本发明属于生物活性物质提取技术领域，具体涉及一种弹性蛋白肽的提取方法。
背景技术：
弹性蛋白是弹性纤维的主要组成之一，弹性纤维是由均质状的弹性蛋白和外面包绕微原纤维壳组成。微原纤维是由一些糖蛋白构成的，为所必需的保持弹性纤维的完整性的成分。在机体发育的弹性组织内，糖蛋白微原纤维，是弹性蛋白附着的骨架，常先于弹性蛋白出现,对于弹性蛋白分子组装成弹性纤维具有重要的作用。弹性蛋白为一种高度交叉的水不溶性水解蛋白，分子量为70kda。弹性蛋白分子中非极性氨基酸（疏水性氨基酸）占95%，甘氨酸含量占总量的1/3，脯氨酸占10%，羟脯氨酸占1%，其具有抗酸、碱水解作用。弹性蛋白除断裂肽键剂外，不溶于任何溶剂，是一种在有水情况下具有橡胶延展性和低弹性模量的聚合物质。虽然弹性蛋白分布没有胶原蛋白广泛，但也大量存在于肺、大动脉、某些韧带、皮肤及耳廓等富含弹性的组织内。
在光老化过程中，基质金属蛋白酶表达上调从而引发弹性蛋白降解，致使皮肤组织出现日光性弹力纤维变性，致使皮肤老化。通过向化妆品中添加弹性蛋白水解产物用于延缓皮肤衰老、对抗光老化、促进皮肤细胞增殖和诱导皮肤年轻化。另外，弹性蛋白作为一种细胞外基质蛋白，在体内可与微原纤维结合形成弹性纤维，其主要功能是被动伸缩，赋予经常受力而形变的组织器官以伸缩性和可逆的形变能力。近年研究发现，单性蛋白的变化与多种疾病有关，如动脉瘤、动脉粥样硬化和面型阻塞性肺疾病等。
随着市场对弹性蛋白肽需求的与日俱增，现有弹性蛋白肽的制备工艺，因制备工艺繁琐、成本高、效率低等问题，以远不能满足需要。因此，需要一种更高效的弹性蛋白肽制备工艺。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有弹性蛋白肽提取方法的不足，提供一种弹性蛋白肽的提取方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种弹性蛋白肽的提取方法，包括以下具体步骤：
（1）鱼软骨剔除鱼肉等杂质，洗净绞碎后，加入2-3倍体积的95%乙醇溶液浸泡6小时，去乙醇，重复用95%乙醇溶液重复浸泡一次，去乙醇，蒸馏水洗涤2次。
（2）经洗涤后的鱼软骨中加入tris-hcl缓冲液，然后进行超声波处理；
（3）经超声波处理后的软骨溶液中，加入弹性蛋白酶，恒温水浴振荡培养；
（4）灭酶，将酶解液抽滤，弃滤渣，收集滤液；
（5）步骤（4）所得滤液在超滤条件下，用超滤膜进行第一次超滤，收集透过液；
（6）步骤（5）收集所得的透过液，加入1倍体积的ph9.0的tris-hcl缓冲液，混匀后，在超滤条件下，进行第二次超滤，收集超滤液；
（7）步骤（6）所得超滤液，透析除盐，旋转蒸发，冷冻干燥后的弹性蛋白多肽。
步骤（2）中，tris-hcl的ph为9.0，加入量为每100g鱼软骨中加入250-300mltris-hcl缓冲液；超声处理的超声频率为60khz，功率为150w，超声处理时间为30min。
步骤（3）中，弹性蛋白酶的加入量为每100g超声波处理后的软骨溶液中加入400-500mg弹性蛋白酶；其中恒温水浴的温度为30℃，振荡速度为150r/min，振荡培养时间为1-1.5h。
步骤（4）中，灭酶为水浴升温至40℃，保温10min。
步骤（5）中，第一次超滤，选用截留分子量为10kda的超滤膜进行超滤，超滤条件为操作压力为0.05-1.0mpa，操作温度为30℃。
步骤（6）中，第二次超滤，选用截留分子量为1kda的超滤膜进行超滤，超滤条件为操作压力为0.05-1.0mpa，操作温度为30℃。
一种上述方法制备的弹性蛋白肽。
一种上述方法制备的弹性蛋白肽在护肤品、保健品或药品中的应用。
含上述单性蛋白肽的护肤品、保健品或药品。
本发明的优点在于：
（1）本发明利用鱼软骨为原料，实现鱼的低值化高效利用。
（2）本发明的提取方法简单快速，提取效率高，成本低。
（3）本发明制备的弹性蛋白多肽，还原力强，能有效清除自由基，抗氧化效果佳，能够显著提高皮肤中胶原蛋白肽的含量。在食品、化妆品、医药行业具有广泛的应用价值。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
一种弹性蛋白肽的提取方法，包括以下具体步骤：
（1）500g鱼软骨剔除鱼肉等杂质，洗净绞碎后，加入2倍体积的95%乙醇溶液浸泡6小时，去乙醇，重复用95%乙醇溶液重复浸泡一次，去乙醇，蒸馏水洗涤2次；
（2）经洗涤后的鱼软骨中每100g中加入250mlph9.0的tris-hcl缓冲液，然后超声频率60khz，功率150w，超声处理时间为30min；
（3）每100g超声波处理后的软骨溶液中加入400mg弹性蛋白酶，30℃恒温水浴，150r/min振荡培养1h；
（4）水浴升温至40℃，保温10min灭酶后将，将酶解液抽滤，弃滤渣，收集滤液；
（5）步骤（4）所得滤液，选用截留分子量为10kda的超滤膜进行第一次超滤，超滤条件为操作压力为1.0mpa，操作温度为30℃，收集透过液；
（6）步骤（5）收集所得的透过液，加入1倍ph9.0的tris-hcl缓冲液，混匀后，选用截留分子量为1kda的超滤膜进行第二次超滤，超滤条件为操作压力为1.0mpa，操作温度为30℃；
（7）步骤（6）所得超滤液，透析除盐，旋转蒸发，冷冻干燥后的弹性蛋白多肽。
检测本实施例制备所得弹性蛋白肽的抗氧化值（还原力，dpph清除能力、abts清除率），及对模型裸鼠皮肤弹性蛋白含量的影响。
实施例2
一种弹性蛋白肽的提取方法，包括以下具体步骤：
（1）1000g鱼软骨剔除鱼肉等杂质，洗净绞碎后，加入3倍体积的95%乙醇溶液浸泡6小时，去乙醇，鱼软骨重复用95%乙醇溶液重复浸泡一次，去乙醇，蒸馏水洗涤2次；
（2）经洗涤后的鱼软骨中每100g中加入300mlph9.0的tris-hcl缓冲液，然后超声频率60khz，功率150w，超声处理时间为30min；
（3）每100g超声波处理后的软骨溶液中加入500mg弹性蛋白酶，30℃恒温水浴，150r/min振荡培养1h；
（4）水浴升温至40℃，保温10min灭酶后将，将酶解液抽滤，弃滤渣，收集滤液；
（5）步骤（4）所得滤液，选用截留分子量为10kda的超滤膜进行第一次超滤，超滤条件为操作压力为0.8mpa，操作温度为30℃，收集透过液；
（6）步骤（5）收集所得的透过液，加入1倍ph9.0的tris-hcl缓冲液，混匀后，选用截留分子量为1kda的超滤膜进行第二次超滤，超滤条件为操作压力为0.8mpa，操作温度为30℃；
（7）步骤（6）所得超滤液，透析除盐，旋转蒸发，冷冻干燥后的弹性蛋白多肽。
检测本实施例制备所得弹性蛋白肽的抗氧化值（还原力，dpph清除能力、abts清除率），及对模型裸鼠皮肤弹性蛋白含量的影响。
实施例3
一种弹性蛋白肽的提取方法，包括以下具体步骤：
（1）600g鱼软骨剔除鱼肉等杂质，洗净绞碎后，加入2.5倍体积的95%乙醇溶液浸泡6小时，去乙醇，鱼软骨重复用95%乙醇溶液重复浸泡一次，去乙醇，蒸馏水洗涤2次；
（2）经洗涤后的鱼软骨中每100g中加入280mlph9.0的tris-hcl缓冲液，然后超声频率60khz，功率150w，超声处理时间为30min；
（3）每100g超声波处理后的软骨溶液中加入450mg弹性蛋白酶，30℃恒温水浴，150r/min振荡培养1h；
（4）水浴升温至40℃，保温10min灭酶后将，将酶解液抽滤，弃滤渣，收集滤液；
（5）步骤（4）所得滤液，选用截留分子量为10kda的超滤膜进行第一次超滤，超滤条件为操作压力为0.5mpa，操作温度为30℃，收集透过液；
（6）步骤（5）收集所得的透过液，加入1倍ph9.0的tris-hcl缓冲液，混匀后，选用截留分子量为1kda的超滤膜进行第二次超滤，超滤条件为操作压力为0.5mpa，操作温度为30℃；
（7）步骤（6）所得超滤液，透析除盐，旋转蒸发，冷冻干燥后的弹性蛋白多肽。
检测本实施例制备所得弹性蛋白肽的抗氧化值（还原力，dpph清除能力、abts清除率），及对模型裸鼠皮肤弹性蛋白含量的影响。
对比例
一种利用猪牛软骨提取活性胶原蛋白和弹性蛋白的方法，包括如下步骤：
（1）将猪软骨捣碎成片状，然后采用生理盐水和蒸馏水各洗涤2次，以去除脂肪组织；
（2）在经步骤（1）处理后的猪软骨中加入摩尔浓度为0.5mol/l的醋酸，调整ph值为2.5，然后加入胃蛋白酶，4℃消化72h；
（3）将经步骤（2）处理得到的产物进行过滤，除去可见的杂质；
（4）将经步骤（3）处理得到的产物进行离子交换，以消除金属离子和非金属离子的安全以及应用上的问题；
（5）将经步骤（4）处理得到的产物的浓度提升至30％；
（6）将经步骤（5）处理得到的产物进行瞬时高温灭菌，将制备过程中产生或者带入的微生物杀灭；
（7）将经步骤（6）处理得到的产物干燥造粒，得到活性胶原蛋白和弹性蛋白提取物。
检测对比例制备所得弹性蛋白肽的抗氧化值（还原力，dpph清除能力、abts清除率），及对模型裸鼠皮肤弹性蛋白含量的影响。
检测结果
1、抗氧化值
（1）还原力测定
样品溶液的配制：实施例1、2、3及对比例制备所得的弹性蛋白肽样品，用ph7的tris-hcl缓冲液溶解成终浓度为1mg/ml的样品溶液。
2ml样品溶液加到2mlph7的tris-hcl缓冲液溶和2ml1%（g/l）的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合液中加入2ml10%（g/l）的三氯乙酸，混合后以3000/min离心10min，取2ml上清液与2ml蒸馏水以及0.4ml0.1%（g/l）氯化铁溶液在反应试管中反应，10min后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大，样品还原能力越强。
（2）氧自由基清除能力（dpph）测定
dpph溶液的配置：取dpph1mg溶于20ml无水乙醇中，超声5min，充分振荡均匀，取1ml该dpph溶液，在519nm处测定a值，a值在1.2-1.3之间。
样品溶液的配制：实施例1、2、3及对比例制备所得的弹性蛋白肽样品，用ph7的tris-hcl缓冲液溶解成终浓度为1mg/ml的样品溶液。
测量
a0值的测量：取配置好的dpph溶液2ml加入到试管中，加入无水乙醇1ml，充分混合，519nm处测量a值。
a值的测量：取配置好的dpph溶液2ml加入到试管中，加入200ul样品溶液，再加入800ul无水乙醇，充分混匀，静置30min中后，519nm处测量a值。
抑制率%=(a0-a)/a0×100%
（3）abts清除率
abts储备液：去离子水分别溶解abts和过硫酸钾，使其终浓度分别为7.4mmol/l和2.6mmol/l，将二者混合均匀，避光静置12h。
abts工作液：以ph7tris-hcl缓冲液稀释的abts储备液，使其在734nm处的吸光值为0.70。
样品溶液的配制：实施例1、2、3及对比例制备所得的弹性蛋白肽样品，用ph7的tris-hcl缓冲液溶解成终浓度为1mg/ml的样品溶液。
a0值的测量：取配置好的abts工作液1.8ml加入到试管中，加入ph7的tris-hcl缓冲液0.2ml，充分混合，25℃恒温水浴5min，734nm处测量a值。
a值的测量：取配置好的abts工作液1.8ml加入到试管中，加入0.2ml样品溶液，再，充分混匀，25℃恒温水浴5min，734nm处测量a值。
抑制率%=(a0-a)/a0×100%
表1实施例及对照组产品的抗氧化活性
本发明制备的弹性蛋白肽，其还原能力，自由基清除效率显著高于对比例，其抗氧化效果佳。
2、皮肤衰老模型小鼠功效验证
取balbc-nu裸鼠，在实验环境下正常喂养检疫观察7天。随机分为6组，每组5只；分别为：空白对照组、模型对照组、实施例1实验组、实施例2实验组、实施例3实验组、对比例实验组。
皮肤衰老模型小鼠造模：除空白对照组外，其余组每天颈背皮下注射10%d-gal1.0g/kg；同时进行uv照射，照射波长为350-400nm，照射时间每天40min，光源拒鼠40cm垂直高处，持续造模40天。空白组每天颈背皮下注射等量生理盐水，正常光照条件饲养。从造模11天开始，除空白对照组和模型对照组，其余各组每日喂食100mg/100g相应实施例制备的弹性蛋白肽，连续喂食30天。检测皮肤中胶原蛋白肽的含量。
表2实施例及对比例产品对小鼠皮肤中胶原蛋白含量的影响
本发明制备的弹性蛋白肽，能够有效提升衰老皮肤中胶原蛋白肽的含量，能够有效抵御皮肤衰老，在抗衰老护肤品中的应用具有广阔前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。