

ttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattc4200

ccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaa4260

aagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcg4320

gtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaag4380

ttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgcc4440

gcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatctta4500

cggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactg4560

cggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcaca4620

acatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccatac4680

caaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactat4740

taactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcgg4800

ataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgata4860

aatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggta4920

agccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaa4980

atagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaag5040

tttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctagg5100

tgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccact5160

gagcgtcagaccccttaataagatgatcttcttgagatcgttttggtctgcgcgtaatct5220

cttgctctgaaaacgaaaaaaccgccttgcagggaggtttttcgaaggttctctgagcta5280

ccaactctttgaaccgaggtaactggcttgcaggagcgcagtcaccaaaacttgtccttt5340

cagtttagccttaaccggcgcatgacttcaagactaactcctctaaatcaattaccagtg5400

gctgctgccagtggtgcttttgcatgtctttccgggttggactcaagacgatagttaccg5460

gataaggcgcagcggtcggactgaacggggggttcgtgcatacagtccagcttggagcga5520

actgcctacccggaactgagtgtcaggcgtggaatgagacaaacgcggccataacagcgg5580

aatgacaccggtaaaccgaaaggcaggaacaggagagcgcacgagggagccgccaggggg5640

aaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccaccactgatttgagcgtcagat5700

ttcgtgatgcttgtcagggggcggagcctatggaaaaacgctttgccc5748