一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂盒的制作方法

本发明涉及脂蛋白残粒胆固醇测定
技术领域：
，具体涉及一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂盒。
背景技术：
：脂蛋白残粒(remnant-likeparticle，rlp)又称富含甘油三酯(triglyceride，tg)脂蛋白残粒(trl)，是乳糜微粒(chylomicron，cm)和极低密度脂蛋白(verylowdensitylipoprotein，vldl)经脂蛋白酶(lipoproteinlipase，lpl)水解逐渐失去甘油三脂、磷脂、载脂蛋白a(apoproteina，apoa)和apoc，转变为富含胆固醇、胆固醇酯和apoe的较小颗粒。rlp具有致动脉粥样硬化作用，脂蛋白残粒胆固醇(rlp-cholesterol，rlp-c)水平升高是动脉粥样硬化性疾病和冠心病(coronaryheartdisease，chd)以及动脉粥样硬化性有关的代谢性疾病的重要危险因素。血浆或血清中rlp-c浓度在动脉粥样硬化性疾病及动脉粥样硬化相关的疾病(如ii型糖尿病、iii型高脂血症和慢性肾功衰及胖患者)中显著增加。目前检测rlp-c的主要方法为免疫吸附法，但该方法需要对被测样本进行分离处理，过程繁琐，需花费大量时间。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂盒。本发明提供的试剂盒不仅操作简便，适用于临床检测，而且试剂检测线性范围宽，检测灵敏度高，稳定性好，抗干扰能力强，具有良好的准确度与精密度。本发明提供了一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂盒，包括试剂1和试剂2；所述试剂1包括：pipes缓冲液、显色底物、表面活性剂1和过氧化物酶；所述显色底物包括n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺；所述表面活性剂1包括脂肪胺与环氧乙烷、环氧丙烷的嵌段聚合物、十二烷基硫酸三乙醇胺、tritonx-100和壬基酚聚氧乙烯醚中的一种或多种；所述试剂2包括：pipes缓冲液、4-氨基安替比林、磷脂酶d、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶和表面活性剂2；所述表面活性剂2包括烷基酚聚氧乙烯醚、聚环氧乙烯月桂酰醚和脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种或多种。优选的是，所述试剂1和试剂2中的pipes缓冲液的浓度分别独立地为10～100mm，ph值独立地为5.0～10.0。优选的是，所述显色底物的质量浓度为0.05～4.0g/l。优选的是，所述脂肪胺与环氧乙烷、环氧丙烷的嵌段聚合物、十二烷基硫酸三乙醇胺、tritonx-100和壬基酚聚氧乙烯醚的质量浓度分别独立地为1～20g/l。优选的是，所述试剂1和试剂2中过氧化物酶的酶浓度独立地为5～20ku/l。优选的是，所述4-氨基安替比林的质量浓度为0.01～3g/l。优选的是，所述磷脂酶d的酶浓度为3～15ku/l。优选的是，所述胆固醇酯酶的酶浓度为1～10ku/l。优选的是，所述胆固醇氧化酶的酶浓度为1～10ku/l。优选的是，所述烷基酚聚氧乙烯醚、聚环氧乙烯月桂酰醚和脂肪醇聚氧乙烯醚的质量浓度分别独立地为0.5～8g/l。本发明提供了一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂盒。本发明提供的试剂盒在后续使用中无需进行样品前处理，操作简便，检测快速，适用于全自动生化仪，适用于临床检测，试剂检测线性范围宽，检测灵敏度高，稳定性好，抗干扰能力强，具有良好的准确度与精密度。附图说明图1为本发明实施例5提供的实施例1的试剂盒与与对照组相关系数比对结果图；图2为本发明实施例5提供的实施例2的试剂盒与与对照组相关系数比对结果图；图3为本发明实施例5提供的实施例3的试剂盒与与对照组相关系数比对结果图；图4为本发明实施例5提供的实施例4的试剂盒与与对照组相关系数比对结果图；图5为本发明实施例7提供的线性范围检测结果图。具体实施方式本发明提供了一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂盒，包括试剂1和试剂2；所述试剂1包括：pipes缓冲液、显色底物、表面活性剂1和过氧化物酶；所述显色底物包括n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺；所述表面活性剂1包括脂肪胺与环氧乙烷、环氧丙烷的嵌段聚合物、十二烷基硫酸三乙醇胺、tritonx-100和壬基酚聚氧乙烯醚中的一种或多种；所述试剂2包括：pipes缓冲液、4-氨基安替比林、磷脂酶d、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶和表面活性剂2；所述表面活性剂2包括烷基酚聚氧乙烯醚、聚环氧乙烯月桂酰醚和脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种或多种。在本发明中，所述试剂1和试剂2中的pipes缓冲液的浓度分别独立地为10～100mm，ph值独立地为5.0～10.0。在本发明中，所述pipes缓冲液的浓度优选为40mm，ph值优选为7.2。在本发明中，pipes缓冲液能够提供一个合适的环境，使试剂中的酶类物质保持稳定，活度不会降低，从而影响结果的可靠性。本发明对pipes缓冲液的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的pipes缓冲液常规市售产品即可。在本发明中，所述显色底物优选包括n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(toos)，在本发明中，所述显色底物的质量浓度为0.05～4.0g/l，优选为0.5g/l。本发明所述显色底物toos能够使反应更加灵敏，准确度更高。在本发明中，所述显色底物toos优选购自罗氏公司(roche)。在本发明中，所述表面活性剂1优选包括脂肪胺与环氧乙烷、环氧丙烷的嵌段聚合物(b-28，优选购自花王株式会社)、十二烷基硫酸三乙醇胺(emaltd，优选购自花王株式会社)、tritonx-100(优选购自美国amresco公司)和壬基酚聚氧乙烯醚(np-40，优选购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)中的一种或多种。在本发明中，所述b-28、emaltd、tritonx-100和np-40的质量浓度分别独立地为1～20g/l。在本发明中，所述b-28的浓度优选为1～5g/l，更优选为2g/l。在本发明中，所述emaltd的浓度优选为1～5g/l，更优选为2g/l。在本发明中，所述tritonx-100的浓度优选为1～5g/l，更优选为1.5g/l。在本发明中，所述np-40的浓度优选为2～4g/l，更优选为1g/l。在本发明中，所述b-28、emaltd、tritonx-100和np-40优选购自花王株式会社。在本发明中，所述表面活性剂1能抑制除脂蛋白残粒胆固醇以外的胆固醇与胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶反应，对被测样品中的胆固醇进行广泛地抑制并保持体系还原性的稳定。在本发明中，所述试剂1和试剂2中过氧化物酶的酶浓度独立地为5～20ku/l。在本发明中，所述过氧化物酶的酶浓度更优选为10～20ku/l，最优选为18ku/l。在本发明试剂1中，所述过氧化物酶的作用是消除样本中原有的过氧化氢对结果的干扰；在试剂2中，所述过氧化物酶的作用是在脂蛋白残粒胆固醇在胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶的作用下分解生成过氧化氢，经trinder’s反应呈色，即过氧化氢在过氧化物酶及4-氨基安替比林存在的存在下，与显色底物发生显色反应，由其吸光度测定出脂蛋白残粒胆固醇含量。本发明对所述过氧化物酶的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规过氧化物酶市售产品即可，如日本toyobo东洋纺的过氧化物酶。在本发明中，所述4-氨基安替比林的质量浓度为0.01～3g/l。在本发明中，所述4-氨基安替比林的质量浓度更优选为0.2g/l。在本发明中，上述反应生成的过氧化氢在4-氨基安替比林及过氧化物酶存在的情况下，与显色底物发生显色反应，从而能定量的检测出脂蛋白残粒胆固醇的量。本发明对所述4-氨基安替比林的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售4-氨基安替比林即可，如国药集团化学试剂有限公司出售的4-氨基安替比林。在本发明中，所述磷脂酶d的酶浓度为3～15ku/l。在本发明中，所述磷脂酶d的酶浓度优选为6～12ku/l，更优选为10ku/l。在本发明中，所述磷脂酶d的作用为与表面活性剂2协同作用，将脂蛋白残粒胆固醇转变为溶解态的残粒样脂蛋白。本发明对所述磷脂酶d的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的磷脂酶d的常规市售产品即可，如日本asahi旭化成出售的磷脂酶d。在本发明中，所述胆固醇酯酶的酶浓度为1～10ku/l。在本发明中，所述胆固醇酯酶的酶浓度优选为2～5ku/l，更优选为2ku/l。本发明对所述胆固醇酯酶的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的胆固醇酯酶的常规市售产品即可，如日本asahi旭化成公司出售的胆固醇酯酶。在本发明中，所述胆固醇氧化酶的酶浓度为1～10ku/l。在本发明中，所述胆固醇氧化酶的酶浓度优选为2～8ku/l，更优选为5ku/l。本发明对所述胆固醇氧化酶的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的胆固醇氧化酶的常规市售产品即可，如日本asahi旭化成公司出售的胆固醇氧化酶。在本发明中，所述表面活性剂2包括烷基酚聚氧乙烯醚(np-10，优选购自花王株式会社)、聚环氧乙烯月桂酰醚(brij-35，优选购自上海如吉生物科技有限公司)和脂肪醇聚氧乙烯醚(b-66，优选购自花王株式会社)中的一种或多种。在本发明中，所述np-10、brij-35和b66的质量浓度分别独立地为0.5～8g/l。在本发明中，所述np-10的浓度优选为2～5g/l，更优选为3g/l。在本发明中，所述brij-35的浓度优选为5～8g/l，更优选为6g/l。在本发明中，所述b66的浓度优选为2～5g/l，更优选为4g/l。在本发明中，所述np-10、brij-35和b66优选购自花王株式会社。在本发明中，所述表面活性剂2能够针对性的结合脂蛋白残粒胆固醇，形成稳定复合物，该复合物具有良好的水溶性，从而在提供的环境中与胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶反应，实现脂蛋白残粒胆固醇的释放与修饰。在本发明中，所述试剂盒的检测样本包括：血清、血浆。在本发明中，所述试剂盒的使用方法为：5ul样本与240ul试剂1混匀，置37℃孵育5分钟，测定吸光度a1；再加入80ul试剂2，置37℃孵育5分钟，测定吸光度a2。△a＝a2-a1。计算：在本发明中，所述生化仪的型号(来源)优选为日立7100全自动生化分析仪。在本发明中，所述生化仪的参数设置优选为：波长：600nm(主波长)/700nm(副波长)，温度：37℃，试剂1：240μl，试剂2：80μl，样本：5μl。1)试剂中的表面活性剂和磷脂酶d协同作用，选择性的修饰残粒样脂蛋白(rlps)，使其溶于反应体系中，形成溶解态的残粒样脂蛋白，同时屏蔽其他脂蛋白不溶于反应体系中。2)溶解态的残粒样脂蛋白中的胆固醇酯(rlp-cester)经胆固醇酯酶水解，形成游离胆固醇。3)生成的游离胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下，生产胆甾烯酮和双氧水，并经trinder反应产生色源显色。整个反应过程中，经表面活性剂和磷脂酶d，胆固醇酯酶等多种酶的共同作用，将除rlps以外的其他脂蛋白排除，试剂检测线性范围宽，检测灵敏度高，稳定性好，抗干扰能力强，具有良好的准确度与精密度。下面结合具体实施例对本发明所述的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1试剂1：pipes缓冲液(ph7.2)40mmtoos0.5g/l表面活性剂1b-285g/lt808g/l过氧化物酶20ku/l试剂2：表面活性剂2brij-351g/lb662g/l实施例2：试剂1：pipes缓冲液(ph7.2)40mmtoos0.5g/l表面活性剂1t8010g/lnp-405g/l过氧化物酶20ku/l试剂2：表面活性剂2np-104g/lb665g/l实施例3：试剂1：pipes缓冲液(ph7.2)40mmtoos0.5g/l表面活性剂1b-282g/lnp-401g/l过氧化物酶20ku/l试剂2：表面活性剂2np-103g/lbrij-356g/l实施例4：试剂1：pipes缓冲液(ph7.2)40mmtoos0.5g/l表面活性剂1emaltd7g/lt804g/l过氧化物酶20ku/l试剂2：实施例5将实施例1～4与对照组(脂蛋白残粒胆固醇(rlp-c)测定试剂盒(免疫沉淀分离法)(上海北加生化试剂有限公司))进行比较，比较结果如图1～4所示。比较结果表明，实施例1～4均与对照组具有良好的相关性，其中实施例3与对照组相关程度最高。相关系数比照结果如表1所示。表1实施例1～4与对照组相关系数比对表实施例与对照组相关系数r10.999620.999330.999840.9995实施例6rlp-c检测参数如表2所述。表2rlp-c全自动参数设置表精密度测试的方法：用临床标本或质控血清测试试剂盒，重复测试10次，计算测量值的平均值和标准差(s)。按公式(2)计算变异系数(cv)，精密度(重复测试10次质控(低浓度、高浓度两个水平的质控))测试结果如表3和表4所示：表3低浓度精密度测试结果表4高浓度精密度测试结果配制3批试剂，测定质控值，计算批间差：选择一份临床标本或质控血清，用三批不同批号的试剂盒各测定三次，分别计算每批3次检测的均值，按下列计算相对偏差(r)，结果如表5所示：表5批间差测定结果(单位mg/dl)重复测试10次质控水平1(低浓度)，cv值为7.05％；重复测试10次质控水平2(高浓度)，cv值为2.06％。证明该检测试剂精密度高，具有良好的重复性。质控水平1(低浓度)批间差为7.24％，质控水平2(高浓度)批间差为2.05％。证明检测试剂批间差小，批次间稳定性好，重现性好。实施例7线性范围测定结果如表6和图5所示。表6线性范围测定结果根据图5和表6可知，线性范围宽，线性相关系数为0.9971，范围1mg/dl-80mg/dl，能完全覆盖临床检测的范围要求。实施例8分析灵敏度用已知浓度或活性的样品测试试剂盒，记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度改变，换算为n(待定)单位的吸光度变化率(△a/min)表7灵敏度分析结果吸光度变化率(△a/min)越高，反应的灵敏度越高。试剂测试10mg/dl被测物时，吸光度差值(△a)为0.0482，反应灵敏度高。实施例9干扰试验用稀释好的不同浓度的抗坏血酸、血红蛋白、胆红素和甘油三酯分别与含rlp-c较高浓度(70mg/dl)的血清进行1:9混合(首个浓度使用生理盐水)做回收试验，以回收率的高低判断干扰的程度。干扰物试验结果如表8所示。表8干扰物试验结果由表8可知，抗坏血酸≤50mg/dl，血红蛋白≤500mg/dl，胆红素≤20mg/dl，甘油三酯≤3000mg/dl时对测定rlp-c无明显干扰。抗干扰能力是检测试剂的一个重要性能指标，血清样本中抗坏血酸、血红蛋白、胆红素、甘油三酯浓度会影响检测试剂测定的结果。上述实验证明本发明所提供的检测试剂在抗坏血酸≤50mg/dl，血红蛋白≤500mg/dl，胆红素≤20mg/dl，甘油三酯≤3000mg/dl，对rlp-c测定结果无明显干扰。所提供的干扰物范围远高于异常血清标本，使检测结果更准确可靠。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12