利用CRISPR/Cas9技术对葡萄ZEP基因定点编辑方法与流程

本发明涉及植物基因工程技术，尤其是涉及葡萄zep基因定点编辑方法。

背景技术：

近几年来，crispr/cas9基因组编辑技术发展迅速，已逐步成为生物学研究领域的前沿和热点。该技术通过对基因组位点的精确编辑，实现靶dna片段的敲除或插入，继而改变基因性状，为分子育种开辟新的研究思路。截至目前，基于crispr/cas9技术的分子育种研究已先后在水稻、油菜、番茄等植物上开展，且取得良好效应。li等人将myb25基因的两个sgrna：ghmyb25-like-sgrna1和ghmyb25-like-sgrna2设计在一个相同的基因组区，分别诱导两个cas9，从而高效率的敲除棉花的myb25基因，得到了两个靶标位点的碱基以及其中间的染色体片缺失的结果，脱靶效率也极低。ren等人利用crispr/cas9系统对“霞多丽”葡萄的悬浮细胞及愈伤组织中的l-二酸脱氢酶基因(idndh)进行基因组编辑和靶向突变，突变频率为100％，并且得到了突变体的再生植株。葡萄作为重要的果树植物之一，借助基因组编辑开展新品种选育具有重要的应用价值。目前对葡萄zep基因进行编辑还未见报道。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明利用crispr/cas9技术，针对葡萄zep基因，通过筛选、设计sgrna，进一步构建重组质粒，以含有该重组质粒的农杆菌侵染葡萄无菌苗子叶胚筛选后获得突变的转基因葡萄植株。

本发明的技术方案是提供一种利用crispr/cas9技术对葡萄zep基因定点编辑方法，其中，sgrna包括zep-grna1和zep-grna2，zep-grna1序列如seqidno:1所示，zep-grna2序列如seqidno:2所示。

zep-grna1的引物序列如下

zep-grna1-f(seqidno:3):taggtctcccacaccagcgccgcgttttagagctag；

zep-grna1-r(seqidno:4):cgggtctcatgtggcttcatgcaccagccggg；

zep-grna2的引物序列如下

zep-grna2-f(seqidno:5):taggtctccgtgaccggattaatgttttagagctag；

zep-grna2-r(seqidno:6):cgggtctcatcaccagtgatgcaccagccggg。

将两个sgrna通过pcr重组到一起，并与载体片段pgrebn进行连接，构建得到含有葡萄zep基因靶序列的质粒pgrebn-zep；用含有pgrebn-zep质粒的农杆菌gv3101侵染葡萄无菌苗子叶胚，通过卡那霉素进行筛选，再获得突变的转基因葡萄植株；最后利用葡萄zep基因的特异性引物，zep1-f(seqidno:7)：ttctcagacccacatcccaa；zep1-r(seqidno:8)：acctcctcagcaacctccat；zep2-f(seqidno:9)：ggcagcgaagaagaagggtt；zep2-r(seqidno:10):ccgcaggagtgaatgtatca扩增基因组片段进行预测，筛选突变植株。

本发明的优点和有益效果：精准定位选择葡萄zep基因的第一个外显子上的序列作为靶位点序列，该段序列能够成功被cas9识别，以该靶位点序列为基础设计sgrna，靶位点序列可被准确敲除，脱靶效率低，实现对葡萄zep基因进行定点编辑，对葡萄育种具有重要作用。

附图说明

图1是本发明两个sgrna的pcr扩增电泳图。

图2是对转化菌株中重组质粒的目标条带进行检测的电泳图。

图3是农杆菌转化葡萄无菌苗子叶胚后培养所得的突变体新芽照片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

本发明提供一种利用crispr/cas9技术对葡萄zep基因定点编辑方法，包括筛选设计sgrna，将sgrna连接到载体质粒上，将重组质粒转化入农杆菌活化农杆菌后进行培养，通过培养所得的菌株侵染葡萄无菌苗子叶胚，培养侵染的葡萄无菌苗子叶胚得到植株。现有技术中没有关于葡萄zep基因编辑的公开文献，crispr/cas9基因定点编辑这一技术的难点在于找到基因序列中可被cas9识别的序列，同时该序列易于进行敲除或者加入的编辑过程，准确率和脱靶效率必须良好，易于顺利进行重组克隆。申请人发现葡萄zep基因的第一个外显子上，pam序列的前20nt序列片段即具备上述特点，不但可被cas9识别，而且脱靶效率低，能够成功得到突变葡萄植株，因此上述序列片段适宜作为靶位点序列，并结合脱靶效率和编辑效率，设计了zep-grna1和zep-grna2。以下以具体操作过程对本发明进行详细说明，本发明项目基础为浙江省“生物工程”重中之重学科学生创新计划项目(cx2017011)。

实施例1

结合葡萄全基因组测序结果，对从“夏黑”葡萄中克隆得到的vvzep基因做结构分析，发现其第一个外显子能够作为靶位点。随后利用在线设计工具crispr-p(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)在zep基因的第一个外显子中设计两个sgrna，分别为zep-grna1和zep-grna2，zep-grna1序列为seqidno:1：tgaagccacaccagcgccgc或tgaagccacaccagcgccgg，zep-grna2序列为seqidno:2：tcactggtgaccggattaat或tcactggtgaccggattggg。以pgtr为模板，分别扩增zep-grna1和zep-grna2。其中zep-grna1的上下游引物为zep-grna1-f(seqidno:3)和zep-grna1-r(seqidno:4)，zep-grna2的上下游引物为zep-grna2-f(seqidno:5)和zep-grna2-r(seqidno:6)

扩增体系为模板1ng，上下游引物各2μl，2×estaqmastermix25μl，ddh2o加至50μl。pcr条件为60℃，34个循环，其他与普通pcr条件相同。将pcr进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，100v电泳30min后，检测条带的大小和完整性，如图1所示，结果显示所得序列大小正确，为目的序列。并在紫外分析仪上进行割胶，将切下的凝胶放在离心管中称重，并用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行胶回收。

分别用bsai酶、t7dna连接酶对两个sgrna进行酶切连接，产物以s5ad5-f、s3ad5-r(s5ad5-f、s3ad5-r参见boostingcrispr/cas9multiplexeditingcapabilitywiththeendogenoustrna-processingsystem，xiek,minkenbergb,yangy，procnatlacadsciusa，2015，vol.112，no.11，p3570-3575)为引物做pcr，循环条件：94℃，2min；(94℃,30s；60℃，30s；72℃,30s)34个循环，72℃，5min。利用pcr产物纯化试剂盒进行pcr产物纯化回收。上述pcr产物用foki酶切，得酶切产物i。

取2-3μgprgebn载体，加入1μl的bsai酶以及10×catsmartbuffer5μl，加ddh2o至20μl，在37℃条件下，过夜充分酶切。后在酶切产物中加入1μlcip去磷酸化酶，在37℃条件下，继续酶切1h，得酶切产物ii。

将酶切产物i和ii分别取1μl，混合，加入t4dna连接酶以及t4buffer各0.5μl，ddh2o2μl，在16℃条件下连接16h以上，得到重组载体pgrebn-zep。

实施例2

将重组载体pgrebn-zep转入到农杆菌gv3101中：取-80℃保存的农杆菌感受态稍稍加温(例如于手心片刻)待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰上；每100μl感受态加入0.5-1μg重组载体pgrebn-zep，用手轻拨打管底混匀，依次在冰上静置5min、液氮5min、37℃金属浴5min、冰浴5min；加入700μl无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养2-3h；6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打混匀菌液并涂布于含有50mg/lkan的lb培养基上，倒置放于28℃培养箱培养48h。

活化农杆菌：从平板上挑取单菌落接种于5mllb液体培养基中，28℃，150r/min振荡培养20h，按1:100接种于lb液体培养基中，培养至od600为0.6，将其离心收菌，用ms培养液(含有50μm/las(乙酰丁香酮))悬浮于菌液，28℃振荡培养1h左右，以活化菌株；并对转化菌株中的目标位置条带，利用pgrebn-zep载体的特异性引物(rgebn-f：cccacatcggtcctgtacag(seqidno:11))、rgebn-r(atacaagaaattccgaagagcaac(seqidno:12))进行检测，如图2所示，结果显示条带大小正确，为目的序列。

实施例3

用活化后的农杆菌转化葡萄无菌苗子叶胚：在无菌条件下，将无菌苗子叶胚剪下，放在装有ms培养液(含有50μm/las)的三角瓶中备用，在农杆菌活化好后，倒掉三角瓶中的ms培养液，倒入活化的农杆菌侵染无菌苗子叶胚，恒温摇床8min，去除菌液，吸干表面残留菌液，接种于共培养基：ms+1.0mg/l6-ba+0.02mg/lnaa+50μm/las上，25℃黑暗条件下培养3d。然后将所得的外植体转入恢复培养基：ms+1.0mg/l6-ba+0.02mg/lnaa+300mg/l青霉素上，黑暗培养7d，再转入筛选培养基：ms+1.0mg/l6-ba+0.02mg/lnaa+300mg/l青霉素+100mg/lkan上暗培养13d，后转为光照培养，直至长出抗性的新芽，如图3所示，说明通过crispr/cas9技术成功得到了葡萄突变体，最后转入生根筛选培养基，直至长出完整的抗性植株。提取植株dna，并利用葡萄zep基因的特异性引物(zep1-f(seqidno:7)、zep1-r(seqidno:8)、zep2-f(seqidno:9)、zep2-r(seqidno:10))筛选突变植株。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物基因工程领域的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。