一种低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物检测
技术领域：
，具体涉及一种低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其应用。
背景技术：
：人血清中的脂蛋白根据密度不同，主要分为：乳糜微粒(chylomicrons，cm)、极低密度脂蛋白(very-low-densitylipoprotein，vldl)、中间密度脂蛋白(intermediate-densitylipoprotein，idl)、低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein，ldl)和高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein，hdl)。其中，ldl颗粒中含胆固醇约50％，是血液中胆固醇含量最多的脂蛋白，故称为富含胆固醇的脂蛋白，它是人体组织吸收内源性胆固醇和胆固醇酯的主要载体。胆固醇又称胆甾醇，以游离胆固醇的形式或以和脂肪酸结合的胆固醇酯的形式存在于血液脂蛋白中，例如：低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、极低密度脂蛋白胆固醇(vldl-c)等。baigent等人研究发现，ldl-c是引发动脉粥样硬化性心血管疾病(atheroscleroticcardiovasculardisease，ascvd)重要的危险因素之一(baigentc,keecha,kearneypm,etal.efficacyandsafetyofcholesterol-loweringtreatment:prospectivemeta-analysisofdatafrom90056participantsin14randomisedtrialsofstatins.lancet,2005,366:1267-1278.)。因此，临床上将ldl-c的高低作为冠心病和动脉粥样硬化的辅助诊断指标之一。根据我国《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》提出的临床血脂测定建议，血清ldl-c的测定主要使用匀相法，包括透射比浊法、表面活性剂清除法、过氧化氢酶清除法、可溶性反应法等。比如，中国专利cn100365409c公开了一种测定低密度脂蛋白胆固醇的试剂及制备方法，该试剂性质稳定、适用各种型号的全自动生化分析仪；但是，试剂中含有多种防腐剂，对试剂中的酶类活性抑制较大，灵敏度较差。再如，中国专利cn107505272a公开了低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其使用方法，该试剂盒使用过氧化氢酶清除法测定血清中的ldl-c的含量。但是，该试剂盒使用的多聚阴离子表面活性剂在碱性水溶液中稳定性较差，进而影响对非ldl脂蛋白的清除作用，故而该试剂盒难以准确地进行ldl-c的含量测定。因此，急需一种灵敏度高、准确性强的低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对目前低密度脂蛋白胆固醇的检测步骤较为繁杂，特别是现有技术存在试剂灵敏度低、准确性差的问题。本发明提供的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒具有操作简单，检测效率及准确率高的优点。为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案实现：一方面，本发明提供了一种低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，所述的试剂盒包括试剂r1和试剂r2；所述的试剂r1包括：表面活性剂a、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林、氯化镁和缓冲液；所述的试剂r2包括：表面活性剂b、显色剂、氯化镁和缓冲液。其中，所述的试剂r2还包括松三糖和乳果糖。优选地，所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，所述的试剂r1包括：表面活性剂a80.0-120.0mmol/l、胆固醇酯酶1.0-6.0ku/l、胆固醇氧化酶1.0-10.0ku/l、过氧化物酶8.0-30.0ku/l、4-氨基安替比林0.2-1.5mmol/l、氯化镁5.0-15.0mmol/l、ph值为7.0的缓冲液10.0-50.0mmol/l，；所述的试剂r2包括：表面活性剂b50.0-150.0mmol/l、显色剂1.0-10.0mmol/l、氯化镁5.0-15.0mmol/l、ph值为7.0的缓冲液10.0-50.0mmol/l、松三糖0.5-1.5g/l和乳果糖0.2-1.0g/l。更优选地，所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，所述的试剂r1包括：表面活性剂a90.0-110.0mmol/l、胆固醇酯酶1.5-3.0ku/l、胆固醇氧化酶3.0-6.0ku/l、过氧化物酶12.0-20.0ku/l、4-氨基安替比林0.5-1.0mmol/l、氯化镁8.0-12.0mmol/l和ph值为7.0的缓冲液15.0-35.0mmol/l；所述的试剂r2包括：表面活性剂b80.0-120.0mmol/l、显色剂2.0-6.0mmol/l、氯化镁8.0-12.0mmol/l、ph值为7.0的缓冲液15.0-35.0mmol/l、松三糖0.4-0.8g/l和乳果糖0.4-0.7g/l。其中，所述的表面活性剂a为胆酸钠、磺酸盐和硫酸葡聚糖中的一种或几种；优选地，所述的表面活性剂a为胆酸钠。其中，所述的表面活性剂b为曲拉通x-100、吐温-20和span-60中的一种或几种；优选地，所述的表面活性剂b为曲拉通x-100。其中，所述的显色剂为2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠、苯酚和4-氯苯酚中的一种或几种；优选地，所述的显色剂为2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠。其中，所述的缓冲液为3-吗啉丙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液中的一种或几种。优选地，所述的缓冲液为3-吗啉丙磺酸缓冲液。进一步优选地，所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，所述的试剂r1包括：胆酸钠100.0mmol/l、胆固醇酯酶2.0ku/l、胆固醇氧化酶5.0ku/l、过氧化物酶15.0ku/l、4-氨基安替比林0.6mmol/l、氯化镁10.0mmol/l和ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液20.0mmol/l；所述的试剂r2包括：曲拉通x-100100.0mmol/l、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠4.0mmol/l、氯化镁10.0mmol/l、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液20.0mmol/l、松三糖1.0g/l和乳果糖0.5g/l。所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，还包括低密度脂蛋白胆固醇标准品冻干粉2g，需用生理盐水溶解后使用。本发明还提供了一种低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒的使用方法：本试剂盒适用于杜邦ar、日立7080/7170/7600/7180、迈瑞bs320、迪瑞cs600、雅培c8000、东芝tba40fr、奥林巴斯au2700、贝克曼dxc800、西门子advia2400、罗氏p800等全自动生化分析仪。该测定试剂盒的测定方法为两点终点法，反应方向为升反应：(1)将300μl试剂r1和3μl待测样本混合均匀，37℃孵育5min后得到反应液1，测定吸光度a1，测定主波长为546nm、次波长为660nm；(2)加入100μl试剂r2混合均匀，反应5min，得到反应液2，测定吸光度a2，测定主波长为546nm、次波长为660nm；(3)按照步骤(1)-(2)，对不同浓度的低密度脂蛋白胆固醇标准品的吸光度进行测定，得到吸光度a空白和a标准；(4)以标准品的吸光度变化值δa(a标准-a空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度c为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程；(5)计算样本的吸光度变化值δa(a2-a1)，根据标准曲线方程，得到样本中低密度脂蛋白胆固醇浓度。本发明与现有技术相比，本发明的有益效果有：(1)本发明提供的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分简单，各试剂组分以较优浓度进行配比，具有线性范围可达13.0mmol/l；(2)本发明通过向试剂r2中加入松三糖和乳果糖，使得试剂盒的灵敏度显著增加；(3)本发明提供的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，非离子表面活性剂在溶液中稳定性高、不易受强电解质无机盐和酸碱的影响；其中：试剂1中的非离子表面活性剂(胆酸钠)，可以选择性地保护ldl，清除非ldl(hdl、vldl、cm)减少其对ldl-c含量测定的干扰；试剂2中的非离子表面活性剂(曲拉通x-100)能够打开ldl，使ldl-c与胆固醇酶反应而显色；(4)本发明提供的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒准确度高，理论浓度与实测浓度的线性相关系数r≧0.9950；(5)本发明提供的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，所需标本量少(3μl血清即可)，且基本不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素等影响；当血红蛋白、甘油三酯、胆红素分别高至5g/l、18.2mmol/l和250μmol/l时，对ldl-c测定无明显影响。附图说明图1为低密度脂蛋白胆固醇标准曲线；图2为本发明低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒线性范围图。具体实施方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。测试条件与方法：仪器：日立7080全自动生化分析仪参数：主波长546nm样品3μl次波长660nm试剂1300μl反应温度37℃试剂2100μl反应方向升反应反应类型终点法操作步骤：实施例1本实施例的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：试剂r1包括：磺酸盐80.0mmol/l、胆固醇酯酶1.0ku/l、胆固醇氧化酶1.0ku/l、过氧化物酶8.0ku/l、4-氨基安替比林0.2mmol/l、氯化镁5.0mmol/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液10.0mmol/l；试剂r2包括：吐温-2050.0mmol/l、苯酚1.0mmol/l、氯化镁5.0mmol/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液10.0mmol/l、松三糖0.5g/l和乳果糖0.2g/l。实施例2本实施例的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：试剂r1包括：硫酸葡聚糖120.0mmol/l、胆固醇酯酶6.0ku/l、胆固醇氧化酶10.0ku/l、过氧化物酶30.0ku/l、4-氨基安替比林1.5mmol/l、氯化镁15.0mmol/l、ph值为7.0的硼酸盐缓冲液50.0mmol/l；试剂r2包括：span-60150.0mmol/l、4-氯苯酚10.0mmol/l、氯化镁15.0mmol/l、ph值为7.0的硼酸盐缓冲液50.0mmol/l、松三糖1.5g/l和乳果糖1.0g/l。实施例3本实施例的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：试剂r1包括：胆酸钠90.0mmol/l、胆固醇酯酶1.5ku/l、胆固醇氧化酶3.0ku/l、过氧化物酶12.0ku/l、4-氨基安替比林0.5mmol/l、氯化镁8.0mmol/l和ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液15.0mmol/l；试剂r2包括：曲拉通x-10080.0mmol/l、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠2.0mmol/l、氯化镁8.0mmol/l、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液15.0mmol/l、松三糖0.4g/l和乳果糖0.4g/l。实施例4本实施例的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：试剂r1包括：胆酸钠110.0mmol/l、胆固醇酯酶3.0ku/l、胆固醇氧化酶6.0ku/l、过氧化物酶20.0ku/l、4-氨基安替比林1.0mmol/l、氯化镁12.0mmol/l和ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液35.0mmol/l；试剂r2包括：曲拉通x-100120.0mmol/l、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠6.0mmol/l、氯化镁12.0mmol/l、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液35.0mmol/l、松三糖0.8g/l和乳果糖0.7g/l。实施例5本实施例的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：试剂r2包括：胆酸钠100.0mmol/l、胆固醇酯酶2.0ku/l、胆固醇氧化酶5.0ku/l、过氧化物酶15.0ku/l、4-氨基安替比林0.6mmol/l、氯化镁10.0mmol/l和ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液20.0mmol/l；试剂r2包括：曲拉通x-100100.0mmol/l、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠4.0mmol/l、氯化镁10.0mmol/l、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液20.0mmol/l、松三糖1.0g/l和乳果糖0.5g/l。对比例1中国专利cn102539731a所述试剂盒。对比例2与实施例1相比，试剂r2不含松三糖和乳果糖。对比例3与实施例1相比，试剂r2不含松三糖。对比例4与实施例1相比，试剂r2不含乳果糖。实验例1低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒标准曲线采用低密度脂蛋白胆固醇标准品，浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mmol/l，以实验例5为例，按照上述测定步骤得到，测定低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒标准曲线(如图1所示)。其中，标准品的吸光度变化值δa(a标准-a空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度c为横坐标，标准曲线方程：y＝0.1004x+0.0025，r2＝0.9987。实验例2低密度脂蛋白胆固醇试剂盒线性范围的测试使用生理盐水分别配制浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、13.0mmol/l的低密度脂蛋白胆固醇标准品，分别用实施例1-5所述试剂和对比例1测定ldl-c含量，结果如表1所示：表1线性范围对比结果表明：在0-13.0mmol/l浓度范围内，本发明试剂盒的测试纸能够达到理论值且二者相关性较好(图2)，而对比例在样本浓度为10.0mmol/l时，测试结果明显低于理论值，不能满足要求，由此可见本试剂盒的线性范围较广。实验例3低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒最低检测限以实施例5为例，采用生理盐水作为空白样本，连续检测20次。计算20次结果的均值与标准差sd，以空白均值加两倍标准差为试剂盒的检测限(+2sd)。试验结果通过试验数据得出(如表2所示)，本发明低密度脂蛋白胆固醇测定剂盒的的最低检测限0.015mmol/l。实施例1-4的最低检测限分别为0.035、0.027、0.026、0.018和0.019mmol/l。表2低密度脂蛋白胆固醇测定剂盒最低检测限实验例4低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒灵敏度测定空白液和3个不同ldl-c含量样品，每个样品测10次，计算吸光度平均值m和标准差(sd)，以样品吸光度-3sd大于空白吸光度+3sd的样品浓度作为ldl-c测定试剂盒的最低检测灵敏度。根据表3所示结果，试剂r2中添加松三糖和乳果糖后，试剂盒的灵敏度为0.10mmol/l左右，而未添加松三糖和乳果糖的对比例2试剂盒的灵敏度为0.20mmol/l以上，仅添加松三糖或乳果糖一种物质的对比例3和对比例4试剂盒的灵敏度为0.15mmol/l。由此可知，本发明创造性地添加了松三糖和乳果糖，明显提高了试剂盒的灵敏度。表3低密度脂蛋白胆固醇测定剂盒灵敏度实施例5干扰实验在正常血清中各自添加一定量血红蛋白、甘油三酯、胆红素，同时加入等体积的去离子水作为无干扰物血清，使用实施例1-5的ldl-c测定试剂盒，同时测定样本的浓度。以干扰程度为5％为测定系统对干扰物的最高忍受限，血清中血红蛋白5g/l以下、甘油三酯18.2mmol/l以下和胆红素250μmol/l以下，不影响ldl-c测定结果。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12