熔融电纺三维打印制备的腱骨联合三相支架的制作方法

本发明属于医疗技术领域，具体涉及熔融电纺三维打印制备的腱骨联合三相支架。

背景技术：

腱骨联合损伤是一种常见的运动损伤之一，也是临床软组织损伤中的常见类型，其发病率有逐年上升趋势，对于腱骨联合缺损，目前的治疗方法主要通过借助外科缝合技术将正常的肌腱、韧带直接固定于骨上，尽量恢复该区域正常功能；

然而这种治疗方法，腱骨联合点早期会被纤维瘢痕组织填充，无法恢复对缺损区域骨、软骨、肌腱的梯度结构，再生的纤维瘢痕组织不能有效的分散应力，且在恢复正常活动后，该组织容易再次断裂，因此，在治疗上，除了提高手术技巧和康复计划外，需要一种有效的方法使得腱骨联合的骨、软骨、肌腱的梯度结构得到完全重建，组织工程技术为临床肌腱修复提供了一种理想、符合生理特点的方法，用组织工程技术修复缺损，即在体外培养少量的种子细胞，在扩增后和生物可降解支架结合成复合物，将其植入缺损部位后细胞增殖、分化、分泌基质，修复损伤组织，同时生物材料逐渐降解，最终达到生物学意义上的完全修复。

技术实现要素：

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明提供了熔融电纺三维打印制备的腱骨联合三相支架，包括以下步骤：

s1、细胞培植；

s2、支架制备；

s3、细胞种植。

优选的，所述s1步骤细胞培植的具体操作方法如下：

肌腱干细胞以含10％胎牛血清的dmem培养基培养于孵箱中，软骨细胞以含10％胎牛血清的f12培养基培养于孵箱中，骨髓干细胞以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子ctgf25ng/ml、抗坏血酸25um的α-mem培养基培养于孵箱中。

优选的，所述孵箱的温度为37℃，其中孵箱内有5％co2。

优选的，所述s2步骤支架制备包括模型的建立、材料的制备和设备的准备三道工序。

优选的，所述模型的建立是指使用三维打印软件建立打印模型，为多层长方形状，肌腱区、软骨区、骨区路径间隙各自根据需要进行调整，保存。

优选的，所述材料的制备是指量取适量的生物高分子材料a1、a2和a3，及微球b1、b2和b3，微球b1、b2和b3分别装载适量bmp2、ctgf、tgfβ1等细胞因子，得到微球b1’(b1+bmp2)、b2’(b2+tgfβ1)、b3’(b3+ctgf)，量取适量的微球分散剂，将分散剂均匀分散在水溶液中配成分散液，将微球b1’、b2’、b3’均匀分散于分散液中，分别用于制备骨区、软骨区和肌腱区。

优选的，所述生物高分子材料a1、a2和a3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成，所述微球b1、b2和b3由壳聚糖、海藻酸、甲基丙烯酸环氧丙脂、聚多巴胺、聚乳酸、聚己内酯、聚苯乙烯、聚丙烯酸、二氧化硅、脲醛树脂、环糊精、淀粉、白蛋白、明胶和苯乙烯-二乙烯基苯共聚物中的一种或几种构成，所述微球分散剂为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇中的一种或多种的混合物。

优选的，所述设备的准备是指调校熔融静电纺丝三维打印设备的工艺参数，将步骤二的生物高分子材料a1和b1’分别置入两外接料筒，使生物高分子材料a1与微球b1’进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒内混合，启动设备进行熔融静电纺丝三维打印，由骨区开始打印，当骨区制备完毕后，将料筒内的材料更换为a2、b2’，对软骨区进行打印，完毕后使用a3、b3’对肌腱区域进行打印，获得肌腱-软骨-骨三相一体支架。

优选的，所述熔融静电纺丝三维打印设备的工艺参数为：打印头直径为150-400μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000kpa，负高压模块电压为-2～-10kv，打印结构由打印路径控制，打印路径为0/90°，0/60°和0/60/120°。

优选的，所述s3步骤细胞种植的操方法为：取适量肌腱干细胞种植于肌腱支架区，取适量软骨细胞种植于软骨支架区，取适量骨髓干细胞种植于骨支架区。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过使用熔融静电纺丝三维打印技术，可以精确的控制纤维直径与打印路径，极大地提高打印精度，而使用含细胞因子微球的纺丝液进行电纺打印，可使我们获得含有大量细胞因子的电纺纤维，通过不同的三维打印路径参数，打印获得肌腱-软骨-骨三相支架，该方法所获得的支架具有骨-软骨-肌腱的组织梯度结构，且结构的精度高，同时携带大量具有细胞因子的微球进行缓释，促进细胞增殖修复，利于腱骨联合修复及正常功能恢复。

附图说明

图1为肌腱支架中的肌腱细胞活力mtt法检测结果图；

图2为三相一体支架各区培养后qrt-pcr检测结果图；

图3为三相一体支架拆分后各支架的力学压缩测试结果图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明提供以下技术方案：熔融电纺三维打印制备的腱骨联合三相支架，具体实施例如下：

具体的，肌腱干细胞以含10％胎牛血清的dmem培养基培养于孵箱中，软骨细胞以含10％胎牛血清的f12培养基培养于孵箱中，骨髓干细胞以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子ctgf25ng/ml、抗坏血酸25um的α-mem培养基培养于孵箱中。

具体的，使用三维打印软件建立打印模型，为多层长方形状，肌腱区、软骨区、骨区路径间隙各自根据需要进行调整，保存。

具体的，量取适量的生物高分子材料a1、a2和a3，及微球b1、b2和b3，微球b1、b2和b3分别装载适量bmp2、ctgf、tgfβ1等细胞因子，得到微球b1’(b1+bmp2)、b2’(b2+tgfβ1)、b3’(b3+ctgf)，量取适量的微球分散剂，将分散剂均匀分散在水溶液中配成分散液，将微球b1’、b2’、b3’均匀分散于分散液中，分别用于制备骨区、软骨区和肌腱区。

具体的，调校熔融静电纺丝三维打印设备的工艺参数，将步骤二的生物高分子材料a1和b1’分别置入两外接料筒，使生物高分子材料a1与微球b1’进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒内混合，启动设备进行熔融静电纺丝三维打印，由骨区开始打印，当骨区制备完毕后，将料筒内的材料更换为a2、b2’，对软骨区进行打印，完毕后使用a3、b3’对肌腱区域进行打印，获得肌腱-软骨-骨三相一体支架。

实施例2

将得到的三相一体支架各区分别种植相应细胞，放入培养箱中培养，以单纯聚己内酯三维打印得到的支架，分别种植肌腱干细胞、软骨细胞、骨髓干细胞为对照组，分别与三相支架各区作对比，分别培养1，3，5，7天后，利用mtt法检测肌腱支架中的肌腱细胞活力，检测结果如图1所示，带有细胞因子微球的熔融静电纺丝三维打印技术得到的支架上的细胞具有良好的增殖行为，细胞活力较好，且较对照组增殖行为更加显著。

实施例3

将得到的三相一体支架，各区分别种植相应细胞，进行qrt-pcr检测，以单纯聚己内酯三维打印得到的支架，分别种植肌腱干细胞、软骨细胞、骨髓干细胞为对照组作对比，分别培养7天后，进行qrt-pcr检测，检测结果如图2所示，实验组肌腱区肌腱相关产物(scx、tnmd)、软骨区软骨相关产物(sox9、aggrecan)、骨区骨相关产物(ocn、bmp4)表达明显较多。

实施例4

将得到的三相一体支架进行拆分，分为肌腱区支架、软骨区支架、骨区支架，肌腱区进行力学拉伸测试，软骨区、骨区放置于万能测试机上进行力学压缩测试，测得结果图3所示肌腱-软骨-骨三相一体支架力学性能较好。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。