本发明涉及一种耐药性细菌的识别和分离方法，尤其涉及一种耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌的识别和分离。
背景技术：
细菌对抗生素产生的耐药性问题是全球最普遍出现的公共卫生问题，国际相关组织以及包括我国在内的各国政府都非常重视，陆续制定出耐药菌监控计划，以期降低细菌产生耐药性给人类健康带来的危害，我国国家卫生健康委员会（原国家卫生和计划生育委员会）联合14部门2016年8月联合下发了《遏制耐药菌国家行动计划》（2016-2020）（[国卫医药]43号）文件。作为抗生素家族中重要组成的喹诺酮类抗生素因其具有广谱抗菌性目前广泛应用于人、畜细菌病的防治，由此产生的细菌耐药性问题较为严重（喹诺酮类药物的抗菌活性与细菌耐药性研究进展，邵莉萍，中国畜牧兽医，2017，44（9）：2773-2782）。肠杆菌科细菌是人类感染相关的重要病原菌，尤其是沙门氏菌。从养殖环节中畜禽沙门氏菌病到餐桌上人类通过食物传播的沙门氏菌病的治疗均大量使用喹诺酮类抗生素。目前该类抗生素已开发出第四代，现阶段第三代和第四代产品在混合使用。由此而来，沙门氏菌对喹诺酮类产生耐药性问题的严重性就非常突出，在我国“遏制耐药菌国家行动计划”中把监控沙门氏菌对喹诺酮类的耐药性作为计划内容之一。
在我国《遏制耐药菌国家行动计划》基础上，我国每年还配套发布《全国细菌耐药监测网技术方案》（目前更新到2018版），该方案推荐的方法包括药敏纸片法、稀释法和仪器法。药敏纸片通过测试抑菌圈大小判断菌株是否耐药；稀释法和仪器法则将菌悬液滴加到含抗生素的液体培养基中，通过培养测定生长情况判断试验菌株是否耐药，以上方法的应用前提是在获得纯菌株鉴定之后，而对未知菌不能直接测试其是否对某类或某种抗生素耐药。方案中还特别指出分子生物学方法检测结果不能上报，因此，现阶段的方法周期长、效率低。另外，就喹诺酮类抗生素而言，包括诺氟沙星(norfloxacin，氟哌酸)、氧氟沙星(ofloxacin，氟嗪酸)、左氧氟沙星(levofloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、依诺沙星(enoxacin，氟啶酸）、西诺沙星（cinoxacin）、环丙沙星（ciprofloxacin）、洛美沙星（lomefloxacin）、甲磺酸曲伐沙星（trovafloxacinmesilate）、盐酸克林沙星（clinafloxacinhydrochloride）等多个品种，即使鉴定出目标菌为沙门氏菌之后，对上述每一品种进行药敏实验，工作量巨大，投入的人力和时间成本较高。
针对现阶段耐药菌监测方法工作量大、效率低的问题，申请者设计和实现了一种新的耐药菌识别分离方法，将特异性酶反应原理与喹诺酮类抗生素功能性结构代表物质运用相结合，通过菌落特征差异定向识别和分离耐药菌，提供快速、简单、廉价产品，是对现有的耐药监测方法的补充。应用细菌酶特异性鉴别病原菌的原理已开发出多种产品，如一种金黄色葡萄球菌特异性显色培养基（zl201310603799.9）、用于分离和检测阴沟肠杆菌的显色培养基（zl201410101820.x）、一种大肠菌群的显色培养基及其快速检测卡（zl201110275619.x）等，但这些培养基不能用于耐药菌的识别和分离。
本发明所述的耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌菌株的识别及其分离方法中沙门氏菌特异性酶底物为5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酸脂和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖苷。沙门氏菌可分解5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酸脂底物，使菌落呈紫色；产β-葡萄糖苷酶的细菌可分解5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖苷，使菌落呈蓝绿色；其他细菌在培养基上为无色或白色菌落。本发明所述喹诺酮类抗生素功能性结构代表物质为萘啶酮酸(nalidixicacid)，是喹诺酮类抗生素的主要成分。将监测菌株接种于本发明的平板上培养18～24h，如果可生长出紫红色菌落，则说明该菌落为具有耐喹诺酮类抗生素的沙门氏菌。
综上所述，目前对于耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌菌株检测和监测方法的不足之处在于：如何缩短检测周期，即在对样品中菌株的分离过程中即可获得初步耐药性测定结果；如何简化操作程序，将增菌、分离、鉴定和药敏试验合并成为一个步骤，即一步法完成；如何降低成本，即无需购置设备和大量耗材。本发明所述的耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌菌株的识别及其分离方法可以很好的解决这些问题。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有沙门氏菌对喹诺酮类抗生素耐药性测定周期长、操作繁琐、成本高的不足，解决的技术问题是提供一种耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌菌株的识别及其分离方法。
本发明所采用的技术方案概述如下：一种耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌菌株的识别及其分离方法，所述方法基于细菌特异性代谢反应，反应体系包括支持目标菌生长的营养成分、非目标菌抑制剂、沙门氏菌特异性酶代谢反应底物及代表喹诺酮类抗生素的功能性结构物质，其中沙门氏菌特异性酶底物和喹诺酮类抗生素功能性结构代表物质的组合运用是本发明的技术关键，之前的相关技术要么是仅能分离沙门氏菌而不能测试分离菌株的耐药性，要么只能对已分离鉴定之后的菌株测定其是否耐药，本发明的耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌菌株的识别及其分离方法，在菌株的分离培养之后，即可获得耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌菌株，尤其用于对耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌的主动监测简便、快速、高效。
本发明所采取的技术方案为：
一种耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌菌株的识别及其分离方法的显色培养基，每1000ml的培养基包括：蛋白胨8~15g、浸粉类2~4g、甜菜碱1~2g、胆盐5~10g、硫代硫酸钠0~5g、柠檬酸钠0~5g、琼脂15~18g、peg1~2g、5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酸脂0.1~0.2g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖苷0.1~0.2g、增补剂10~20g、新生霉素5~10mg、头孢磺啶10~15mg、萘啶酮酸16~32mg，余量为水，ph为7.2±0.2。
在一些实施例中，优选为，所述蛋白胨为䏡蛋白胨和大豆蛋白胨。
在一些实施例中，优选为，所述浸粉为酵母浸粉和牛肉浸粉。
在一些实施例中，优选为，所述胆盐为猪胆钠盐和牛胆钠盐。
在一些实施例中，优选为，所述peg为peg4000。
在一些实施例中，优选为，所述增补剂2为高岭土。
在一些实施例中，优选为，每1000ml的完整耐药培养基s包括：䏡蛋白胨6g、大豆蛋白胨3g、酵母浸粉1g、甜菜碱1g、胆盐5g、硫代硫酸钠4g、柠檬酸钠4g、琼脂15g、peg40002g、5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酸脂0.2g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖苷0.1g、高岭土15g、新生霉素5mg、头孢磺啶12mg、萘啶酮酸16mg，余量为水，ph为7.2±0.2。
在一些实施例中，优选为，每1000ml的高营养完整耐药培养基s+包括：䏡蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、酵母浸粉2g、牛肉浸粉2g、甜菜碱2g、胆盐7g、硫代硫酸钠4g、琼脂15g、peg40001g、5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酸脂0.15g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖苷0.1g、高岭土15g、新生霉素5mg、头孢磺啶12mg，萘啶酮酸32mg，余量为水，ph为7.2±0.2。
本发明在培养基中添加了胆盐、硫代硫酸钠、柠檬酸钠、甜菜碱等，可抑制样品中大部分的革兰氏阳性细菌的生长，肠道菌尤其是变形杆菌和假单胞菌也多数被抑制。
本发明在培养基中添加了高岭土作为增补剂2，可以使固体培养基呈乳白色本底，使目标菌落的颜色更加明显突出。此外还可以对培养基各组分起到吸附剂、抗结剂的作用，使培养基各组分分散的更均匀，促进目标菌的生长。
本发明在培养基中添加了β-葡萄糖苷显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖苷，能表达产生β-葡萄糖苷酶的细菌在酶的作用下分解显色底物，形成蓝绿色菌落。
本发明在培养基中添加了辛酸脂显色底物5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酸脂，能表达产生脂酶的细菌在酶的作用下分解显色底物，形成紫色菌落。
本发明的有益效果是：
本发明所述的识别和分离耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌菌株的方法，与现阶段药敏实验方法相比，不需要获得纯菌株鉴定，即可获得初步的耐药性测定结果，是现有耐药监测方法的补充。
本发明的识别和分离耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌菌株的方法识别和分离耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌菌株的方法适用于医疗卫生机构、食品卫生监控基层单位对耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌的快速筛查和定向监测，应用前景广泛。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：本发明所述的显色培养基对耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌的选择性实验
1)固体平板制备：
完整的耐药培养基s的制备：按照配方为每1000ml的培养基s中包含䏡蛋白胨6g、大豆蛋白胨3g、酵母浸粉1g、甜菜碱1g、胆盐5g、硫代硫酸钠4g、柠檬酸钠4g、琼脂15g、peg40002g、5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酸脂0.2g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖苷0.1g、高岭土15g、新生霉素5mg、头孢磺啶12mg、萘啶酮酸16mg，余量为水，ph为7.2±0.2制备培养基。将上述显色培养基除了高岭土和抗生素的各组分，加入到900ml去离子水中，搅拌溶解，调节ph至7.2±0.2。将称量的高岭土溶于100ml去离子水中，搅拌均匀后溶液呈乳白色，加入到溶解完全的培养基中。加热煮沸，待冷却至45~55℃，加入相应抗生素，无菌操作，倒平板，备用；
常规使用的沙门显色培养基（简称s1）配置：制法与耐药显色培养基相同，只是最终不添加萘啶酮酸。
2)菌种活化与培养：
受试菌包括肠炎沙门氏菌atcc13076、鼠伤寒沙门氏菌atcc13311、大肠埃希氏菌atcc25922、弗氏柠檬酸杆菌atcc8090、金黄色葡萄球菌atcc25923、铜绿假单胞菌atcc9027、耐喹诺酮沙门分离株iqcc10516、iqcc10553、iqcc10589、iqcc10590。其中atcc即美国模式培养物集存库(americantypeculturecollection)的简写；iqcc为中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心(inspectionquarantineculturecollection)的简写。每株菌在试验前均经过了生化复核和药敏试验的验证；
将上述菌种分别活化后接种于哥伦比亚血琼脂平板，在相应最适温度下培养18~24h，直至出现明显菌落。分别挑取3~5个菌落，分散于tsb液体培养基中制成菌悬液。将菌悬液的浊度调整至0.5麦氏比浊标准，此时菌悬液的浓度为1.5×108cfu/ml，备用。
3)接种：将上述10株菌株制成的菌悬液，分别取一环划线接种于配制好的两种显色平板上，36±1℃培养18~24h，观察菌落的显色情况。
4)结果分析：沙门氏菌在常规显色平板上生长良好，18h内显色，菌落为紫色，有紫色晕圈，菌落直径1~3mm，非目标菌被抑制或呈不同颜色菌落；配套使用耐药显色培养基，可以进一步区分耐喹诺酮沙门氏菌和普通敏感沙门氏菌，详细结果见表1。
表1：实施例1的实验结果
实验结果说明使用该方法可以很好的区分耐喹诺酮类沙门氏菌、普通沙门氏菌与其他非目标菌。此培养基中添加了胆盐、硫代硫酸钠、柠檬酸钠、甜菜碱等抑制成分，适用于从较复杂环境（如肠道菌群）中分离沙门氏菌。
实施例2：本发明所述的沙门显色培养基的生长特性测试实验
1)固体平板制备：
本发明所述的完整耐药显色培养基s与常规使用的显色培养基s1的配置方法见实施例1，配制成的平板呈乳白色外观。
2)菌种活化与培养：
受试菌包括肠炎沙门氏菌atcc13076、鼠伤寒沙门氏菌atcc14028、大肠埃希氏菌atcc25922、奇异变形杆菌atcc29906、金黄色葡萄球菌atcc25923、粪肠球菌atcc29212、耐喹诺酮沙门氏菌iqcc10589。atcc即美国模式培养物集存库(americantypeculturecollection)的简写；iqcc为中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心(inspectionquarantineculturecollection)的简写。每株菌在试验前均经过了生化复核和药敏试验的验证。按照gb4789.28-2013的步骤活化菌株，并制作10倍系列稀释的菌悬液，备用。
3)接种：
选择合适稀释度的工作菌悬液0.1ml，均匀涂布接种于培养基s、s1和参比平板tsa。每一稀释度接种两个平板。每平板的接种水平为20～200cfu，36±1℃培养18~24h，记录菌落直径及计算回收率。
4)结果分析：
沙门氏菌的菌落为紫色，有紫色晕圈，菌落直径1~3mm，非目标菌被抑制或呈不同颜色菌落。菌落直径（d）及回收率（pr）结果见表2。
表2：实施例2的实验结果
由表2可知，完整耐药培养基s可有效区分耐喹诺酮类沙门氏菌，常规使用的沙门显色培养基s1可分离出普通沙门氏菌，两个培养基对目标菌的回收率（pr）远高于gb4789.28-2013中pr≥0.5的规定。
实施例3：本发明所述的沙门显色培养基对乳糖阳性沙门氏菌的特异性实验
沙门氏菌能分解辛酸脂显色底物，呈现游离出的发色基团的色泽。而其他细菌被添加的抑菌成分抑制或无法分解辛酸脂底物或优先分解其他显色底物，造成菌落颜色差异，从而区分出沙门氏菌。因此同时选取两种底物可以更好的区分沙门氏菌和其他非目标菌，使检测沙门氏菌的特异性更强。常选取可区分肠道菌群的β-半乳糖苷显色底物或β-葡萄糖苷显色底物。
1)菌种选择及活化
菌种的选取包含常用的肠炎沙门氏菌（s.enteritidis）atcc13076、猪霍乱沙门氏菌（s.choleraesuis）atcc53885等常规沙门氏菌。还有乳糖阳性沙门氏菌，包括山夫顿堡沙门氏菌（s.seftenberg）atcc43845、iqcc10520，亚利桑那亚种沙门氏菌（salmonellaentericasubsp.arizonae）atcc13314、iqcc10508及双相亚利桑那亚种沙门氏菌（salmonellaentericasubsp.diarizonae）iqcc10552；大肠埃希氏菌atcc25922、弗氏柠檬酸杆菌atcc8090、金黄色葡萄球菌atcc25923；
将上述7种沙门氏菌和3株其他菌分别活化后接种于哥伦比亚血琼脂平板，在相应最适温度下培养18~24h，直至出现明显菌落。分别挑取3-5个菌落，分散于tsb液体培养基中制成菌悬液。将菌悬液的浊度调整至0.5麦氏比浊标准，此时菌悬液的浓度为1.5×108cfu/ml，备用。
2)培养基制备
本发明所述常规使用的沙门显色培养基s1采用的为β-葡萄糖苷显色底物，配置方法及步骤见实施例1；显色培养基s2是将s1中的β-葡萄糖苷显色底物替换为β-半乳糖苷显色底物，配制方法及其他配方无变化；配制成的平板均呈乳白色外观。
3)接种及培养
将上述10株菌制成的菌悬液，分别取一环划线接种于配制好的两种显色平板上，36±1℃培养18~24h，观察菌落的显色情况。
4)结果分析
所有的沙门氏菌在两种培养基的显色平板上生长良好。常见的沙门氏菌，肠炎沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌在18h内出现单一菌落，菌落为紫色，有紫色晕圈，菌落直径1~3mm。乳糖阳性的沙门氏菌如亚利桑那沙门菌、双相亚利桑那沙门菌和山夫顿堡沙门氏菌，在s1上呈现紫色菌落，而在s2培养基则会呈现蓝绿色菌落，造成误判漏检现象。因此选取β-葡萄糖苷显色底物可解决乳糖阳性沙门氏菌漏检现象。详细结果见表3。
表3：实施例3的实验结果
实施例4：本发明所述的沙门显色培养基对生长缓慢沙门氏菌的生长特性测试实验
本发明所述的显色培养基，针对生长缓慢的沙门氏菌，如伤寒沙门氏菌（s.typhi）、副伤寒沙门氏菌（s.paratyphi）和非运动型沙门氏菌优化了培养基配方，使其在此培养基上生长良好并快速区分。
高营养完整耐药培养基s+配方为：每1000ml的培养基中包含䏡蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、酵母浸粉2g、牛肉浸粉2g、甜菜碱2g、胆盐7g、硫代硫酸钠4g、琼脂15g、peg40001g、5-溴-6-氯-3-吲哚-辛酸脂0.15g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖苷0.1g、高岭土15g、新生霉素5mg、头孢磺啶12mg，萘啶酮酸32mg，余量为水，ph为7.2±0.2。s3培养基为常规使用的高营养培养基，配置方法与高营养完整耐药培养基s+相同，只是最终不添加萘啶酮酸。
1)培养基制备
实施例4选用常规使用的无萘啶酮酸高营养培养基s3与现有培养基进行对比。因此将显色培养基除了高岭土和抗生素的各组分，加入到900ml去离子水中，搅拌溶解，调节ph至7.2±0.2。将称量的高岭土溶于100ml去离子水中，搅拌均匀后溶液呈乳白色，加入到溶解完全的培养基中。加热煮沸，待冷却至45~55℃，加入新生霉素和头孢磺啶，无菌操作，倒平板，备用；配制成的平板呈乳白色外观，便于观察菌落颜色；
国内某显色培养基：按照说明书要求配置，备用；配制成的平板为淡黄色半透明外观；
国外某显色培养基：按照说明书要求配置，备用；配制成的平板呈乳白色外观。
2)菌种选择及活化
菌种的选取包含常用的肠炎沙门氏菌（s.enteritidis）atcc13076、猪霍乱沙门氏菌（s.choleraesuis）atcc53885等常规沙门氏菌。还有生长相对缓慢的伤寒沙门氏菌（s.typhi）、副伤寒沙门氏菌（s.paratyphi）和非运动型沙门氏菌；
其中，伤寒以及副伤寒沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌atcc14028、atcc13311、伤寒沙门氏菌iqcc10593、甲型副伤寒沙门氏菌atcc11511、乙型副伤寒沙门氏菌iqcc10504、丙型副伤寒沙门氏菌iqcc10527；非运动型沙门氏菌包括鸡白痢沙门氏菌(s.pullorum)iqcc10577和鸡沙门氏菌(s.gallinarum)iqcc10525。其中atcc即美国模式培养物集存库(americantypeculturecollection)的简写；iqcc为中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心(inspectionquarantineculturecollection)的简写。按照gb4789.28-2013的步骤活化菌株，并制作10倍系列稀释的菌悬液，备用。
3)接种：
选择合适稀释度的工作菌悬液0.1ml，均匀涂布接种于培养基s+、国内某品牌、国外某品牌和参比平板tsa。每一稀释度接种两个平板。每平板的接种水平为20～200cfu，36±1℃培养18~48h，记录菌落直径及计算回收率。
4)结果分析：
菌落直径（d）及回收率（pr）结果见表4。
表4：实施例4的实验结果
由表4可知，伤寒类沙门氏菌以及非运动型沙门氏菌在国内某品牌培养基生长状态不佳，尤其是鸡沙门氏菌iqcc10525，在国内某品牌培养基中无菌落生成，而经过配方优化的培养基s3,无论在菌落直径、回收率及显色时间上均优于国内某品牌，不低于国外同类产品水准，且远高于gb4789.28-2013中pr≥0.5的规定。
实施例5：鸡肉样品中耐喹诺酮类沙门氏菌的检测
我国每年因鸡肉造成的沙门氏菌食物中毒人数估计有300万人次，而鸡肉中的非运动型沙门氏菌—鸡白痢沙门氏菌和鸡沙门氏菌往往因为其生长相对缓慢，容易造成漏检现象。可利用本发明所述的方法快速检测鸡肉中的耐喹诺酮类沙门氏菌。
1)相关培养基配制：
固体平板制备：参照实施例4配置高营养完整耐药培养基s+与常规使用的无萘啶酮酸高营养培养基s3；
缓冲蛋白胨水(bpw)、四硫磺酸钠煌绿(ttb)增菌液和亚硒酸盐胱氨酸(sc)增菌液制备：参照gb4789.4-2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验。
2)人工污染样品的制备：将鸡肉样品按照102cfu/25g的接种水平分别接种肠炎沙门氏菌atcc13076、鼠伤寒沙门氏菌atcc13311、鸡沙门氏菌iqcc10525和耐喹诺酮沙门分离株iqcc10516，分别编号样品1，样品2，样品3，样品4；无添加样品编号为样品5。经药敏试验验证，其中iqcc10525和iqcc10516为喹诺酮类耐药菌，atcc13076和atcc13311为喹诺酮类敏感菌。
3)样品处理：按照gb4789.4-2016的操作步骤，将5个样品加入225ml缓冲蛋白胨水中，均质混匀后，36±1℃前增菌8~12h后，吸取增菌液1ml，分别接种于10mlttb增菌液和10mlsc增菌液中，培养。
4)接种培养：将增菌液分别接种到显色培养基s3和s+上，36±1℃培养18~48h，观察现象。
5)结果分析：样品1、样品2、样品3和样品4在发明所述的显色培养基s3上呈现直径2~3mm的紫色菌落，证明为沙门氏菌；样品5在显色培养基中无紫色菌落存在，与添加结果相符。此外，样品3和样品4在显色培养基s+上，也出现了紫色菌落，证明样品中均含有耐喹诺酮类沙门氏菌，与事实相符。菌落显色时间与菌落出现时间基本无区别。其中，样品3中出现紫色菌落的时间为36h左右，生长时间略晚于其他样品。详细结果见表5。
表5：实施例5的实验结果
使用本发明所述的耐喹诺酮类抗生素沙门氏菌的识别及其分离方法，可以一步直接培养即可获得对喹诺酮类抗生素具有耐药性的沙门氏菌菌株。高营养培养基s+更适用于检测对营养有特殊需求的非运动型沙门氏菌。
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。