基于二硫键精准配对构建富含二硫键多肽分子骨架的方法与流程

本发明涉及多肽分子骨架，尤其是涉及一种基于二硫键精准配对构建富含二硫键多肽分子骨架的方法。

背景技术：

自1953年首个人工合成的具有生物活性的多肽问世至今，多肽类药物和配体已被广泛应用于临床诊断和治疗，主要是因为多肽分子具有易于合成和代谢毒性低、免疫原性小、单位质量生物活性高等优点。然而多肽的一个固有缺陷却限制其发展与应用，即多肽分子在水环境中通常是处于无规则卷曲状态，而不具有固定的、刚性较强的二级或三级构型。由于无规卷曲的线型多肽分子构象多变，且与靶标蛋白结合后其构象的变化还会带来不利的熵变，因而会导致其与靶标蛋白结合的特异性和亲和力降低。此外，线型多肽分子极其容易被生物体系中的蛋白酶降解，从而影响其生物利用率。所以，多肽的灵活构象和容易被酶解的问题一直成为制约多肽作为药物和配体发展的关键问题。

1995年，David J.Craik等人(O.Saether，D.J.Craik，I.D.Campbell，K.sletten,D.G.Norman.Biochemistry，1995，34,4147)解析出了一种结构高度稳定、抗蛋白酶水解能力极强、富含二硫键的环肽分子。该类多肽分子普遍具有独特的生物活性，因此其本身就是潜在的药物分子。更重要的是，这些富含二硫键的多肽分子能为构建多元环肽分子探针和开发新型药物分子提供结构多样、复杂、稳定的大分子骨架模板，因此具有极高的研发价值。借用该类多肽分子模板，通过插入活性多肽序列，研究者们已经获得了一系列潜在药物分子。这些活性多肽分子通常具有较高的活性和抗蛋白酶水解稳定性。但是，这类多肽分子氧化折叠过程的复杂性和不可控性，以及分子内二硫键间的异构重排效应等，却极大地限制了其作为分子骨架模板进行探针和药物开发的潜能。

随着正交去保护技术的发明和不断成熟(Z.Dekan,M.Mobli,M.W.Pennington,E.Fung,E.Nemeth,P.F.Alewood,Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,2931)，突破了这一局限性，正交去保护法采用三种在不同条件下脱保护的基团对6个巯基进行保护，通过多次去保护、氧化折叠方法获得具有正确二硫键配对方式的特异构型。虽然该方法具有普适性，但其操作复杂、产率低，以及脱保护要严格按顺序进行、脱保护过程中不能出现自由巯基等问题限制了其应用前景。正交去保护技术的另一大局限性在于：对于纯化得到的特定构型多肽分子，在实际生命体系应用中，二硫键很容易再次发生重排，使得具有生物活性的构型转化成其它非活性构型，从而影响其生物利用率。因此，需要源头创新，发明新的技术方法。

2012年，C.L.Wu等(C.L.Wu,J.C.Leroux,M.A.Gauthier,Twin disulfides for orthogonal disulfide pairing and the directed folding of multicyclic peptides.Nature chem.2012.1044)设计合成了一系列带有CXC基序(cysteine-any-cysteine)的多肽分子骨架，借助CXC基序与半胱氨酸间配对具有正交性这一特征，从而获得了较高产率的特定构型多元环肽。此外，新的策略，如采用硒代半胱氨酸或青霉胺替代半胱氨酸等，也提供了一种构建多元环肽的新思路。然而，这些方法运用于构建三元环肽时，仍然会形成许多其它二硫键配对构型。因此，如何实现三元环肽分子内更高精准的二硫键配对，并解决二硫键重排异构问题，仍然是该领域的重大挑战。我们急需发展一种既能解决二硫键精准配对，又能克服二硫键重排异构的新技术。

技术实现要素：

本发明针对现有天然富含二硫键多肽分子骨架氧化折叠过程复杂、合成过程繁琐以及在实际应用中易于发生重排异构等问题，提供构建结构复杂多样、构型稳定、易于合成的基于二硫键精准配对构建富含二硫键多肽分子骨架的方法。

本发明包括以下步骤：

1)设两种具有以下富含二硫键人造分子骨架的模板：

模板(1):

其中三个Y中有一个是CXPen或者PenXC，剩下两个Y中一个是C，另一个是Pen，X代表任意一个氨基酸，m、n代表任意数目氨基酸。

模板(2)：

其中四个Y中有一个必需是CXPen或者PenXC，另一个必需是Dtaa，剩下两个Y则是Pen，X代表任何一个氨基酸，L、m、n代表任意数目的氨基酸。

根据上述模板合成如下多肽：

Ac-WGCKPenGGKGGPenGKGGGCGW-NH2(peptide 1)

Ac-WGCKPenGGKGGCGKGGGPenGW-NH2(peptide 2)

Ac-WGPenRCGGRGGPenGGRGGPenGWRGGDtaa1GW-NH2(peptide 3)

Ac-WGPenGGRGGPenRCGGRGGPenGWRGGDtaa1GW-NH2(peptide 4)

所述氨基酸都是L-型，其中Pen是青霉胺，Dtaa1是Dtaa其中一个化合物的结构，结构式为：

Dtaa(记为化合物1)的结构式为：

上述四条多肽只为阐明本发明的技术构思及特点，其目的是为了让本领域的技术人员能够清楚了解本发明的内容，而不应视为限定本发明的应用范围，凡根据本发明实质所作出的构型变化以及其它相关修饰，都应属于本发明的保护范围之内。

2)所述多肽为富含半胱氨酸的模型肽，模型肽的序列可以随机替换成感兴趣的活性多肽，插入到该分子骨架上面。另外本发明中对多肽长度没有特别的要求。

3)根据所需要的最终二硫键配对构型，可以随机调控半胱氨酸、青霉胺、Dtaa的位置，位置变化后二硫键精准配对概念仍然适用。

本发明针对天然多肽分子骨架CXC-C-C-CC等进行重构。首先，Dtaa(化合物1)中由于两个巯基对称分布，以及苯环的固有刚性(两个巯基之间无法配对)，我们将天然富含二硫键的多肽分子骨架中6个巯基中的两个相邻半胱氨酸进行Dtaa替代。由于Dtaa分子的双巯基等位效应，产物将由理论上15种变成6种。其次，青霉胺(记为化合物2)中的巯基存在较大的立体位阻，这种立体位阻限制了青霉胺的巯基难以配对(比半胱氨酸慢26倍)，因此促使青霉胺与半胱氨酸正交配对形成，经Dtaa替代后的多肽分子，进一步进行青霉胺的半数替代后，可以使得原来6种氧化折叠产物进一步减少到3种氧化折叠产物。最后，我们进一步利用CXC基序的刚性结构导致两个巯基之间难以配对的特点，将折叠产物由3种进一步减少至2种。基于这些设计，本发明中所构建的富含二硫键多肽分子骨架氧化折叠产物将由理论上的15种变成2种。从而克服目前富含二硫键多肽分子骨架模板产物结构复杂，不易调控的缺陷。

化合物2的结构式为：

与现有的技术相比，本发明具有以下突出的优点和技术效果：

1)本发明所构建的多肽分子骨架合成简单，只需要通过常规的固相合成，且分子骨架的构型具有可控性。

2)本发明与之前的正交去保护法相比，只需要通过简单在空气中直接氧化便可以获得预期的2种构型，节省了很多复杂操作，同时也解决氧化折叠的产率问题。

3)本发明突破了以往天然富含二硫键多肽分子的两大局限，巯基配对的随机性和二硫键的重排。通过Pen和Dtaa的引入，实现了巯基配对的可预测性。此外，由于Pen的立体位阻，使得这些多肽分子骨架具有更高的稳定性和耐二硫键重排性。

4)本发明中的富含二硫键人造分子骨架耐受序列插入，适用于构建具有随机序列的多肽库。

5)本发明拓宽了富含二硫键多肽分子骨架的应用范围，适用于各种活性多肽序列的嫁接，为构建具有复杂结构的活性多肽分子提供了全新的方法学。

附图说明

图1为peptide 1的分子骨架构型以及氧化折叠色谱图。

图2为peptide 2的分子骨架构型以及氧化折叠色谱图。

图3为peptide 3的分子骨架构型以及氧化折叠色谱图。

图4为peptide 4的分子骨架构型以及氧化折叠色谱图。

图5为peptide 3的氧化折叠示意图。

图6为酶解3a的色谱图。

图7为3a酶解产物1的质谱图。

图8为3b酶解产物色谱图。

图9为3b酶解产物1的质谱图。

图10为3b酶解产物2的质谱图。

图11为3a二硫键重排异构研究。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明进一步的说明。

实施例1

以合成peptide 3的分子骨架氧化折叠为例(peptide 1，peptide 2，peptide 4合成步骤与peptide 3相同，其色谱图如图1，图2，图4)，其具体的制备方法：

将peptide 3固体粉末溶于水中(包含0.1％TFA，防止巯基被氧化)，在室温下，10μM多肽与200mM GSSG在100mM pH＝7.4磷酸盐缓冲溶液中(含50％DMSO)放置氧化2h，得到预期两种产物(两种产物分别命名为3a，3b)，利用高效液相色谱纯化分离冻干后得到相应富含二硫键分子骨架，其色谱图如图3和5。

实施例2

以合成peptide 3的分子骨架为例，酶解分析3a，3b中二硫键的配对方式：

取色谱纯化后的冻干产物(约1～30μg),加入90μL pH＝6的磷酸盐缓冲溶液(防止酶解过程中二硫键发生重排)，然后再加入1mg/ml胰蛋白酶10μL，反应0.5h后，用LC-MS分析酶解碎片产物，其色谱和质谱图如图6～10。

实施例3

3a二硫键重排：

往3a 50μL(50μM)中加入0.5mM GSH/GSSG的磷酸盐缓冲溶液450μL,使得3a的最终浓度为5μM，然后分别在0min 10min、20min、60min、120min取样90μL，加到10μL 10％偏磷酸溶液中猝灭二硫键的交换反应，用色谱检测二硫键重排的动力学，其色谱图如图11。

理论上，含有2个和3个二硫键的多肽分子分别存在3种和15种可能的异构体，而且在实际生命体系中，纯化得到的具有特定构型的多肽分子也会再次发生二硫键重排异构，极大地限制了其作为分子骨架模板进行生物识别分子和药物分子开发的潜能。本发明通过以青霉胺(Pen)和含双巯基的氨基酸(Dtaa)替代多肽链内的半胱氨酸，并调控其间相对位置和排布，对天然富含二硫键多肽分子骨架进行重构，从而能够将含2个和3个二硫键的多肽分子骨架的异构体数目由理论上的3种和15种分别减少至1种和2种。该方法无需借助保护基团，在溶液中通过直接氧化即可生成具有独特二硫键配对方式的特异构型。此外，本发明所构建的富含二硫键多肽分子骨架最多只有两种二硫键重排异构体，因此，非常适合应用于构建和开发新型的多肽类药物和靶向配体。