一株拟茎点霉菌株及其在对雷公藤红素进行生物转化中的应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一株拟茎点霉菌株及其在对雷公藤红素进行生物转化中的应用。
背景技术：
：雷公藤具有抑菌、抗炎、抑制肿瘤细胞等功效。雷公藤中的活性成分为雷公藤红素(celastrol，csl)。雷公藤红素的结构式如下：尽管csl具有显著的药理活性，但其水溶性低、心肌毒性大以及对正常细胞的杀伤作用强，严重影响了其在临床上的应用。目前需要解决的是，提高或保留药理活性的同时降低毒性，以便提高治疗指数。天然活性先导化合物生物转化是利用生物体系(如：酶、微生物、植物细胞)将加入到生物反应系统中的天然活性先导化合物进行特异性的分子结构修饰以获得高效、低毒新化合物的方法，本质是生物体系中的酶对外源性底物的催化反应。在天然先导化合物的结构优化方面，微生物转化具有反应条件温和、立体选择性强、催化效率高、反应种类多以及环境污染小等特点，尤其在具复杂结构天然产物的结构修饰中有着显著的优势。拟茎点霉属phomopsis(sacc.)bubak是半知菌亚门、腔孢纲、球壳孢目中的一个重要真菌属，拟茎点霉属真菌是重要的植物内生真菌。技术实现要素：本发明的目的是提供一株拟茎点霉菌株及其在对雷公藤红素进行生物转化中的应用。本发明提供的拟茎点霉菌株，拟茎点霉(phomopsissp.)lgt-5，已于2018年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmccno.16088。拟茎点霉(phomopsissp.)lgt-5简称拟茎点霉lgt-5。本发明还保护拟茎点霉lgt-5在制备式(ⅲ)所示化合物中的应用。本发明还保护一种制备式(ⅲ)所示化合物的方法，包括如下步骤：采用拟茎点霉lgt-5对雷公藤红素进行生物转化，得到式(ⅲ)所示化合物。拟茎点霉lgt-5与雷公藤红素的配比可为0.25-1.5g干重的拟茎点霉lgt-5：50mg雷公藤红素。拟茎点霉lgt-5与雷公藤红素的配比具体可为0.75g干重的拟茎点霉lgt-5：50mg雷公藤红素。具体可为：将拟茎点霉lgt-5接种至150ml改良马丁液体培养基，28℃、180rpm振荡培养至对数生长期，然后在培养体系中加入50mg雷公藤红素，28℃、180rpm振荡培养5天。具体可为：将拟茎点霉lgt-5接种至150ml改良马丁液体培养基，28℃、180rpm振荡培养至对数生长期(此时拟茎点霉lgt-5的浓度为5g干重/l培养体系)，然后在培养体系中加入2ml雷公藤红素溶液(含50mg雷公藤红素，溶剂为dmso)，28℃、180rpm振荡培养5天。本发明还保护一种制备式(ⅲ)所示化合物的方法，包括如下步骤：在液相体系中，拟茎点霉lgt-5与雷公藤红素进行反应，得到式(ⅲ)所示化合物。所述液相体系具体可为改良马丁液体培养基。拟茎点霉lgt-5与雷公藤红素的配比可为0.25-1.5g干重的拟茎点霉lgt-5：50mg雷公藤红素。拟茎点霉lgt-5与雷公藤红素的配比具体可为0.75g干重的拟茎点霉lgt-5：50mg雷公藤红素。所述反应的条件具体可为28℃、180rpm振荡培养5天。具体可为：将拟茎点霉lgt-5接种至150ml改良马丁液体培养基，28℃、180rpm振荡培养至对数生长期，然后在培养体系中加入50mg雷公藤红素，28℃、180rpm振荡培养5天。具体可为：将拟茎点霉lgt-5接种至150ml改良马丁液体培养基，28℃、180rpm振荡培养至对数生长期(此时拟茎点霉lgt-5的浓度为5g干重/l培养体系)，然后在培养体系中加入2ml雷公藤红素溶液(含50mg雷公藤红素，溶剂为dmso)，28℃、180rpm振荡培养5天。本发明还保护一种制备式(ⅲ)所示化合物的方法，包括如下步骤：(1)在液相体系中，拟茎点霉lgt-5与雷公藤红素进行反应；(2)完成步骤(1)后，除去菌丝体，收集剩余液相；(3)取步骤(2)得到的液相，采用有机相进行萃取，收集有机相；(4)取步骤(3)得到的有机相，进行减压蒸馏以除去溶剂，得到提取物。步骤(1)中，所述液相体系具体可为改良马丁液体培养基。步骤(1)中，拟茎点霉lgt-5与雷公藤红素的配比可为0.25-1.5g干重的拟茎点霉lgt-5：50mg雷公藤红素。步骤(1)中，拟茎点霉lgt-5与雷公藤红素的配比具体可为0.75g干重的拟茎点霉lgt-5：50mg雷公藤红素。步骤(1)中，所述反应的条件具体可为28℃、180rpm振荡培养5天。步骤(1)具体可为：将拟茎点霉lgt-5接种至150ml改良马丁液体培养基，28℃、180rpm振荡培养至对数生长期，然后在培养体系中加50mg雷公藤红素，28℃、180rpm振荡培养5天。步骤(1)具体可为：将拟茎点霉lgt-5接种至150ml改良马丁液体培养基，28℃、180rpm振荡培养至对数生长期(此时拟茎点霉lgt-5的浓度为5g干重/l培养体系)，然后在培养体系中加入2ml雷公藤红素溶液(含50mg雷公藤红素，溶剂为dmso)，28℃、180rpm振荡培养5天。步骤(2)中，可通过离心或过滤除去菌丝体。步骤(3)中，所述有机相具体可为乙酸乙酯。步骤(3)具体可为：取1体积份步骤(2)得到的液相，加入1体积份乙酸乙酯，进行萃取(23℃静置半小时)，收集乙酸乙酯相；剩余的水相再加入1体积份乙酸乙酯，进行萃取(23℃静置半小时)，收集乙酸乙酯相；剩余的水相再加入1体积份乙酸乙酯，进行萃取(23℃静置半小时)，收集乙酸乙酯相；将3个乙酸乙酯相合并。步骤(4)中，所述减压蒸馏的条件具体可为：0.07mpa、60℃。所述方法还包括纯化步骤。所述纯化步骤为采用液相色谱进行纯化。色谱柱为5c18-ms-ⅱ；提取物溶于甲醇后上样；流动相由9体积份甲醇和1体积份水组成；流速为1ml/min；收集保留时间为31.5-34min的过柱后溶液，然后减压蒸馏以除去溶剂，得到式(ⅲ)所示化合物。所述减压蒸馏的条件具体可为：0.07mpa、60℃。本发明还保护拟茎点霉lgt-5在制备细菌抑制剂中的应用。所述细菌具体可为马铃薯环腐病菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌或绿脓假单胞菌。以上任一所述式(ⅲ)所示化合物具体可为式(ⅱ)所示化合物。以上任一所述式(ⅲ)所示化合物具体可为式(ⅰ)所示化合物。拟茎点霉lgt-5可以将雷公藤红素转化成新化合物16-oh-celastrol(16-ohcsl)。与雷公藤红素相比，16-oh-celastrol的抗菌活性无显著差异，但细胞毒性大幅度降低，可以作为新型抑菌药物。附图说明图1为菌株lgt-5的菌落形态。图2为菌株lgt-5的电镜照片。图3为菌株lgt-5的系统发育树。图4为薄层色谱图。图5为液相色谱图。图6为产物的1hnmr图谱。图7为产物的13cnmr图谱。图8为产物的1h-1hcosy图谱。图9为产物的hmqc图谱。图10为产物的hmbc图谱。图11为产物的(+)-esims图谱。图12为产物的(-)-esims图谱。图13为抑菌试验的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。雷公藤红素(celastrol)：上海笛柏化学品技术有限公司，cas号为34157-83-0。改良马丁液体培养基(ph6.2-6.6)：蛋白胨5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，蒸馏水1l。改良马丁固体培养基(ph6.2-6.6)，又称mma培养基：与改良马丁液体培养基的差别仅在于每l培养基加入20g琼脂。燕麦培养基(ph6.2-6.6)，又称oma培养基：燕麦30g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1l。mh肉汤培养基即mhb培养基。mh琼脂肉汤培养基即mha培养基。实施例1、菌株的获得、鉴定和保藏一、菌株的获得1、取云南省大理姚县雷公藤植物的无病害的新鲜叶，进行表面消毒。表面消毒的方法：清水冲洗干净，清水冲洗4次，75％酒精漂洗30s,再用5％次氯酸钠浸泡2s,无菌水冲洗10次。2、无菌滤纸吸去表面的水分，用灭菌的刀片切去液体接触的一面，再将内部切成小块移植于含150mg/l青霉素和120mg/l链霉素的改良马丁固体培养基，然后挑取生长的单个菌落进行培养。3、进一步进行连续纯化，获得一株纯培养的菌株，将其命名为lgt-5菌株。二、菌株的鉴定1、菌落形态挑取lgt-5菌株分别接种至mma培养基和oma培养基上中央位置，28℃培养3-6d，观察培养5天时菌落形态(见图1)。在mma培养基上培养5天时，菌落直径达4-6cm，生长快速，绒毛状，中央呈致密棕色环状凸起，外缘呈疏松白色菌丝，背面中央淡黄色，外缘白色，无褶皱，无渗出物。在oma培养基上培养5天时，菌落直径达7-8cm，生长速度更快，形态与在mma培养基上相似。2、电镜观察(1)将lgt-5菌株接种于改良马丁固体培养基，将灭菌处理的盖玻片以45°夹角插入菌落生长的培养基中，让细菌爬片生长。(2)将盖玻片轻轻拔出，用0.1m二甲砷酸钠缓冲液快速冲洗两次，放到2％戊二醛溶液中固定2h(有菌丝的一面朝上)，用0.1m二甲砷酸钠缓冲液冲洗三次(间隔两小时一次)，最后用0.1m二甲砷酸钠缓冲液4℃固定12h以上，然后依次用30％乙醇溶液、50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、80％乙醇溶液、90％乙醇溶液和100％乙醇脱水(每次脱水时间为10-15min)。(3)用95％叔丁醇溶液置换2次(每次15min)，再用100％叔丁醇置换15min，置换完毕后将样品放置-20℃冰箱中预冷20min。(4)冷冻干燥处理，离子溅射仪喷镀，将制作好的样品放置于扫描电镜hitachis-3400n，在10千伏下观察细胞形态。照片见图2。3、18srdna鉴定采用通用引物its1(tccgtaggtgaacctgcgg)和its4(tcctccgcttattgatatgc)进行pcr扩增。pcr扩增体系(25μl)：10×taqbuffer2.5μl，dntps(2.5mmol/l)2.0μl，taqdna聚合酶0.2μl，上、下游引物(10μmol/l)各1.0μl，dna模板2.0μl，双蒸水补足至25μl。pcr扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸90s，40个循环；最后72℃延伸5min，16℃保存。将pcr扩增产物纯化回收并进行测序，如序列表的序列1所示。将序列1进行同源性比对分析，挑选部分相似性高的菌株与lgt-5菌株进行系统发育分析，用mega软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树，见图3，综合步骤1至3的结果，lgt-5菌株属于拟茎点霉(phomopsissp.)，因此又称为拟茎点霉lgt-5。三、菌株的保藏拟茎点霉(phomopsissp.)lgt-5，已于2018年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmccno.16088。实施例2、应用拟茎点霉lgt-5制备16-oh-celastrol一、应用拟茎点霉lgt-5进行雷公藤红素转化1、将拟茎点霉lgt-5接种至装有150ml改良马丁液体培养基的三角瓶中，28℃、180rpm振荡培养至对数生长期(通常培养时间为1天)，此时拟茎点霉lgt-5的浓度为5g干重/l培养体系。干重计量方法：取样培养体系，离心收集菌体，用无菌水充分洗涤，然后烘干至干重。2、完成步骤1后，在培养体系中加入2ml雷公藤红素溶液(含50mg雷公藤红素，溶剂为dmso)，28℃、180rpm振荡培养5天。即，拟茎点霉lgt-5与雷公藤红素的配比为：0.75g干重的拟茎点霉lgt-5：50mg雷公藤红素。3、完成步骤2后，取培养体系，除去菌丝体(离心或过滤)，收集清液。4、取1体积份步骤3得到的清液，加入1体积份乙酸乙酯，进行萃取(23℃静置半小时)，收集乙酸乙酯相；剩余的水相再加入1体积份乙酸乙酯，进行萃取(23℃静置半小时)，收集乙酸乙酯相；剩余的水相再加入1体积份乙酸乙酯，进行萃取(23℃静置半小时)，收集乙酸乙酯相；将3个乙酸乙酯相合并。5、将步骤4得到的乙酸乙酯相进行减压蒸馏(0.07mpa、60℃)以除去溶剂，得到红棕色膏状产物。每152ml完成步骤2的培养体系约得到45mg产物。二、产物的分离和鉴定将步骤一得到的产物进行薄层色谱。将雷公藤红素作为标准品。展开剂由石油醚和乙酸乙酯组成(石油醚：乙酸乙酯＝1：1；体积比)，加一滴甲酸。采用gf254薄层硅胶板。照片见图4。图4中，从左至右三个泳道依次对应展开剂(空白对照)、步骤一得到的产物、雷公藤红素。薄层色谱的结果表明，步骤一得到的产物中，存在雷公藤红素，还存在新的转化产物。将步骤一得到的产物进行半制备液相色谱。色谱柱：5c18-ms-ⅱ10id×250mm。快速通用型半制备色谱仪：型号quiksep，北京慧德易科技有限公司。步骤一的产物(红棕色膏状)，溶于甲醇后上样，每次进样0.2毫升。流动相由甲醇和水组成(甲醇：水＝9：1；体积比)。流速为1ml/min。目标物(16-oh-celastrol)的峰对应的保留时间为31.5-34min，峰顶对应的保留时间为32.253min。色谱图见图5。收集目标峰(保留时间31.5-34min)对应的过柱后溶液，进行减压蒸馏(0.07mpa、60℃)以除去溶剂，得到产物，产物为红色粉末。每152ml完成步骤一的2的培养体系约得到30mg产物,转化率约等于60％。图6为产物的1hnmr图谱。图7为产物的13cnmr图谱。图8为产物的1h-1hcosy图谱。图9为产物的hmqc图谱。图10为产物的hmbc图谱。图11为产物的(+)-esims图谱。图12为产物的(-)-esims图谱。产物的nmr数据见表1。(+)-esimsm/z467[m+h]+；(-)-esimsm/z465[m-h]-。结果表明，产物为式(ⅰ)所示化合物，即16-oh-celastrol。表1实施例3、16-oh-celastrol的功能验证供试化合物：celastrol或实施例2制备的16-oh-celastrol。一、抑菌试验供试菌：马铃薯环腐病菌、金黄色葡萄球菌(25923tm)、变形杆菌(29905tm)或绿脓假单胞菌(cmcc编号为10110)。提及马铃薯环腐病菌(clavibactermichiganense)的参考文献：汪万春,袁钧,郑春生,高文娜.马铃薯环腐病菌lamp检测方法的建立[j].植物检疫,2014,28(1):29-32.。供试菌悬液：将供试菌单菌落接种至牛肉膏蛋白胨培养基，37℃、180rpm振荡培养24h，然后用mh肉汤培养基稀释，得到供试菌悬液。金黄色葡萄球菌制备108cfu/ml的供试菌悬液。马铃薯环腐病菌制备108cfu/ml的供试菌悬液。绿脓假单胞菌制备108cfu/ml的供试菌悬液。变形杆菌制备106cfu/ml的供试菌悬液。供试化合物溶液：用供试化合物和dmso(溶剂)制备供试化合物溶液，使供试化合物的浓度为1mg/ml。将100μl供试菌悬液涂布于mh琼脂肉汤培养基平板；然后在平板上均匀放置4个直径为8mm的滤纸片，每个滤纸片上滴加10μl样品液；然后37℃静置培养24小时。样品液为供试化合物溶液、阳性对照溶液或阴性对照溶液。阳性对照溶液为青霉素溶液(0.05mg/ml)或链霉素溶液(0.5mg/ml)。阴性对照溶液为dmso。每种样品液设置3个重复。抑菌圈直径(cm)的结果见表2。照片见图13。16-oh-celastrol与celastrol抑菌活性相似，均对金黄色葡萄球菌、马铃薯环腐病菌、绿脓假单胞菌和变形杆菌有一定的抑菌活性。表2抑菌圈直径(cm)celastrol16-oh-celastrol青霉素链霉素金黄色葡萄球菌2.02.21.6－变形杆菌2.01.5－2.5绿脓假单胞菌2.01.4－1.5马铃薯环腐病菌2.22.22.0－二、细胞毒性试验供试细胞：bv-2细胞(湖南丰晖生物科技有限公司，货号cl0056)或pc12细胞(湖南丰晖生物科技有限公司，货号cl0256)。待测化合物溶液：用dmso溶解待测化合物，得到浓度为50mmol/ml的溶液，然后用完全培养基稀释，得到浓度为8μmol/l、5μmol/l、2μmol/l或1μmol/l的待测化合物溶液。完全培养基：由9体积份dmem培养基和1体积份胎牛血清组成。培养条件：37℃，5％co2。1、取96孔板，每孔加入100μl供试细胞的细胞悬液(含5×103个供试细胞)，培养24小时，弃除上清。2、完成步骤1后，取所述96孔板，加入100μl样品液，培养48小时，弃除上清。每种样品液设置3个复孔。样品液为待测化合物溶液或阴性对照溶液。每种待测化合物溶液都具有对应的阴性对照溶液，阴性对照溶液为含dmso的完全培养基(dmso含量同相应的待测化合物溶液)。3、完成步骤2后，取所述96孔板，用pbs缓冲液清洗，然后进行cck-8染色(2小时)，然后采用酶标仪测定490nm处的吸光度。细胞增殖抑制率(％)＝(od值给药孔一od值阴性对照孔)/od值空白孔×l00％。空白孔为仅加入完全培养基的孔。采用spss内的probitanalysis法计算半数抑制浓度(ic50)，单位为μmol/l。ic50值的结果见表3。16-oh-celastrol和celastrol对bv-2细胞和pc12细胞均具有细胞毒性作用效果，16-oh-celastrol细胞毒性明显低于celastrol。表3ic50值(μmol/l)celastrol16-oh-celastrolbv-2细胞0.43422.82pc12细胞1.5328.049步骤一和步骤二的结果表明，16-oh-celastrol对于三株人类致病菌和一株农业致病菌的抑菌活性与雷公藤红素相当，但16-oh-celastrol对细胞的细胞毒性显著低于雷公藤红素。sequencelisting<110>宁夏医科大学<120>一株拟茎点霉菌株及其在对雷公藤红素进行生物转化中的应用<130>gncyx190550<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>578<212>dna<213>phomopsissp.<400>1ccgtaggggtgaacctgcggagggatcattgctggaacgcgccccaggcgcacccagaaa60ccctttgtgaacttataccttttgttgcctcggcgctgctggtcttcacaggccctttgc120ttcacagcaaagagacggcacgccggcggccaagttaactatgtttttacactgaaactc180tgagaaaaaacacaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcga240tgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaa300tctttgaacgcacattgcgccctctggtattccggagggcatgcctgttcgagcgtcatt360tcaaccctcaagcattgcttggtgttggggcactgcttttaacgaagcaggccctgaaat420ctagtggcgagctcgctaggaccccgagcgtagtagttaaaccctcgctttggaaggccc480tggcggtgccctgccgttaaacccccaacttctgaaaatttgacctcggatcaggtagga540atacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa578当前第1页12