一种体外培养戊型肝炎病毒的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种戊型肝炎病毒在体外成功培养并连续复制的新方法。

背景技术：

戊型肝炎病毒（hepatitisevirus，hev）是一种经肠道传播的病毒性肝炎病原体，可以跨种间感染人和多种动物。hev为单股正链rna病毒，目前研究发现其主要有8种基因型（hev-1---hev-8），在中国主要流行基因4型hev毒株（hev-4）。现已证实hev传播途径主要为粪--口途径，也可通过其他途径传播，如血液传播，接触传播，垂直传播，以及器官移植进行传播。

hev感染一般为急性自限性感染，患者在4-6周可自行排毒结束后康复。但对于免疫缺陷病人及老年人极易发展为慢性肝炎，并迅速发展为肝硬化和肝癌。据世界卫生组织统计，全球每年约有2000万人感染hev，造成约7万人死亡。此外孕妇感染hev致死率可高达25%，且常发生胎儿早产，流产，死胎及孕妇产后急性肝坏死等症状。戊型肝炎的防控形势已经迫在眉睫，发展有效的戊型肝炎疫苗已成为关系公众健康的急为紧迫的问题，而在这一过程中病毒培养至关重要。

病毒培养是研究病毒生物学特性，致病机理及疫苗研制的基础。一直以来，hev的体外培养都是研究的热点和难点，但由于hev不能在体外高效复制，严重阻碍了病毒复制机制的研究，进而阻滞了hev疫苗的研发。

虽然目前已经利用a549和plc/prf/5细胞系成功建立了hev细胞培养体系。但是还存在很多问题。一方面，目前建立的细胞培养体系所用细胞系均为癌细胞系，不能真实的反应正常机体感染hev后的相关症状，更不能采用癌细胞系进行hev疫苗的研发与生产。另一方面在使用现有的细胞培养体系时必须要接种较高滴度的病毒（10⁸拷贝/ml）才能在体外维持培养，此外在后代细胞悬液中病毒滴度会减低，不能稳定连续传代培养。基于hev细胞培养体系的不足，为了必须建立一种高效且稳定的hev体外培养体系。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高效稳定的戊型肝炎病毒（hepatitisevirus，hev）在体外培养的方法，该方法采用mdck细胞对hev毒株进行体外培养，发现病毒能够在mdck细胞中大量复制，且能够连续传代10次以上，为深入研究hev致病性以及疫苗的研发提供有效的体外实验模型。

本发明戊型肝炎病毒体外培养方法，采用如下步骤进行：

（1）将hev病毒悬液依次经0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌后，加入病毒悬液体积2～5%的双抗溶液，4～8℃处理2～3h，液氮中保存备用，经real-timeqpcr测定其病毒拷贝数为2.4×10⁴～3.3×10⁵拷贝数/ml，其中双抗溶液为含有400u/ml青霉素和1000u/ml链霉素的溶液；

（2）将mdck细胞按1.8×10⁵～2×10⁵/ml接种至10cm³的细胞培养瓶，用含体积百分比10%胎牛血清的dmem培养基在37℃、5%co2培养箱中静止培养细胞，直至细胞长成单层；

（3）按每瓶0.8～1ml的接种量，将步骤（1）hev病毒悬液接种至步骤（2）单层细胞中，置于35～37℃下孵育2～3小时，每15～30min轻微摇匀一次，使病毒充分吸附到细胞上；2～3小时后加入含体积百分比2%～5%胎牛血清的dmem培养基，同时添加终浓度为0.01mmol/lmgcl2保护病毒颗粒的完整性及增强病毒与细胞的吸附作用，置于37℃、5%co2培养箱中继续培养；

（4）接种hev病毒后每天观察mdck细胞是否出现病变现象，当mdck细胞出现80%-85%病变现象后，反复冻融，收集病变细胞及培养液，-80℃保存待用。

（5）采用上述培养方法发现mdck细胞可以支持戊型肝炎病毒体外培养并且可以连续传代10代以上，且使病毒复制效率增加至8.0×10⁵拷贝数/ml。

目前公开文献中虽然有关于hev细胞培养体系建立的报道，但这些已公开的细胞体系均采用癌细胞系，而且采用现有的细胞培养体系进行hev体外培养时必须要接种较高滴度的病毒（10⁸拷贝/ml）才能在体外维持培养，此外在后代细胞悬液中病毒滴度会减低，不能稳定连续传代培养；另外癌细胞系不能用于hev疫苗的研发与生产。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

（1）本发明采用mdck细胞，能够在体外连续传代培养；

（2）本发明采用mdck细胞进行hev体外培养后，可以大量检测到hev抗原，证实mdck细胞可以支持hev体外复制；

（3）本发明采用mdck细胞进行hev体外培养后，在连续10代以上细胞悬液中均能够检测到hevrna，且具有较高的病毒拷贝；

（4）本发明采用mdck细胞进行hev体外培养后，在后代细胞悬液中检测到高于接种量的病毒拷贝，证实mdck细胞可以支持hev的复制；

（5）本发明采用mdck细胞体外培养hev，后期可用于hev疫苗研发与生产。

附图说明

图1是本发明中rt-npcr检测培养上清中hevrna示意图；其中1为未感染的mdck细胞；2为hev感染的mdck细胞；

图2是本发明中rt-qpcr检测连续培养10代的培养上清中hev病毒拷贝示意图；

图3是本发明中使用的mdck细胞感染hev的免疫共聚焦示意图；其中上排图为正常mdck细胞，下排图为hev感染24小时后的mdck细胞。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实施例中主要采用常规的细胞生物学方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的。按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。

实施例1：mdck细胞体外培养戊型肝炎病毒

1、自液氮中取出mdck细胞（购买于美国atcc）立即放入37℃的温水中，使细胞悬液快速融化；1500转离心5分钟后，转移至10cm³细胞培养瓶中，加入含有体积百分比10％新生牛血清的dmem培养液（购买于gibcoinvitrogencorporation公司），于37℃培养，待长成致密单层后，用pbs（购买于gibcoinvitrogencorporation公司）洗细胞，胰酶-edta（购买于gibcoinvitrogencorporation公司）消化，加入上述培养液，置于37℃、5%co2培养箱中继续培养；

2、将收集到的用于hev分离的hev阳性粪便制备重量体积比10%的pbs（ph7.4）粪便悬液，剧烈震荡，使粪便乳化，经4℃，12000g离心10分钟，收集上清，依次经0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌，加入病毒溶液体积2%的双抗溶液（400u/ml青霉素和1000u/ml链霉素）4℃处理3h，液氮中保存备用，经real-timeqpcr测定其病毒拷贝数为2.4×10⁴拷贝数/ml，分离自中国云南昆明市hevrna阳性猪粪便样品，基因型为4型；

3、将实施例1中细胞（mdck细胞）按2×10⁵/ml接种至10cm³细胞培养瓶中，用含体积百分比10%胎牛血清的dmem培养基在37℃、5%co2培养箱中静止培养细胞，当细胞长至单层的70-80%，弃上清培养基，每个细胞培养瓶加1mlhev病毒悬液，置于37℃孵育2h，每隔30分钟轻微摇晃一次，使病毒充分吸附到细胞上，2小时后加入含体积百分比2%胎牛血清的dmem培养基，同时添加终浓度为0.01mmol/lmgcl2保护病毒颗粒的完整性及增强病毒与细胞的吸附作用，置于37℃、5%co2培养箱中继续培养；当细胞病变达到85%时反复冻融使细胞完全脱落，收获病毒；对应用上述培养方法获得的细胞悬液运用rt-pcr检测培养上清中有hev的rna（图1）；结果证实mdck细胞可以体外培养hev。

实施例2：mdck细胞体外连续培养戊型肝炎病毒

1、自液氮中取出mdck细胞（购买于美国atcc）立即放入37℃的温水中，使细胞悬液快速融化；1500转离心5分钟后，然后转移至10cm³细胞培养瓶中，加入含有体积百分比10％新生牛血清dmem（购买于gibcoinvitrogencorporation公司）培养液，置于37℃培养，待长成致密单层后，用pbs（购买于gibcoinvitrogencorporation公司）洗细胞，胰酶-edta（购买于gibcoinvitrogencorporation公司）消化，加入上述培养液，置于37℃、5%co2培养箱中继续培养；

2、将收集到的用于hev分离的hev阳性粪便制备重量体积比15%的pbs（ph7.4）粪便悬液，剧烈震荡，使粪便乳化，经4℃，12000g离心10min，收集上清，依次经过0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌，加入病毒溶液体积5%的双抗溶液（400u/ml青霉素和1000u/ml链霉素）6℃处理2h，液氮中保存备用，经real-timeqpcr测定其病毒拷贝数为3.1×10⁴拷贝数/ml；

3、将实施例1中细胞（mdck细胞）按1.8×10⁵/ml接种至10cm³细胞培养瓶中，用含质量百分比10%胎牛血清的dmem培养基在37℃、5%co2培养箱中静止培养细胞，当细胞长至单层的70-80%，弃上清培养基，每个细胞培养瓶中加0.9mlhev病毒悬液，置36℃孵育2.5h，每隔15分钟轻微摇晃一次，使病毒充分吸附到细胞上，3小时后加入含质量百分比5%胎牛血清的dmem培养基，同时添加终浓度为0.01mmol/lmgcl2保护病毒颗粒的完整性，置于37℃、5%co2培养箱中继续培养；当细胞病变达到83%时反复冻融使细胞完全脱落，收获病毒；

4、用步骤3中获得的hevmdck细胞培养上清接种新的mdck细胞，操作同步骤3，当细胞病变达到85%时反复冻融使细胞完全脱落，收获病毒，连续传代10代；

5、对应用上述培养方法获得的不同代次（10代）的hev体外细胞培养上清用rt-qpcr检测hev病毒拷贝（图2）。结果证实mdck细胞可以体外培养hev，并且能够有效传代10代以上。

实施例3：荧光共聚焦显微镜观察hev感染mdck细胞

1、自液氮中取出mdck细胞（购买于美国atcc）立即放入37℃的温水中，使细胞悬液快速融化；1500转离心5分钟后，然后转移至10cm³细胞培养瓶中，加入含有体积百分比10％新生牛血清dmem（购买于gibcoinvitrogencorporation公司）培养液，于37℃培养，待长成致密单层后，用pbs（购买于gibcoinvitrogencorporation公司）洗细胞，胰酶-edta（购买于gibcoinvitrogencorporation公司）消化，加入上述培养液，置于37℃、5%co2培养箱中继续培养；

2、将收集到的用于hev分离的hev阳性粪便制备重量体积比15%的pbs（ph7.4）粪便悬液，剧烈震荡，使粪便乳化，经4℃，12000g离心10min，收集上清，依次经过0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌，加入病毒溶液体积5%的双抗溶液（400u/ml青霉素和1000u/ml链霉素）6℃处理2h，液氮中保存备用，经real-timeqpcr测定其病毒拷贝数为2.8×10⁴拷贝数/ml；

3、将实施例2中细胞（mdck细胞）按1.9×10⁵/ml接种至6孔板中爬片，用含质量百分比10%胎牛血清的dmem培养基在37℃、5%co2培养箱中静止培养细胞，当细胞长至单层的70-80%，弃上清培养基，每孔中加0.8mlhev病毒悬液，置35℃孵育3h，每隔20分钟轻微摇晃一次，使病毒充分吸附到细胞上，2.5小时后加入含质量百分比3%胎牛血清的dmem培养基，同时添加终浓度为0.01mmol/lmgcl2保护病毒颗粒的完整性，置于37℃、5%co2培养箱中继续培养；

4、在培养24小时后，取出玻片，用pbs（购买于gibcoinvitrogencorporation公司）洗3次细胞，4%多聚甲醛，室温固定细胞15分钟，pbs洗三次。加入hevorf2单克隆抗体（mab8003,购买于美国millipore公司，用pbs1:200进行稀释），37℃处理1h；pbs洗三次，加入fluorescein(fitc)-conjugatedaffinipuregoatanti-mouseigg荧光二抗(购买于美国abcam公司，用pbs1:1000进行稀释)，室温放置45分钟；pbs洗三次，加入4',6-diamidino-2-phenylindole(dapi，1µg/ml)，室温放置15分钟；pbs洗三次，荧光共聚焦显微镜观察hevorf2衣壳蛋白表达情况（红色荧光，见图3）；结果证实：mdck细胞能够体外成功培养hev。