一种南瓜籽蛋白水解物及其制备方法与流程

本发明属于分离纯化技术领域，涉及一种南瓜籽蛋白水解物及其制备方法。

背景技术：

游离基是生命活动中所产生的，它在机体活动中有着重要的作用，但过量的游离基容易对人体形成氧化性的损伤。许多报道中也都指出了身体的衰老和患有的疾病都与游离基的氧化性能有关。抗氧化剂不仅可以去除氧游离基，还可以抑止、缓解氧化反应的速度。所以，近年来市场上出现了越来越多各种各样的抗氧化剂。现在的人们对食品安全的认识有了很大的提高，对合成的抗氧化剂也有着一定的了解，知道合成矿氧化剂具有一定的副作用。因此，天然抗氧化剂的研发也就顺理成章的成为新的焦点。很多的研究表示可食用性的抗氧化肽分子质量相对较低，具有较低的成本，容易被机体吸收，对身体健康安全无危害等特点，被认为是一种良好的天然抗氧化剂。在许多动物和植被蛋白以及它们的肽中发现了含有较高的抗氧化性能。

南瓜籽中含有许多的品质较好蛋白质，因此，研究一种具有高抗氧化性能的南瓜籽蛋白水解物及其制备方法具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种南瓜籽蛋白水解物及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种南瓜籽蛋白水解物的制备方法，其包括下述步骤：

步骤a，采用酶解法提取水解南瓜籽蛋白；

步骤b，将步骤a得到的蛋白水解物置于安有5-10kda超滤膜的超滤装置中超滤，取其截留分子量；依次采用安有3-5kda的超滤膜、1-3kda的超滤膜和小于1kda的超滤膜的超滤装置对剩余的水解物进行超滤，取其截留分子量，共获得四组不同的分子量肽段，冷冻干燥。

作为优选的技术方案：

如上所述的南瓜籽蛋白水解物的制备方法，所述步骤b具体为：将步骤a得到的蛋白水解物置于安有5-10kda超滤膜的超滤装置中超滤7-8h；依次采用安有3-5kda的超滤膜、1-3kda的超滤膜和小于1kda的超滤膜的超滤装置对剩余的水解物超滤7-8h，取其截留分子量肽段，冷冻干燥。

如上所述的南瓜籽蛋白水解物的制备方法，所述采用酶解法提取水解南瓜籽蛋白是指使用碱性蛋白酶或中性蛋白酶对南瓜籽蛋白进行水解。

如上所述的南瓜籽蛋白水解物的制备方法，所述步骤a包括下述步骤：

步骤一，南瓜籽粕粉的制备；

将南瓜籽在80-90℃下干燥1-3h至水分恒重，然后进行粉碎，索氏抽提进行除油，风干，最后过60-80目筛，得到南瓜籽粕粉；

步骤二，南瓜籽蛋白的制备；

将步骤一得到的南瓜籽粕粉分散于蒸馏水中，调节分散液ph值至8.5-9.5并保持不变，将分散液置于40-50℃水浴锅中搅拌1.5-2.5h，室温下静置1.5-2.5小时；以1500-2500r/min的转速离心10-40min，得到下层沉淀蛋白质；将下层沉淀蛋白质取出，冷冻干燥即得南瓜籽蛋白，其中蒸馏水的体积为南瓜籽粕体积的8-12倍；

步骤三，南瓜籽蛋白碱性蛋白酶水解物的制备；

取定量的步骤二得到的南瓜籽蛋白，溶解于蒸馏水，将溶解后的溶液置于搅拌器中，加入质量为南瓜籽蛋白的添加量的3-5％的碱性蛋白酶，调节溶液ph值为7.5-8.5并维持不变，水解反应3-5h；待水解反应结束之后再将升温90-100℃，反应10-20min使其中的酶失去活性；然后对溶液进行冷却，冷却后以7000-9000r/min的转速离心20-30min，取其上清液，冷冻干燥。

如上所述的南瓜籽蛋白水解物的制备方法，所述步骤一具体为：将南瓜籽在85℃条件下干燥2h至水分恒重，然后进行粉碎，索氏抽提除油至抽提剂清亮，玻璃棒检测无油，风干，过80目筛，得到南瓜籽粕粉；

所述步骤二具体为：将所述步骤一得到的粉碎过筛后的南瓜籽粕粉分散于体积为南瓜籽粕粉的10倍的蒸馏水中，调节分散液ph值为9并保持不变，将分散液置于45℃水浴锅中搅拌2h，室温下静置2小时；以2000r/min的转速离心30min，得到下层沉淀蛋白质；将下层沉淀蛋白质取出，冷冻干燥。

如上所述的南瓜籽蛋白水解物的制备方法，所述步骤三具体为：取定量的所述步骤二得到的南瓜籽蛋白，溶解于蒸馏水；将溶解后的溶液置于搅拌器中，加入质量为南瓜籽蛋白添加量的4％的碱性蛋白酶，然后调节溶液ph值为8.0并保持不变，水解反应4h；待水解反应结束之后再将温度调节至95℃，反应15min使其中的酶失去活性；然后对溶液进行冷却，冷却后以8000r/min的转速离心25min，取其上清液，冷冻干燥。

本发明还提供一种采用如上所述的南瓜籽蛋白水解物的制备方法制得的南瓜籽蛋白水解物，所述南瓜籽蛋白水解物的分子量小于3kda。

作为优选的技术方案：

如上所述的南瓜籽蛋白水解物，所述南瓜籽蛋白水解物的分子量小于1kda。

如上所述的南瓜籽蛋白水解物，所述蛋白水解物的组分主要为丙氨酸-谷氨酸、丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸、组氨酸-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-氢氧根、氨基-2-丁烯-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-组氨酸、氨基-2-丁烯-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-氢氧根和丝氨酸-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸中的一种或多种。

有益效果：

本文采用超滤技术和膜分离技术来分离南瓜籽蛋白的酶水解物，并通过分析其水解度、ace和orac等指标，研究南瓜籽蛋白水解物及其不同分子量肽段抗氧化的性能。结果显示，南瓜籽碱性蛋白酶水解中小于1kda组分活性较好，小于1kda的orac值为745.62μmolte/g。从测得的orac值可以看出南瓜籽蛋白水解物的抗氧化性能较强，在分子量肽段1-3kda时氧自由基吸附能力值最高，为787.18μmolte/g。其它的分子量肽段也有一定的抗氧化性能，其抗氧化性强弱为1-3kda>1kda>3-5kda>5-10kda>水解物。分离南瓜籽蛋白水解物获得的分离组分可以作为开发抗氧化剂相关功能的产品。

附图说明

图1为南瓜籽蛋白水解度曲线图；

图2为trolox标准曲线图；

图3为不同肽段orac值图；

图4为不同肽段ace值图；

图5为<1kda组分的tic图；图中纵坐标intensity是指强度，横坐标time是指时间；

图6为<1kda组分的一级质谱图；图中纵坐％intensity是指相对强度，横坐标mass/charge是指质荷比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的实施方案作详细的说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明的保护范围。

在一个示例中，本发明提供了一种南瓜籽蛋白水解物的制备方法，步骤如下：

步骤一，南瓜籽粕的制备

将南瓜籽干燥优选85℃，2h至水分恒重，水分含量6.88％，然后进行粉碎，除油(索氏抽提8-12h，或抽提剂清亮，玻璃棒检测无油)，风干，过80目筛，得到南瓜籽粕粉；

步骤二，南瓜籽分离蛋白

将步骤一得到的打碎过筛后的南瓜籽粕置于10倍体积的蒸馏水中，用配置好的1mol/ml的氢氧化钠调节ph值为9并保持不变，置于45℃水浴锅中搅拌2h，室温下不动放置2小时。2000r/min离心30min，得到下层沉淀蛋白质。将下层沉淀蛋白质取出，将其放到冷冻干燥箱中冷冻干燥。

步骤三，南瓜籽蛋白碱性蛋白酶水解物的制备

取100g步骤二得到的南瓜籽蛋白，溶解于蒸馏水。将溶解后的溶液置于集热式恒温磁力搅拌器中，加入4g的碱性蛋白酶，然后滴加0.1mol/l的氢氧化钠，使其ph值为8.0并维持不变，反应4h。待水解反应结束之后再将温度调节至95℃让其反应15min使其中的酶失去活性。然后将其拿出待冷却后以8000r/min离心25min，取其上清液，冷冻干燥。

步骤四，水解物的分离

取一定量的步骤三得到的蛋白水解物置于有5-10kda超滤膜的超滤装置中，超滤7-8h，取其截留分子量。同上操作，将余下的水解物分别经过3-5kda，1-3kda，小于1kda的超滤膜，在超滤结束后分别取其截留分子量获得四组不同的分子量肽段，冷冻干燥。

在另一个示例中，在步骤三中，本发明使用了中性蛋白水解酶对步骤二得到的南瓜籽蛋白进行水解，其中步骤三种，ph调节至7并维持不变，反应4h。其他步骤及条件与上述实施例相同。

在另一个示例中，步骤一为将南瓜籽干燥80℃，3h至水分恒重，然后进行粉碎，除油(索氏抽至抽提剂清亮，玻璃棒检测无油)，风干，过80目筛，得到南瓜籽粕粉；其他步骤与条件与第一个实施例相同。

在另一个示例中，步骤一为将南瓜籽干燥90℃，1h至水分恒重，然后进行粉碎，除油(索氏抽提8-12h)，风干，过60目筛，得到南瓜籽粕粉；其他步骤与条件与第一个实施例相同。

在另一个示例中，步骤二为将步骤一得到的打碎过筛后的南瓜籽粕置于8倍体积的蒸馏水中，用配置好的1mol/ml的氢氧化钠调节ph值为8.5并保持不变，置于50℃水浴锅中搅拌2.5h，室温下不动放置2.5小时。2500r/min离心10min，得到下层沉淀蛋白质。将下层沉淀蛋白质取出，将其放到冷冻干燥箱中冷冻干燥。其他步骤与条件与第一个实施例相同。

在另一个示例中，步骤二为将步骤一得到的打碎过筛后的南瓜籽粕置于12倍体积的蒸馏水中，用配置好的1mol/ml的氢氧化钠调节ph值为9.5并保持不变，置于40℃水浴锅中搅拌1.5h，室温下不动放置1.5小时。1500r/min离心40min，得到下层沉淀蛋白质。将下层沉淀蛋白质取出，将其放到冷冻干燥箱中冷冻干燥。其他步骤与条件与第一个实施例相同。

在另一个示例中，步骤三为取100g步骤二得到的南瓜籽蛋白，溶解于蒸馏水。将溶解后的溶液置于集热式恒温磁力搅拌器中，加入3g碱性蛋白酶，然后滴加0.1mol/l的氢氧化钠，使其ph值为7.5并维持不变，反应5h。待水解反应结束之后再将温度调节至100℃让其反应10min使其中的酶失去活性。然后将其拿出待冷却后以7000r/min离心30min，取其上清液，冷冻干燥。其他步骤与条件与第一个实施例相同。

在另一个示例中，步骤三为取100g步骤二得到的南瓜籽蛋白，溶解于蒸馏水。将溶解后的溶液置于集热式恒温磁力搅拌器中，加入5g碱性蛋白酶，然后滴加0.1mol/l的氢氧化钠，使其ph值为8.5并维持不变，反应3h。待水解反应结束之后再将温度调节至90℃让其反应20min使其中的酶失去活性。然后将其拿出待冷却后以9000r/min离心20min，取其上清液，冷冻干燥。其他步骤与条件与第一个实施例相同。

测定方法如下：

1.蛋白质含量的测定

参照gb5009.5-10，测定南瓜籽和南瓜籽粕中蛋白质的含量。

2.水分含量的测定

参照gb5009.3-2010，测定样品中的水分。称取干燥至恒温的称量瓶，然后称取一定量的南瓜籽粕放入称量瓶中，称取质量，放入烘箱中干燥至恒重后，称量，记录数据按公式测出水分含量(平行三次)。

3.水解度的测定

取定量的南瓜籽蛋白，将其溶解于蒸馏水。将溶解后的溶液置于集热式恒温磁力搅拌器中，加入1g的碱性蛋白酶，然后加入0.05mol/l的氢氧化钠，使其ph值为8.0并维持不变，反应4h(在此过程中，每10min记录加入氢氧化钠的次数，注：每次加入的氢氧化钠为1ml)。待水解反应结束后再将温度调节至95℃让其反应15min使其中的酶失去活性。然后根据公式计算水解度

dh(％)＝[(c*v)/(m*蛋白质含量*8)]*100％(1)

c：氢氧化钠的浓度

v：加入氢氧化钠的体积

m：加入蛋白质的质量

4.氧自由基吸附能力的测定

将样品溶解于pbs溶剂中，使其浓度为50μg/ml。按照顺序在孔板中分别加入120μl荧光素(0.008μmol/l)和20μl的样品或是浓度分别为50、37.5、25、18.75、12.5、6.25μmol/l抗氧化剂trolox(见表1)，在温度为37℃预热20min，然后向每个样孔加入60μl的aaph(150mmol/l)以启动反应，在1h内荧光酶标仪(发射波长530nm，激发波长485nm)每间隔1min记录样品的荧光强度。抗氧化剂的保护面积(auc)是由抗氧化剂作用的荧光衰减曲线的面积消除了空白曲线的面积所得到的。将样品荧光衰减曲线的auc与标准抗氧化剂的auc进行对比，计算出样品的氧自由基吸附值。

0.8mm的trolox的配制：称取0.0027g荧光素，加入10ml，75mmpbs，5mmtrolox溶解混匀；

150mmaaph的配制：称取0.234gaaph，加入5mlpbs混匀；

5mmtrolox的配制：称取0.0013gtrolox，加入1mlpbs混匀；

表1trolox浓度

5.ace抑制活性的测定

根据holmquist等方法测定南瓜籽蛋白的ace抑制活性。在比色杯中加入1ml，0.5mmol/lfapgg(溶解于50mmol/ltris-hcl缓冲液，含0.3mol/lnacl，ph7.5)，20μlace(1u/ml，最终活力为20mu)，200μl样品(在上面所说的缓冲液中溶解，最终浓度为1mg/ml)，室温下混合均匀，2min内在345nm下测得吸光值的降低速率。空白以tris-hcl缓冲液代替样品。根据公式计算ace抑制活性：

ace抑制率(％)＝1-[δamin^-1(样品)/δamin^-1(空白)]*100％(2)

δamin^-1(样品)：样品的ace活性变化速率；

6.分子量扫描和肽的结构鉴定

采用lc-ms(配有pda和tof检测器)对分子量<1kda的组分进行分子量扫描和肽结构鉴定。液相色谱条件：色谱柱：c-18；流动相乙腈/a水/b；洗脱方式：乙腈浓度为5％-95％；洗脱时间：25min；进样体积：10ul；流速：

0.5ml/min。质谱条件：esi源，碰撞能量35v，锥孔电压40v。

7.数据分析

采用sas软件对数据进行单因素方差分析duncan多重比较，以p<0.05为有显著差异。

基于第一个实施例的结果与分析

1.南瓜籽粕中蛋白质含量与水分含量，见表2；

表2原料蛋白质与水分含量

2.南瓜籽粕蛋白水解物的水解度

如图1所示，随着反应时间的延长，南瓜籽蛋白的水解度也越来越大。在开始时的1h内，水解度上涨的幅度最大，达到了7.99％，说明此时水解反应速率较快。60-200min这段时间内水解度上涨了2.99％，水解反应速率明显变得缓慢。而后在200-240min内，水解反应速度十分的平缓，水解度维持在11.23％上下，这说明此时的南瓜籽蛋白在碱性蛋白酶的作用下已经进行了充分的水解，使其中的抗氧化肽充分释放。得到的南瓜籽蛋白最大水解度为11.48％，如果用另个一示例中的中性蛋白酶，得到水解度为21.45％。

3.南瓜籽粕蛋白氧自由基吸附能力

氧化应激引起的ros，会自氧化而导致血管功能的紊乱和重构。所以，含有抗氧化性的活性肽也含有降血压活性的功能。抗氧化剂的抗氧化性能会随着orac值的变高而变得越来越强。由trolox标准曲线可得出方程y＝60.359x-320.08，由此方程可算出orac值。

南瓜籽水解物及其膜分离组分氧自由基吸附能值(orac)如图2和图3所示。可以看出，南瓜籽蛋白水解物的orac值与分子量之间有着显著的相关性。在分子量肽段1-3kda时氧自由基吸附能力值最高，为787.18μmolte/g，其次是<1kda组分为745.62μmolte/g。3-5kda和5-10kda组分的将自由基吸附能力值分别为654.98μmolte/g，622.46μmolte/g。氧自由基吸附能力值最小的是水解物组分，值为430.76μmolte/g。

4.ace抑制活性

ace抑制活性由于水解物分子量的不同而具有一定的差别。如图4所示，ace抑制活性与分子量有相互依赖的关系。没有分离的水解物的ace抑制活性最高，为46.8067％。总体趋势来看，ace抑制活性会随着分子量的增大而降低。在分子量组分5-10kda是ace抑制活性值为36.49％。由此看来，低分子量的南瓜籽多肽段具有较高的ace抑制活性。这个结论与朱振宝等人的研究结果较为一致，他们认为低分子量肽段可以更有效的抑制ace的活性。

5.小肽结构鉴定

由以上研究发现小于1kda肽段活性比较好，利用分子量扫描小于1kda发现在tic图(见图5)中有6个明显的肽质谱峰，分别在出峰时间35s、9.8min、11.5min、14.5min、21min和23min；对这些峰的一级质谱图进行分析发现主要有分子量为218、256、274、301、318和362的小肽6个；对这些小肽的二级质谱图(见图6和表3)进一步分析，最后鉴定出小于1kda组分中含有小肽主要为丙氨酸-谷氨酸、丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸、组氨酸-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-氢氧根、氨基-2-丁烯-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-组氨酸、氨基-2-丁烯-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-氢氧根、丝氨酸-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸。

表3<1kda组分中含有的小肽的一级质谱图

结论

通过实验显示，南瓜籽碱性蛋白酶水解中小于1kda组分活性较好，小于1kda的orac值为745.62μmolte/g。从测得的orac值可以看出南瓜籽蛋白水解物的抗氧化性能较强，在分子量肽段1-3kda时氧自由基吸附能力值较高，为787.18μmolte/g。其它的分子量肽段也有一定的抗氧化性能，其抗氧化性强弱为1-3kda>1kda>3-5kda>5-10kda>水解物。分离南瓜籽蛋白水解物获得的分离组分可以作为开发抗氧化剂相关功能的产品。