专利名称：抗癌剂和治疗癌症的方法
技术领域：
本发明涉及癌症的治疗和用于治疗癌症的组合物。
抗癌剂的探索是全世界的医药工业、科研院所和政府机构一直并且仍然是一个主要努力的方向。伴随众多癌症治疗中的一个主要问题是它们对患者和非癌组织的严重的不良影响。
我们现已发现，拟茎点霉素真菌毒素(此后称为拟茎点霉素类)和它们的衍生物表现出强的抗癌活性。此外，由于拟茎点霉素类特别靶向肝的趋势，我们认为可用拟茎点霉素类来提供抗肝癌的选择性活性。应懂得，拟茎点霉素类在肝癌治疗中的选择性是一个有意义的优点，因为它能靶向肝癌同时使对其它组织的影响减到最小。
然而，通过选择配方或能提高药物对特定类型癌细胞或特定类型的癌的选择性的拟茎点霉素类衍生物，还可将拟茎点霉素类用于除肝癌以外的癌症的治疗。可以形成与单克隆抗体缀合的拟茎点霉素类衍生物。可由已知方法生产单克隆抗体而提供对癌细胞的选择性。
拟茎点霉素类(phomopsins)的特征在于通常具有式I的13-元环结构 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7是任选的取代基并且可独立选自下组氢、脂族基、芳族基、肽链和卤素。
X是脂族基、氢或卤素(优选是氢)；以及Y是脂族基、氢或卤素(优选是氯)；如果存在一个肽链的话，它可与单克隆抗体(Mab)缀合。拟茎点霉素类可以是式I化合物的衍生物(例如它的盐类)。
优选的拟茎点霉素类选自包含式Ia的基的化合物 及其衍生物。
在式I和Ia中，R1、R2、R3、R5、R6和R7可典型地独立选自氢和脂族基，而R4通常是肽。在一个实施方案中，R4是与抗体(特别是单克隆抗体(Mab))缀合的肽。更优选的是，R1、R2、R5和R6是低级脂族基，而R3和R7都是氢。甚至更优选的是，R1、R2和R6是低级烷基，而R5是低级烷基或低级烯烃。最优选的是，R1是乙基、R2是甲基，R3是氢，R5是异丙基或异丙烯基，而R6是甲基。本文所用的术语低级脂族基、低级烷基和低级烯烃包括含有至多6个碳原子、最优选至多4个碳原子的基。
式Ia的化合物优选的立体化学如式Ib所示
优选地，至少60wt％的拟茎点霉素组分将具有立体化学Ib。
基R4是肽，优选是二肽或三肽，它可任选地与抗体(如单克隆抗体)键合。优选的基R4有式II的结构且包括所有立体异构体 其中点线代表任选的双键；R8和R9独立选自氢和低级烷基，更优选地，R8是甲基，而R9是乙基，且R11和R10都是氢或一起形成一个双键；R12选自下组氨基、一取代氨基、二取代氨基和氨基酸残基，特别是式III的基 其中，R13和R14都是氢或一起形成一个双键，而R15选自下组羟基、氨基、取代氨基或抗体(特别是Mab)。
当R15是抗体或与抗体相连时，优选的是，R13和R14形成双键来提供脱氢天冬氨酸残基。在此例中，式III残基中的C-N键相对较弱，能使式Ia的活性拟茎点霉素(其中，式II的基中，R12是氨基)从MAb释放(一旦它与癌细胞结合)。这样，脱氢天冬氨酸残基可望通过Mab缀合物促进拟茎点霉素类的送递。
最优选的拟茎点霉素化合物选自拟茎点霉素A、八氢拟茎点霉素A、异拟茎点霉素A和拟茎点霉素胺A(phomopsinamine A)。这些化合物具有下列化学式
患者可用拟茎点霉素类的混合物来治疗，应懂得，在说明书和权利要求书中涉及的拟茎点霉素包括拟茎点霉素类的混合物。
一方面，本发明提供了治疗癌症(优选是肝癌)的药物组合物，它包含拟茎点霉素化合物或其衍生物或者拟茎点霉素类或衍生物的药物上可接受的盐以及药物上可接受的载体。
拟茎点霉素类的盐类(如碱金属盐)合理地是水溶性的。水溶液可通过将拟茎点霉素类溶解在稀碱(如氢氧化钠)中形成以提供中性溶液。
另一方面，本发明提供了治疗癌症患者的方法，它包括对患者施用拟茎点霉素化合物或其衍生物或者拟茎点霉素或衍生物的药物上可接受的盐。
拟茎点霉素化合物可通过各种方法施用，包括以糖浆、胶囊、片剂等形式口服，通过注射或者通过静脉内输注。
优选地，以静脉内输注施用所述化合物。
在又一方面，本发明提供了前文描述的拟茎点霉素化合物在制备用于治疗癌症(特别是肝癌)的药物组合物中的应用。
拟茎点霉素化合物是由某些真菌生产，包括Diaportetoxicus(以前的Phomopsis leptostromiformis)和Phomopsis emicis，或者可从这些天然产物得到。
认为拟茎点霉素类的活性部分地是由于该化合物与微管蛋白的强结合的缘故。这可通过抑制微管蛋白形成而破坏细胞有丝分裂，并且使形成的微管解聚。在一些例子中，可优选用拟茎点霉素类与一种或多种其它抗癌药物或疗法结合治疗。可选定与拟茎点霉素类联用的药物通过提供与微管结合的互补活性来增强结果。与拟茎点霉素类联用的可能的药物实例包括紫杉酚、长春碱和长春新碱。
现在将参照如下实施例描述本发明。应懂得，提供实施例只是为了阐述本发明，而决不是限制本发明的范围。
实施例为了由美国国家癌症研究所进行的抗癌活性的体外和体内评价，通过下列文献中描述的方法获得了拟茎点霉素A、异拟茎点霉素A、拟茎点霉素胺A和八氢拟茎点霉素AC.Culvenor，J.Edgar和M.Mackay，四面体(Tetrahedron)，Vol.45，No.8 pp 2351(1989)；以及J.Edgar，J.Frahn，P.Cockrum和J.Culvenor在论文“羽扇豆中毒。拟茎点霉素类的化学和生物化学”，真菌毒素和藻毒素(Mycotoxins and Phycotoxins)，在第六届国际IUPAC关于真菌菌素和藻毒素的讨论会提交的邀请论文集，Pretoria，Rep.South Africa，1985年7月22～25日，或本文描述的方法。拟茎点霉素A的分离背景设计提取方法使困难和花费最小。用再循环15％甲醇∶水通过成一排的(in line)XAD(苯乙烯二乙烯基苯共聚体)柱连续提取已发酵的种子。拟茎点霉素A在XAD上吸附所需的时间非常长，但只需最少的操作员输入(operator input)。该步操作的时间选择并不是关键的，因此可以适应操作条件。
拟茎点霉素A在15％的甲醇溶液中有比较低的溶解度。操作取决于拟茎点霉素A在XAD树脂上的吸附，使在发酵的种子中的拟茎点霉素A从溶解平衡趋于分解。该操作减少了溶剂的用量、处理的体积和易燃灾难。提取的替换方法(不用再循环)在初始提取时将用150+升纯甲醇，涉及进一步浓缩步骤(或甲醇提取至900+L的稀释)，然后在XAD上吸附。现在的操作使用了12L甲醇，要求吸附相最小的操作输入和用少得多的溶剂(总体积为85L而不是900+L)。
浓缩的拟茎点霉素A的从柱中洗脱是生产80～90％纯度的结晶拟茎点霉素A的3步分离中的第一步。
初步用15％的甲醇水溶液洗涤后，可用100％的甲醇从柱中洗脱拟茎点霉素A。可应用硅胶急骤柱色谱法来纯化。应用5∶95的氨∶异丙醇调节柱，将浓缩物溶于最小量的20∶65∶15氨∶异丙醇∶水中。用这种3溶剂混合物洗脱拟茎点霉素A。从沸腾的冰醋酸中重结晶提供了80～90％纯度的拟茎点霉素A。异拟茎点霉素A的制备原料0.5M HgCl2将200mg HgCl2溶于2ml水中(+50μl 10M HCl)。0.01M拟茎点霉素A将18.3mg PhA溶于2ml水中(吹入NH3)。1M HCl方法将0.01M拟茎点霉素A(2.0ml)与0.5M HgCl2(1ml)和1MHCl(200μl)混合，总体积3.2ml，在室温下放置5小时。用水稀释该溶液至8ml，然后通过一个制备C18 Maxi-clean SPE柱(900mg)，用7～8ml水洗涤。再用8～9ml MeOH洗脱吸附的异拟茎点霉素A。来自第一个C18柱的水性洗脱液通过第二个C18柱再处理以检验第一个柱是否过载。来自第二个柱的MeOH洗脱液在干燥后具有很少的残余物，所以不包括在进一步的处理中。
通过HPLC分析甲醇洗脱液(配成10ml)，然后蒸发至干，用制备HPLC纯化。拟茎点霉素胺A的制备将拟茎点霉素A(15.3mg)溶于最小量的1M HCl中，在室温下放置28小时。用水将反应混合物稀释到8ml，再通过一强阴离子交换柱(SAX，600mg)以移去任何未反应的拟茎点霉素A(预计溶液pH值约为1.52)。然后，使未吸附的化合物的水溶液和SAX柱的水洗涤液都通过制备C18柱(900mg)。用水(10ml)洗涤C18柱，再用甲醇(10ml)洗脱拟茎点霉素胺A。
使甲醇洗脱液经过HPLC分析，然后蒸发至干，用制备C18柱纯化拟茎点霉素胺A。
该方法可通过在5～6小时，24小时和28～30小时后对反应混合物取样来改良。可通过HPLC分析所有的洗涤液和洗脱液来监测拟茎点霉素A向拟茎点霉素胺A的转化。拟茎点霉素类的抗癌活性体外筛查检测在体外对60个人癌细胞系估测了拟茎点霉素A、八氢拟茎点霉素A、异拟茎点霉素A和拟茎点霉素胺A的抗癌活性。估测抗癌活性所用的方法是美国国家癌症研究所作为初步筛查为发现具有抗癌潜能的化合物应用的那些(Boyd和Paull，药物开发研究(Drug DevelopmentResearch)，34，91～109，1995)。
现在根据下面两种表达式中的一种或另一种来计算化合物对于细胞系生长百分数的测量效果如果(平均ODtest-平均ODtzero)≥0，那么PG＝100×(平均ODtest-平均ODtzero)/(平均ODctrl-平均ODtzero)如果(平均ODtest-平均ODtzero)＜0，那么PG＝100×(平均ODtest-平均ODtzero)/平均ODtzero其中平均ODtzero＝就在细胞接触试验化合物前，SRB产生的颜色的光密度测定平均值。平均ODtest＝在细胞接触试验化合物48小时后，SRB产生的颜色的光密度测定平均值。平均ODctrl＝细胞没有接触试验化合物时，48小时后SRB产生的颜色的光密度测定平均值。结果表1a～4b中列出了关于不同浓度的试验化合物对60个细胞系中的每一个计算的PGs。对每种化合物进行了两次试验，这些化合物拟茎点霉素A(表1a和1b)、八氢拟茎点霉素A(表2a和2b)、iso拟茎点霉素A(表3a和3b)和拟茎点霉素胺A(表4a和4b)的试验结果表明，大多数测试的癌细胞系对拟茎点霉素A、异拟茎点霉素A、八氢拟茎点霉素A和拟茎点霉素胺A有剂量相关的响应。特别是，这些数据支持了体内试验的估测操作的进展。
表1a化合物1拟茎点霉素AID No9502RM16Log10 浓度生长百分数细胞系-6 -7 -6 -5 -4白血病CCRF-CEM 99 106 98 34 -24HL-60(TB)101 101 76 -17 -43K-562 97 102 87 24 -23MOLT-499 103 95 43 29RPMI-8226111 109 103 36 -5SR 118 111 53 -16 -35非小细胞肺癌A549/ATCC102 103 69 31 17EKVX 102 106 85 40 11HOP-62 104 106 96 72 56HOP-92 114 116 110 91 90NCI-H226 107 121 67 -4 -26NCI-H23 105 102 101 74 36NCI-H322M102 98 94 308NCI-H460 103 111 83 169NCI-H522 103 105 100 18 -21结肠癌COLO 205 107 75 57 -54 -79HCC-2998 95 95 74 4 -46HCT-116 97 102 101 32 11HCT-1590 97 74 26 10HT29 95 97 91 145KM12 100 83 62 125SW-62096 107 101 62 44CNS癌SF-268 101 101 89 51 36SF-295 107 102 74 218SF-53994 94 69 -18 -54SNB-1993 97 92 44 22SNB-7593 77 48 -11 21U251 100 102 89 164黑素瘤LOX IMVI 90 97 82 43 20MALME-3M 101 92 65 32 25M14 98 83 64 0 -27SK-MEL-2 97 95 84 32 11SK-MEL28 94 83 68 44 37SK-MEL-5 100 87 48 30 23UACC-257 113 104 72 60 70UACC-62 101 95 79 38 26卵巢癌IGR-OV1 99 102 97 73 44OVCAR-3 102 97 64 114OVCAR-4 99 84 114 63 54OVCAR-5 101 102 78 20 27OVCAR-8 95 99 97 628SK-OV-3 104 97 70 19 11肾癌786-0105 90 86 26 18A498 96 91 67 60ACHN 101 91 89 48 36CAKI-190 88 63 37 28RXF-393 91 87 49 25 39SN12C104 104 92 64 38TK-10 94 101 85 68 53UO-31 98 94 91 64 48前列腺癌PC-3 100 89 66 20 10DU-145 108 102 66 8 -13乳腺癌MCF7 98 92 67 216MCF7/ADR-RES 99 99 90 48 13MDA-MB-231/Alcc 99 101 93 772HS 578T 104 107 101 71 75MDA-MB-43598 60 16 -46 -80MDA-N 93 71 -29 -86 -79BT-549 100 121 112 60 56T-47D 91 107 71 47 73
表1b化合物1拟茎点霉素AID No94O9SC89Log10浓度生长百分数细胞系-6 -7 -6 -5 -4白血病CCRF-CEM 84 86 80 -2 -47HL-60(TB) 75 88 76 -31 -65K-562105 121 93 33 11MOLT-498 93 90 28 28RPMI-8226103 94 87 9 -27SR90 88 88 25 19非小细胞肺癌A549/ATCC107 103 82 34 25EKVX 107 99 92 58 45HOP-62 100 114 99 57 35NCI-H226 87 85 96 34 -5NCI-H23 101 101 88 20 -2NCI-322M 93 93 80 27 44NCI-H460 101 95 80 12NCI-H522 102 102 93 9 -21结肠癌COLO 205 99 108 69 -27 -44HCC-2998 104 96 87 11 -37HCT-116 102 94 93 32 15HCT-15 102 99 103 35 15HT29 95 95 92 -14 -52KM12 92 87 61 -19 -52SW-620 104 104 93 34 22CNS癌SF-268 104 106 87 40 16SF-295 100 94 74 -45 -53SF-53999 102 98 32 -7SNB-19 101 98 94 56 33SNB-7583 55 28 15 16U251 103 98 91 26 9黑素瘤LOX IMVI 101 108 100 46 37M14 99 110 76 19 -31SK-MEL-2 87 92 74 32 16SK-MEL-28 96 98 69 37 51SK-MEL-5 106 101 54 22 10UACC-257 98 92 75 26 42卵巢癌IGROV1 104 119 109 57 27OVCAR-5 99 100 82 24 19OVCAR-8 105 133 104 59 30SK-OV-3 94 114 89 26 47肾癌786-0 91 97 98 38 17A498 99 100 83 17 -5ACHN 98 90 90 43 21SN12C105 100 103 59 28TK-10100 106 98 92 55前列腺癌PC-3 99 100 86 21 15DU-14599 105 83 22 20乳腺癌MCF7 98 100 76 23 12MCF7/ADR-RES 97 100 86MDA-MB-231/ATCC 99 98 96 66 30HS 578T 113 109 79 23 4MDA-MB-43590 81 34 1 -23MDA-N103 101 23 -75 -63BT-549 107 110 100 65 49T-47D 95 98 74 32 56
表2a化合物1八氢拟茎点霉素AID No9409SC89Log10浓度生长百分数细胞系 -6 -7 -6 -5 -4白血病CCRF-CEM 90 96 82 8 -3HL-60(TB) 106 95 88 -25 -49K-562 100 108 92 22 14MOLT-4 103 112 105 39 20RPMI-8226 110 99 84 7 -33SR 94 96 92 27 15非小细胞肺癌A549/ATCC 105 104 97 47 12EKVX 95 97 88 62 44HOP-62 103 96 105 72 43NCI-H226 85 75 85 33 -22NCI-H23 110 118 104 69 12NCI-H322M 100 99 91 49 26NCIH460 99 99 96 29 2NCIH522 99 99 88 5结肠癌COLO 205 97 100 70 1 -82HCC-2998135 -16HCT-116 104 103 100 41 14HCT-15 96 97 97 58 16HT29 93 91 90 30 6KM12108 124 139 63 -8SW-620 95 98 87 34 32CNS癌SF-268 101 100 86 43 22SF-295 88 88 72 -27 -65SF-539 101 95 95 27 -32SNB-19 100 97 99 59 38SNB-75 90 111 89 -7 27U251 96 99 90 20 -3黑素瘤LOX IMVI 97 100 92 52 39M14 101 70 94 24 -51SK-MEL-2111 109 106 38 60SK-MEL-28 105 94 69 29 41SK-MEL-5 93 105 45 3 -19UACC-257 98 97 85 36 37卵巢癌IGROV1 108 107 99 52 34OVCAR-5 102 94 96 57 24OVCAR-8 106 99 100 62 29SK-OV-3 85 98 79 27 -11肾癌786-0 104 110 127 95 54A498104 100 103 49 16ACHN 99 96 86 61 22SN12C99 96 92 63 28TK-1097 96 101 87 51前列腺癌PC-3 89 100 90 37 21DU-145 105 108 95 29 -4乳腺癌MCF7115 108 108 34 26MCF7/ADR-RES107 106 105 66 -15MDA-MB-231/ATCC 100 95 83 53 23HS 578T 90 90 72 13 -10MDA-MB-435 100 91 59 13 -14MDA-N 101 99 51 -9 -23BT-549 111 75 87 57 37T-47D95 122 89 45 48
表2b化合物1八氢拟茎点霉素AID No950RM16Log10浓度生长百分数细胞系 -6 -7 -6 -5 -4白血病CCRF-CEM 99 102 93 28 -33HL-60(TB) 100 81 932 -33K-S62 104 100 99 27 -21MOLT-4 104 99 103 46 26RPMI-822694 87 96 39 -3SR 78 92 54 -9 -35非小细胞肺癌A549/ATCC 104 93 101 57 21EKVX105 93 93 52 23HOP-62 89 90 85 55 21HOP9298 99 92 51 76NCI-H226108 104 102 23 -14NCI-H23 94 96 85 57 27NCI-H322M99 98 99 74 17NCI-H460105 101 104 45 15NCI-H522108 103 102 27 -13结肠癌COLO 205101 94 74 13 -13HCC-2998 97 100 104 48 -13HCT-116 105 100 101 42 17HCT-15 90 98 81 45 22HT29 97 96 101 618KM12101 96 99 40 20SW-620 100 93 92 58 36CNS癌SF-268 101 98 86 52 46SF-295 93 79 74 220SF-539 83 90 871 -55SNB-19 101 103 104 50 23SNB-75 99 102 52 -11 16U251103 96 97 309黑素瘤LOX IMVI 91 91 85 45 25MALME-3M 99 96 84 46 27M14 90 98 98 435SK-MEL-2101 96 93 40 12SK-MEL-28 106 90 76 48 43SK-MEL-5110 107 72 36 28UACC-257105 105 74 65 88UACC-62 104 96 87 31 18卵巢癌IGR-OV1 94 95 94 68 42OVCAR-3 103 99 87 31 13OVCAR-4 106 90 94 85 99OVCAR-5 107 104 105 62 26OVCAR-8 98 99 95 70 19SK-OV-3 104 90 98 43 10肾癌786-0 113 96 90 48 33A498104 96 100 51 20ACHN100 103 104 81 52CAKI-1 95 72 69 36 32RXF-393 95 93 81 52 42SN12C91 93 92 63 40TK-1092 98 83 91 59UO-31 100 92 99 75 52前列腺癌PC-3104 99 93 42 12DU-145 100 97 94 17 -1乳腺癌MCF7104 100 94 48 46MCF7/ADR-RES102 98 97 61 23MDA-MB-231/ATCC 97 67 72 64 22HS 578T 103 92 87 51 83MDA-MB-435 101 89 40 -25 -66MDA-N85 81 11 -77 -80BT-549 123 108 96 46 38T-47D99 100 86 59 77
表3a化合物1异拟茎点霉素AID No9409SC89Log10浓度生长百分数细胞系 -6 -7 -6 5 -4白血病CCRF-CEM103 97 92 7 -43HL-60(TB) 106 98 98-29 -59K-562 128 123 112 25 5MOLT-4 97 105 106 46 5RPMI-8226 106 104 87 0 -14SR 96 99 94 28 5非小细胞肺癌A549/ATCC 104 103 90 31 11EKVX103 101 98 64 58HOP-62 95 82 79 53 21NCI-H226 95 93 110 39 -15NCI-H23 99 105 93 37 16NCI-H322M95 100 85 34 51NCI-H460 95 96 85 7 -32NCI-H422100 99 95 10 -76结肠癌COLO 205102 106 76-45 -48HCC-2998 96 99 92 15 -35HCT-116 100 111 99 30 6HCT-15 100 102 102 40 16HT29 98 98 93-30 -26KM12116 98 62-33 -69SW-620 99 99 87 23 2CNS癌SF-268 102 94 87 46 31SF-295 100 93 88-36 -52SF-539 96 95 82 28 6SNB-19 100 98 89 57 37SNB-75 84 102 106 23 36U251 97 93 83 15 -20黑素瘤LOX IMVI 99 96 91 43 19M14 78 81 46 -6 -58SK-MEL-2100 95 80 18 0SK-MEL-2893 95 78 47 43SK-MEL-5117 110 41 -2 1UACC-257 98 96 85 20 27卵巢癌IGROV1 105 106 94 49 27OVCAR-5 102 100 95 30 25OVCAR-8 103 107 105 66 32SK-OV-3 105 106 86 24 35肾癌786＝0 93 94 99 40 24A498 97 93 95 21 3ACHN101 95 91 46 21SN12C 102 99 101 65 24TK10101 103 101 87 58前列腺癌PC-3101 106 85 28 18DU-145 106 111 97 16 5乳腺癌MCF7102 92 69 20 3MCF7/ADR-RES106 109 95 19 2MDA-MB-231/ATCC 102 100 107 64 26HS 578T 103 80 69 38 31MDA-MB-435 98 106 58-20 3MDA-N 103 92 42 -7 -37BT-549 116 108 123 71 32T-47D 104 96 103 42 42
表3b化合物1异拟茎点霉素AID No9502RM16Log10浓度生长百分数细胞系-6 -7-6-5-4白血病CCRF-CEM 1031069725-21HL-60(TB) 9510083 -19-41K-562 1001049219-17MOLT-4102100 10144 24RPMI-8226 1101109719 6SR100 9641 -15-22非小细胞肺癌A549/ATCC 1041007733 19EKVX 941019644 22HOP-62 94 948954 26HOP-92 96 967666 86NC-H226 11411088-6-27NCI-H23 1041058348 39NCI-H322M 106 989632 14NCI-H460 931057920 4NCI-H522 101 978815 -4结肠癌COLO20590 7644 -34-70HCC-2998 98 9782-8-64HCT-11693 887921 4HCT-15 97 988529 14HT29 991008510 6KM12 91 874715 -6SW-620 97 998340 35CNS癌SF-268 94 928852 37SF-295 951007312-11SF-539101 9776 -29-68SNB-19 971008944 20SNB-75 9710484-3 60U251 98 967711 4黑素瘤LOX IMVI 981009245 30MALME-3M 100 896426 17M14 101 80695 -26SK-MEL-2 94 997523 17SK-MEL-28 93 887740 24SK-MEL-5 99 876029 35UACC-257 84 927846 58UACC-6296 968345 29卵巢癌IGR-OV198 979358 36OVCAR-397 90463 -17OVCAR-497 927962 47OVCAR-597 996815 21OVCAR-8 106106 10674 34SK-OV-395 927623 6肾癌786-0 94 847932 16A498 82 84870 -16ACHN 101108 10156 48CAKI-1 901048247 46RXF-393 1001027542 35SN12C 95 939361 28TK-10 1011059796 71U0-31 97 969667 48前列腺癌PC-3 100 946823 23DU-14510710072-5 -9乳腺癌MCF7 99 989032 12MCF7/ADR-RES 94 958744 7MDA-MB-231/ATCC971109273 18HS 578T99 707048 58MDA-MB-435103 8734 -35-69DMDA-N103 82 -16 -84-68BT-549102 989050 48T-47D 84 907641 52
表4a化合物1拟茎点霉素胺AID No9409SC89Log10浓度生长百分数细胞系 -6-7-6-5-4白血病CCRF-CEM 979349 -13 7HL-60(TB) 104 10356 -53 -55K-562 105 10053 6 2MOLT-4 9593912617RPMI-8226 106 10365 9SR10495712612非小细胞肺癌A549/ATCC 99 100531918EKVX 8996804438HOP-62105 101752934NCI-H226 828463 -12 -31NCI-H23 110 1127811-9NCI-H322M 9697613136NCI-H460 104 111374-35MNCI-H522 666240 -42 -54结肠癌COLO 205 109 10336 -22 -72HCC-2998 109 11360 -16 -59HCT-11699996314 1HCT-15 93947619 2HT29 101 10250 -53 -64KM12 110 123774740SW-620 93 100592124CNS癌SF-268101 100703213SF-295 878656 -22 -27SF-539 97 10277 -18 -44SNB-19 8694652720SNB-75 6378361122U251 878740 0 -39黑素瘤LOX IMVI 98 101733828SK-MEL-2 1029637-1-6SK-MEL-28 10093654249SK-MEL-5 10299321714UACC-257 9595663142卵巢癌IGROVI10098693719OVCAR-5 10293601115OVCAR-881 1038555 2SK-OV-3 101 107592714肾癌786-0 10098913115A498 111 101822-11ACHN 99 100774121SN12C 9693823313TK-10 98 100915031前列腺癌PC-3 9790401818DU-145 99994810 1乳腺癌MCF7 114 116381510MCF7/ADR-RES 1039987-7 -48MDA-MB-231/ATCC9596862915HS 578T878750 6-5MDA-MB-43512671 -15 -55 -32MDA-N 9387-6 -58 -49BT-549145855129 -25T-47D 99105 722668
表4b化合物1拟茎点霉素胺A Log10浓度ID No9502RM16 生长百分数细胞系 -8 -7-6-5-4白血病CCRF-CEM 1019967-7-34HL-60(TB)1069626 -37-47K-562100 10063-3-15MOLT-4 104998825 9RPMI-82261079961 6 4SR 104689-15-21非小细胞肺癌A549/ATCC 97814421 7EKVX997941 36HOP-6296 1018653 45HOP-92 128 120 10098 59NCI-H226 114 10447 -14-27NCI-H23 101947333 34NCI-H322M104 1017323 17NCI-H460 100 1023712 14NCI-H522 100 1027235-24结肠癌COLO 205 988228 -24-45HCC-2998 10343 -32-33HCT-116 93935016 8HCT-15 935922 6HT29 98 10140 4 4KM12 968126 9 1SW-62097937140 31CNS癌SF-26898946447 30SF-295 10381240SF-539 1029553 -45-60SNB-1998946130 21SNB-75 116 1103610 20U251 104894111 12黑素瘤LOX IMVI957537 21MALME-3M 100785529 25M14 999556 1 -1SK-MEL-2 99917017 16SK-MEL-28 866024 45SK-MEL-5 99683827 19UACC-257 103947364 73UACC-62 97935335 37卵巢癌IGR-OV1 95957947 30OVCAR-3 1017710 1 -6OVCAR-4 98 1028959 45OVCAR-5 99 1055025 35OVCAR-81029242 22SK-OV-3 1009751 0 4肾癌786-0108 1016926 20A498 11761-7-16ACHN 102 1017153 38CAKI-186827545 48RXF-393 88855611 50SN12C 86907948 30TK-10 100 11173 73UO-31102 1049753 53前列腺癌PC-3 102853820 10DU-145 1009335 -12 1乳腺癌MCF7 103 1064327 9MCF7/ADR-RES 97968546 21MDA-MB-231/ATCC 96907627 2HS 578T 102727062 77MDA-MB-435 6110-42 -27MDA-N 9451-58 -86 -65BT-549 1109652 4143T-47D 93 10077 5478
体内，中空纤维筛查检测发育治疗程序的生物试验分支(the Biological Testing Branchof the Developmental Therapeutics Program)已采用了一个初步的体内筛查工具来估测通过大规模体外细胞筛查鉴定的化合物的潜在抗癌活性(Hollingshead，MG etal.，生命科学(Life Sciences)，57，131～141，1995)。就这些检测来说，在聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)中空纤维中培养人肿瘤细胞，将每个细胞系的一个样本移植到小鼠的两个生理区室(腹膜内和皮下)的每一个中。该方案鉴别具有中度至明显抗癌活性的化合物，促进敏感性肿瘤系的鉴定和随后在标准体内实体瘤模型中测试合适的治疗方案的鉴定。方法每个试验小鼠接受代表3个不同癌细胞系的6个纤维(腹膜内3个和皮下3个)。采用QD×4治疗方案用潜在的抗癌化合物以2个试验剂量的每个剂量通过腹膜内途径处理三个小鼠。6只载体对比小鼠只接受化合物稀释剂。在处理的最后一天次日收集纤维培养物。为了估计抗癌效果，采用甲腊染料(MTT)转化检测法确定每个细胞系的存活细胞质量。由此，可采用经过化合物处理的样本的平均光学密度除以载体对比物的平均光学密度来计算％T/C。此外，对每一个样本可测定细胞质量的净增长，因为纤维培养物的样本估测植入小鼠的那天的存活细胞质量。这样，可估测试验化合物的抑制细胞能力和杀细胞能力。
通常，对最少12个人癌细胞系测试了每种化合物。这代表共4个实验(由于每个实验包括3个细胞系)。关于2个化合物剂量中的每一个对每个细胞系、分别用对于腹膜内样本和皮下样本计算的值以％T/C报导了数据。评估基于几个中空纤维检测判据，用标准皮下异种移植模型选定了用于进一步进行体内试验的化合物。这些判据包括(1)在48个可能的试验组合(12个细胞系×2个位点×2个化合物剂量)的10个中，％T/C为50或更小；(2)在24个可能的组合中，最少4个具有远距离活性(腹膜内药物/皮下培养物)；和/或(3)在任一植入部位，1个或多个细胞系的净细胞杀伤。为简化评估，已经采用了使得能快速观测给定化合物活性的点系。为此，赋予每种化合物剂量2个值，它可导致存活细胞质量减小50％或更多。对腹膜内样本和皮下样本单独记分以便可评估判据(1)和(2)。将组合IP+SC分≥20，SC分≥8或者一个或多个细胞系的净细胞杀伤的化合物用来进行异种移植试验。通过比较在中空纤维检测和异种移植试验中随意选定的化合物＞80的活性结果，这些判据是统计有效的。该比较表明，如果将中空纤维检测用作最初的体内筛查工具，遗漏活性化合物的可能性极低。除了这些判据之外，其它因素(如独特的结构、作用机制)可导致安排某化合物进行标准异种移植试验而没有化合物符合这些判据。结果得到的关于拟茎点霉素A的数据阐明了显著的细胞生长抑制和杀细胞活性，由表5中所示的各种细胞系的％T/C结果证明了这一点。
表5对于拟茎点霉素A的中空纤维检测(％试验/对比，％T/C)
数据来自对植入细胞系的重复估侧IP＝腹膜内SC＝皮下最后，应懂得，可对前文描述的组合物和/或步骤安排进行各种改变、修饰和/或添加而不偏离本发明的精神或范围。
权利要求
1.一种治疗癌症患者的方法，它包括对患者施用有效量的拟茎点霉素。
2.权利要求1的方法，其中，用选自式I化合物及其衍生物的化合物来治疗患者 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7是任选取代基；X选自下组脂族基、氢和卤素；以及Y选自下组脂族基、氢和卤素。
3.权利要求2的方法，其中，用选自式I化合物及其衍生物和盐的化合物来治疗患者，其中，在所述的式I化合物中，取代基X是氢，Y是氯，而R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7独立选自下组氢、脂族基、芳族基、肽链和卤素，并且其中，可在肽链和单克隆抗体之间形成缀合物。
4.权利要求1的方法，其中，对患者施用有效量的式Ia化合物或其衍生物或盐 其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7独立选自氢和脂族基，而R4则是任选与抗体缀合的肽。
5.权利要求4的方法，其中，R1、R2、R5和R6是低级脂族基，而R3和R7都是氢。
6.权利要求4的方法，其中，R1是乙基，R2是甲基，R3是氢，R5是异丙基或异丙烯基，R6甲基，而R7则是氢。
7.权利要求4～6任一项的方法，其中，式Ia的拟茎点霉素包括立体化学Ib化合物
8.权利要求7的方法，其中，存在的至少60wt％的拟茎点霉素类是立体化学Ib。
9.权利要求2～7任一项的方法，其中，R4是任选与抗体键合的二肽或三肽。
10.权利要求8的方法，其中，R4具有所有可能的立体化学排列的式II 其中，点线表示任选的双键；R8和R9独立地选自氢和低级烷基；而R10和R11是氢，或者一起形成一个双键；R12选自氨基、一取代氨基、二取代氨基和氨基酸残基。
11.权利要求10的方法，其中，R12具有式III 其中，R13和R14都是氢或一起形成一个双键，而R15选自羟基、氨基、取代氨基和单克隆抗体。
12.权利要求1的方法，其中，用选自下组的拟茎点霉素治疗患者拟茎点霉素A、八氢拟茎点霉素A、异拟茎点霉素A、拟茎点霉素胺A、其盐类和它们中的两个或多个的混合物。
13.权利要求1～12任一项的方法，其中，所述患者患有肝癌。
14.权利要求1～13任一项的方法，其中，以含有药物上可接受的载体的药物组合物形式施用所述拟茎点霉素或其衍生物。
15.权利要求1～14任一项的方法，其中，还用一种或多种其它的抗癌药物与拟茎点霉素结合治疗患者。
16.权利要求1～15任一项的方法，其中，以产生抗癌活性但对正常细胞无不利的细胞毒性作用的剂量施用拟茎点霉素。
17.一种治疗癌症的药物组合物，它包含式I的化合物或其衍生物和药物上可接受的载体，于是 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7是任选的取代基；X选自下组脂族基、氢和卤素；以及Y选自下组脂族基、氢和卤素。
18.一种治疗癌症的药物组合物，它包含式Ia的化合物或其盐 其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7独立选自氢和脂族基，而R4则是任选与抗体缀合的肽。
19.权利要求17的药物组合物，其中，拟茎点霉素或其衍生物选自下组拟茎点霉素A、八氢拟茎点霉素A、异拟茎点霉素A、拟茎点霉素胺A、其盐类和它们中的两个或多个的混合物。
全文摘要
一种治疗癌症患者的方法,它包括对患者施用有效量的拟茎点霉素。
文档编号A61K38/08GK1376071SQ00813444
公开日2002年10月23日 申请日期2000年9月29日 优先权日1999年9月29日
发明者J·A·爱德加 申请人:联邦科学和工业研究组织