一种龙眼果皮中功能多糖和原花青素的酶法集成提取方法与流程

本发明属于生物提取技术领域，具体涉及一种龙眼果皮中功能多糖和原花青素的酶法集成提取方法。

背景技术：

龙眼，是一种营养丰富，鲜食、加工兼用型的水果。随着农业生产技术的不断提高，龙眼的年产量正稳步上升。如今，龙眼已大量用于酿酒或生产龙眼罐头、龙眼干等加工制品，因为缺乏有效的利用手段，占龙眼果实鲜重17%以上的果皮、果核被当作废物丢弃。全国废弃的龙眼果皮、果核高达2万吨/年以上，亟待综合利用。龙眼果皮果核中富含生物活性物质，尤其是原花青素和功能多糖。龙眼果皮中原花青素具有非常优异的抗氧化活性和α-淀粉酶抑制活性。龙眼果皮中的多糖已经被证明具有增强免疫力、抗肿瘤等生物活性。开发龙眼果皮、果核中生理活性原花青素和功能多糖，既能变废为宝，提供新的保健食品或药品资源；又能发掘其高的附加值，提升龙眼种植、加工的经济效益。

目前，国内外食品开发方面对龙眼的研究主要集中在明确其营养成分或提取、鉴定其中的功能因子等，但深加工程度有限。cn201410811029.8提供了一种龙眼果皮提取物的提取方法，将龙眼果皮用体积浓度为20-95％的乙醇水溶液提取，提取液浓缩后得到粗提物，将粗提物经过大孔树脂柱层析，洗脱液为体积浓度20-95％的乙醇水溶液，得到龙眼果皮提取物，虽然证实该提取物有活性价值，但没有具体研究其活性物质。

cn201711040011.2公开了荔枝皮原花青素的提取工艺，包括以下步骤：将荔枝皮捣碎，加入乙醇溶液提取，得到乙醇提取液，将乙醇提取液过滤，得到浸膏。向浸膏中加入体积浓度为50～70％乙醇溶液调节荔枝皮浓度至0.3～0.5mg/ml，搅拌溶解，接着上xad-7大孔树脂，先用蒸馏水洗柱，再用体积浓度为70～90％的乙醇溶液洗脱，分别收集流出液和乙醇洗脱液，然后将流出液上ab-8+树脂，先用蒸馏水洗柱，再用体积浓度为40～50％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液；将两次乙醇洗脱液合并，过滤，滤液浓缩，冷冻干燥，即为荔枝皮原花青素。该发明制得的原花青素纯度高，收率大，但是操作繁琐，提取物质单一造成大量原料浪费。cn201810051344.3提供一种火龙果皮多糖的提取方法，采用22-28℃的冷水浸提和乙醇沉淀相结合的方法，向火龙果皮中加入22-28℃的水，进行打浆，利用乙醇进行沉淀，然后利用sevage试剂去除粗多糖中的蛋白质，精提多糖，此发明提供的火龙果皮多糖的提取方法对火龙果皮多糖的得率较高，但纯度较低。

本发明提供了龙眼功能多糖与原花青素的酶法集成提取的方法。在研究某物质的化学组成时，通常以有机溶剂提取原花青素，而以热水提取多糖组分，但缺少连续制备原花青素和多糖的集成技术的相关发明。原花青素在植物中通常与多糖酯化形成大分子，导致难以直接用水提取，但随着生物酶工程的进展，纤维素酶、半纤维素酶能够酶解植物中原花青素-多糖复合体。本发明通过酶法集成提取功能性多糖和抗氧化性原花青素，不仅实现原花青素和多糖的连续提取，还同时提高原花青素得率和多糖得率。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种龙眼果皮中功能多糖和原花青素的酶法集成提取方法。本发明的方法提取工艺简便快捷，实现原花青素和多糖的连续提取，成本低廉，实现了龙眼果皮废弃物的高值化利用，增加了龙眼深加工的效益，对龙眼副产物的综合开发具有积极的促进作用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种龙眼果皮中功能多糖和原花青素的酶法集成提取方法，包括以下步骤：

（1）龙眼果皮粉碎成果皮渣，过100目筛后加入复合酶a溶液，热水酶法浸提，之后5000rpm离心20分钟，取上清液，的上清液a；

（2）将步骤（1）所得上清液a浓缩，得浓缩液a，向浓缩液a中氯化钠和乙醇，搅拌混匀后静置分层，分液漏斗分液，上清液为原花青素，下层为粗多糖溶液；

（3）将步骤（2）所得上清液浓缩，得浓缩液b，浓缩液b用sephadex柱层析除杂质，先用50vol%甲醇溶液洗脱，后用70vol%丙酮溶液洗脱，收集丙酮溶液洗脱液旋蒸、冻干，得到的棕色粉末为抗氧化原花青素；

（4）向步骤（2）所得粗多糖溶液中加入复合酶b，采用酶法脱蛋白，酶解完成后，加入乙醇进行沉淀，分离沉淀物冻干得龙眼功能多糖。

上述步骤（1）中，复合酶a由纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶按2:1:2的比例混合而成；复合酶a溶液为浓度为0.55wt%-0.65wt%的复合酶a的水溶液。

上述步骤（1）中，复合酶a溶液与果皮渣的液料比20:1。

上述步骤（1）中，热水酶法提取的温度为55℃，提取时间2.5-3小时。

上述步骤（2）中上清液a浓缩至原体积的1/6-1/10；浓缩液a中加入1倍体积的95vol%乙醇和质量体积比0.3倍的氯化钠。

上述步骤（2）中上清液b浓缩至原体积的1/10。

上述步骤（4）中，复合酶b为木瓜蛋白酶与风味酶按4:1的比例混合；粗多糖溶液中加入终浓度为0.1wt%的复合酶b。

上述步骤（4）中，加入4倍体积95%乙醇进行沉淀。

上述步骤（4）中，酶法脱蛋白的酶解温度为28-30℃，酶解时间为2.8-3.0小时。

上述提取方法制备所得的功能多糖和原花青素。

本发明的优点在于：本发明通过酶法从龙眼果皮中集成提取功能性多糖和抗氧化性原花青素，不仅实现原花青素和多糖的连续提取，还同时提高原花青素得率和多糖得率。本发明的方法提取工艺简便快捷，成本低廉，实现了龙眼果皮废弃物的高值化利用，增加了龙眼深加工的效益，对龙眼副产物的综合开发具有积极的促进作用。

附图说明

图1龙眼果皮原花青素的dpph自由基清除能力。

图2龙眼果皮原花青素的abts自由基清除能力。

图3龙眼果皮原花青素的还原力。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种龙眼果皮中功能多糖和原花青素的酶法集成提取方法，包括以下步骤：龙眼果皮粉碎成果皮渣，过100目筛后热水酶法提取，采用0.6wt%复合酶a(纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶2:1:2)，液料比20:1，55℃提取时间2.5小时，离心（5000rpm，20分钟），取上清液，得上清液a，上清液a浓缩至原体积的1/6得浓缩液a，向浓缩液a中加入0.3倍（m/v）氯化钠，1倍(v/v)的95vol%乙醇，搅拌混匀后静置分层，分液漏斗分液，上清液为原花青素，下层为粗多糖溶液。将上清液浓缩至原体积的1/10得浓缩液b，浓缩液b用sephadex柱层析除杂质，先用50vol%甲醇溶液洗脱，后用70vol%丙酮溶液洗脱，收集丙酮洗脱液旋蒸、冻干，得到的棕色粉末为抗氧化原花青素。粗多糖溶液采用酶法脱蛋白，粗多糖溶液中加入终浓度为0.1wt%的复合酶b（木瓜蛋白酶/风味酶4:1），酶解温度30℃，酶解时间3小时，酶解完成后，采用4倍体积95vol%乙醇沉淀，分离沉淀物冻干得龙眼功能多糖。

制备所得原花青素的得率为0.96%；功能多糖的得率为2.38%。

实施例2

一种龙眼果皮中功能多糖和原花青素的酶法集成提取方法，包括以下步骤：龙眼果皮粉碎成果皮渣，过100目筛后热水酶法提取，采用0.55wt%复合酶a(纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶2:1:2)，液料比20:1，55℃提取时间3小时，离心（5000rpm，20分钟），取上清液，得上清液a，上清液a浓缩至原体积的1/8得浓缩液a，向浓缩液a中加入0.3倍（m/v）氯化钠，1倍(v/v)的95vol%乙醇，搅拌混匀后静置分层，分液漏斗分液，上清液为原花青素，下层为粗多糖溶液。将上清液浓缩至原体积的1/10得浓缩液b，浓缩液b用sephadex柱层析除杂质，先用50vol%甲醇溶液洗脱，后用70vol%丙酮溶液洗脱，收集丙酮洗脱液旋蒸、冻干，得到的棕色粉末为抗氧化原花青素。粗多糖溶液采用酶法脱蛋白，粗多糖溶液中加入终浓度为0.1wt%的复合酶b（木瓜蛋白酶/风味酶4:1），酶解温度29℃，酶解时间3.0小时，酶解完成后，采用4倍体积95vol%乙醇沉淀，分离沉淀物冻干得龙眼功能多糖。

制备所得原花青素的得率为1.05%；功能多糖的得率为2.43%。

实施例3

一种龙眼果皮中功能多糖和原花青素的酶法集成提取方法，包括以下步骤：龙眼果皮粉碎成果皮渣，过100目筛后热水酶法提取，采用0.65%复合酶a(纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶2:1:2)，液料比20:1，55℃提取时间2.9小时，离心（5000rpm，20分钟），取上清液，得上清液a，上清液a浓缩至原体积的1/10得浓缩液a，向浓缩液a中加入0.3倍（m/v）氯化钠，1倍(v/v)的95vol%乙醇，搅拌混匀后静置分层，分液漏斗分液，上清液为原花青素，下层为粗多糖溶液。将上清液浓缩至原体积的1/10得浓缩液b，浓缩液b用sephadex柱层析除杂质，先用50vol%甲醇溶液洗脱，后用70vol%丙酮溶液洗脱，收集丙酮洗脱液旋蒸、冻干，得到的棕色粉末为抗氧化原花青素。粗多糖溶液采用酶法脱蛋白，粗多糖溶液中加入终浓度为0.1wt%的复合酶b（木瓜蛋白酶/风味酶4:1），酶解温度30℃，酶解时间3.0小时，酶解完成后，采用4倍体积95vol%乙醇沉淀，分离沉淀物冻干得龙眼功能多糖。

制备所得原花青素的得率为0.98%；功能多糖的得率为2.42%。

实施例4

一种龙眼果皮中功能多糖和原花青素的酶法集成提取方法，包括以下步骤：龙眼果皮粉碎成果皮渣，过100目筛后热水酶法提取，采用0.55wt%复合酶a(纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶2:1:2)，液料比20:1，55℃提取时间2.8小时，离心（5000rpm，20分钟），取上清液，得上清液a，上清液a浓缩至原体积的1/9得浓缩液a，向浓缩液a中加入0.3倍（m/v）氯化钠，1倍(v/v)的95vol%乙醇，搅拌混匀后静置分层，分液漏斗分液，上清液为原花青素，下层为粗多糖溶液。将上清液浓缩至原体积的1/10得浓缩液b，浓缩液b用sephadex柱层析除杂质，先用50vol%甲醇溶液洗脱，后用70vol%丙酮溶液洗脱，收集丙酮洗脱液旋蒸、冻干，得到的棕色粉末为抗氧化原花青素。粗多糖溶液采用酶法脱蛋白，粗多糖溶液中加入终浓度为0.1wt%（m/v）的复合酶b（木瓜蛋白酶/风味酶4:1），酶解温度28℃，酶解时间2.8小时，酶解完成后，采用4倍体积95vol%乙醇沉淀，分离沉淀物冻干得龙眼功能多糖。

制备所得原花青素的得率为1.02%；功能多糖的得率为2.36%。

实施例5龙眼果皮原花青素的抗氧化性测定

用实施例1提取方法所提取的原花青素进行dpph自由基淬灭活性、abts自由基淬灭活性及还原力检测，以vc作对照。龙眼果皮原花青素的dpph自由基清除能力见图1，龙眼果皮原花青素的abts自由基清除能力见图2，龙眼果皮原花青素的还原力见图3。结果表明，dpph自由基的淬灭活性的ic50为0.083mg/ml，对abts自由基的淬灭活性的ic50为0.054mg/ml，还原力的ic50为0.061mg/ml。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。