一种改善结肠炎的IL-35重组乳酸菌的制作方法

本发明属生物技术领域，具体涉及一种改善结肠炎的il-35重组乳酸菌及其制备方法。

背景技术：

溃疡性结肠炎是一种特发性的结肠炎症性疾病，它不同于各种感染性结肠疾病，尽管病变征象有相似之处，但迄今的研究未能发现哪种致病菌是这类肠粘膜炎症的致病原。本病主要以结、直肠粘膜以及粘膜下层发生慢性、非特异性炎症性病变为中心，粘膜上皮及腺体破坏、增生或萎缩，炎性细胞浸润，隐窝脓肿形成，因而呈现粘膜充血、糜烂、溃疡以及增殖性改变。临床表现也体现了炎症性肠病的特点，出现脓血便或粘液血便、里急后重，或伴腹痛、发热等。本病常突发起病，病情轻重悬殊，多数病程缓慢，有反覆发作倾向，少数病例成急性暴发，病情凶险。溃疡性结肠炎是胃肠道最严重的疾病之一，近年来发病率逐渐升高，并且本病与结肠癌的发病也有一定的关系，因此被世界卫生组织列为现代难治病之一。

目前本病病因及确切发病机制至今未明，一般认为涉及到遗传、免疫、感染、精神等多方面因素，因此治疗上尚缺乏特异性措施。目前一般认为，炎症性肠病活动期的治疗目标是尽快控制炎症，缓解其临床症状；疾病缓解期则应继续其维持治疗，同时预防疾病复发，并且防治炎症性肠病并发症。对于该病的治疗，目前尚没有特效疗法。临床药物治疗主要有5-氨基水杨酸类制剂、糖皮质激素及免疫抑制和免疫调节剂等。这些治疗药物均存在一些副作用，故限制了其长期使用。因此，研制有效且副作用小的肠道微生态制剂对于预防和治疗结肠炎具有重要实际意义。

研究表明，溃疡性结肠炎患者或实验性结肠炎小鼠肠道组织中促炎性th17细胞比例显著增加，而抑炎性的treg细胞数量下降。通过降低th17细胞数量或增加treg数量能够有效的缓解结肠炎。进一步研究发现，il-35是treg细胞分泌的抑炎性细胞因子，能够抑制th17细胞的分化和增殖，同时il-35也能促进treg细胞的增殖。

乳酸菌作为人类和动物肠道中的正常菌群，被广泛地认为是安全级的微生物。采用重组dna技术，构建携带外源基因的乳酸菌表达载体，利用乳酸菌作为宿主菌，实现了功能性蛋白在乳酸菌中的表达，因此重组乳酸菌微生态制剂的研制和应用广为被接受。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种改善结肠炎的il-35重组乳酸菌及其制备方法。

重组ril-35基因，它的核苷酸序列如序列表seqidno.1所示。

携带ril-35基因的乳酸菌表达载体，它插入了序列表seqidno.1所示的基因；

所述的乳酸菌表达载体为大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体；

所述的大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体为pw425n。

携带ril-35基因的大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体的制备方法，它包括：

1）人工合成序列表seqidno.1所示的基因，上下游加入了sacii和smai酶切位点；

2）用sacii和smai酶切步骤1）所述的基因和pw425n；序列表seqidno.1所示的基因插入pw425n。

il-35重组乳酸菌，它转化了上述的携带ril-35基因的乳酸菌表达载体；

所述的乳酸菌为嗜酸乳酸杆菌。

il-35重组乳酸菌在制备改善或缓解结肠炎药物中的应用。

本发明提供了重组ril-35基因，它的核苷酸序列如序列表seqidno.1所示；携带ril-35基因的乳酸菌表达载体，它插入了序列表seqidno.1所示的基因；携带ril-35基因的大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体的制备方法，它包括：1）人工合成序列表seqidno.1所示的基因，上下游加入了sacii和smai酶切位点；2）用sacii和smai酶切步骤1）所述的基因和pw425n；序列表seqidno.1所示的基因插入pw425n；il-35重组乳酸菌，它转化了上述的携带ril-35基因的乳酸菌表达载体；il-35重组乳酸菌在制备改善或缓解结肠炎药物中的应用。

附图说明

图1il-35重组乳酸菌灌胃后肠道il-35水平检测结果；

图2il-35重组乳酸菌降低结肠炎小鼠体重损失率检测结果；

图3il-35重组乳酸菌维持结肠炎小鼠结肠长度检测结果；

图4il-35重组乳酸菌缓解结肠炎小鼠肠道组织病理变化检测结果；

图5il-35重组乳酸菌降低结肠炎小鼠肠道中th17细胞比例检测结果；

图6il-35重组乳酸菌增加结肠炎小鼠肠道中treg细胞比例检测结果。

具体实施方式

实施例1il-35重组乳酸菌的制备

il-35是ebi3和il-12ap35亚基组成的异源二聚体蛋白；选择编码ebi3的23位丙氨酸至228位脯氨酸肽段的基因序列（ala23-pro228，621bp），与编码il-12ap35亚基的23位精氨酸至215位丙氨酸肽段的基因序列（arg23-ala215，582bp），用常规的linker蛋白基因（45bp）将二者连接；采用人工合成或pcr技术的方式获得全长为1248bp的重组il-35基因，命名为ril-35，基因序列表如seqid1所示。

采用常规分子克隆技术构建携带ril-35基因的乳酸菌重组表达载体；本实施例中，在ril-35基因的上下游加入了sacii和smai酶切位点，采用pw425n乳酸菌表达载体，最终获得了pw425n/ril-35；采用但不限于嗜酸乳酸杆菌（lactobacillusacidophilus，lb.acidophilus）为受体菌，通过常规的乳酸菌电转化技术获得了分泌ril-35的重组嗜酸乳酸杆菌，命名为lb.acidophilus/ril-35。

实施例2il-35重组乳酸菌增加小鼠肠道il-35水平

将20只6-8周龄的c57bl/6j小鼠随机分成4组，每组10只(雌雄各半)。分别为pbs组、lb.acidophilus组（空菌组）、lb.acidophilus/pw425n组（空载体组）、lb.acidophilus/ril-35组和热灭活的lb.acidophilus/ril-35组（lb.acidophilus/ril-35i）。

pbs组以0.2mlpbs灌胃，其他组以0.2ml菌液灌胃。除pbs组外，菌体数量为每次10⁹cfu/ml。每周灌胃3次，连续灌胃3周后，每7天采样1次，记录为7d、14d和21d。采样部位为结肠组织，采用il-35elisa试剂盒，按照说明操作，检测结肠组织中il-35的水平。结果如图1所示，在相同采样时间内，lb.acidophilus/ril-35组小鼠结肠组织的il-35水平显著高于其他组，且随着采样时间的增加呈现显著上升趋势，而热灭活的lb.acidophilus/ril-35并不能显著增加小鼠结肠组织的il-35水平。结果表明，il-35重组乳酸菌增加了小鼠结肠组织的il-35水平。

实施例3il-35重组乳酸菌缓解实验性结肠炎

小鼠实验性结肠炎采用经典的dss诱导法。采用3%dss自由饮水造模，并将小鼠分为以下实验组：正常饮水组（ctr）、3%dss组、3%dss+lb.acidophilus/pw425n组、3%dss+lb.acidophilus/ril-35组、3%dss+lb.acidophilus/ril-35i组、3%dss+il35组（尾静脉注射il-35蛋白3μg/只/天）。造模期间，每天称量小鼠体重并计算体重损失率，采用便隐血试剂盒，按照说明操作评价小鼠便隐血情况，每天观察小鼠腹泻情况，并按照表1所述，计算小鼠疾病活动指数（diseaseactiveindex,dai）评分。在实验第7天，处死小鼠，摘取结肠，测量各组结肠长度，取结肠组织制备石蜡切片，通过he染色，比较各组小鼠结肠组织病理学变化。

结果表明，与ctr组相比，3%dss组、3%dss+lb.acidophilus/pw425n组和3%dss+lb.acidophilus/ril-35i组的小鼠体重损失率显著增加，而3%dss+lb.acidophilus/ril-35组和3%dss+il35组的小鼠体重损失率得以明显改善，且此两组间无显著差异（图2）。与ctr组相比，3%dss组、3%dss+lb.acidophilus/pw425n组和3%dss+lb.acidophilus/ril-35i组的小鼠的结肠长度显著降低，而3%dss+lb.acidophilus/ril-35组和3%dss+il35组的小鼠结肠长度的降低得以明显缓解，且此两组间无显著差异（图3）。与ctr组相比，3%dss组的小鼠结肠组织表现炎性细胞浸润、结肠组织破坏等病理变化，而3%dss+lb.acidophilus/ril-35组的小鼠结肠组织病理变化得以明显改善（图4）。说明il-35重组乳酸菌显著改善了小鼠实验性结肠炎，且效果与尾静脉注射il-35蛋白一致。

实施例4il-35重组乳酸菌增加结肠组织treg细胞比例，降低th17细胞比例

如实施例3所述的小鼠造模实验的第7天，采集结肠组织，消化后获得细胞结肠组织细胞悬液，分别采用anti-cd4-fitc和anti-foxp3-apc检测treg细胞比例，anti-cd4-fitc和anti-il17a-pe检测th17细胞比例。在此过程中，按照抗体使用说明书操作，先进行anti-cd4-fitc的表面染色30min，再采用bd公司的tfbuffer，按照说明书操作对细胞进行固定和透化，并分别采用anti-foxp3-apc或anti-il17a-pe染色45min，最后通过流式细胞术检测treg细胞和th17细胞的比例。

结果表明，与ctr组相比，3%dss组、3%dss+lb.acidophilus/pw425n组和3%dss+lb.acidophilus/ril-35i组的小鼠结肠组织中促炎性的th17细胞比例显著增加，而3%dss+lb.acidophilus/ril-35组和3%dss+il35组则显著降低（图5）。与ctr组相比，3%dss组、3%dss+lb.acidophilus/pw425n组和3%dss+lb.acidophilus/ril-35i组的小鼠结肠组织中抑炎性的treg细胞比例显著降低，而3%dss+lb.acidophilus/ril-35组和3%dss+il35组则显著增加（图6）。说明il-35重组乳酸菌增加实验性肠炎小鼠肠道组织中的抑炎性treg细胞数量，发挥抑制炎症作用。

序列表

<110>郝凤奇

<120>一种改善结肠炎的il-35重组乳酸菌

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1248

<212>dna

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