本发明属于生物催化领域，具体涉及一种固定化大肠杆菌制备胸苷的方法。
背景技术：
胸苷是抗艾滋病药物齐多夫定和叠氮胸苷的重要前体物质，在抗病毒、抗肿瘤方面起到了不可替代的作用。目前胸苷的生产方法主要有四种：化学合成法，发酵法，酶法以及化学酶法。
利用化学合成法来合成胸苷有多种途径，但是利用化学合成法合成胸苷有不少缺点：形成的胸苷其糖苷键缺乏立体专一性，原料不易得到，胸苷收率也非常低，而且生产过程中有大量废水产生，环境污染大(中国发明专利，cn103450302b；cn102863493b)。发酵法虽然能够大规模且单一地生产胸苷，但由于菌体活力低，产率较低(中国发明专利，cn105950689a)。酶法是以胸腺嘧啶碱基和2’-脱氧核苷为原料，以菌体或酶为催化介质，催化得到胸苷，但是菌体或酶易于受到底物的抑制，限制了其产率(徐渊，酶法生物合成胸苷和胞苷工艺的研究，硕士学位论文，浙江工业大学，2009)。化学酶法合成胸苷是先用化学法合成中间体2-脱氧-α-d-核糖-1-磷酸二环己基胺盐，然后与胸腺嘧啶作为底物，利用大肠杆菌核苷磷酸化酶催化作用合成胸苷(梅建凤，罗丽琴，王鸿，等，浙江工业大学学报，2014，42(2)：172-177)，该方法具有高选择、高效性及少污染的优点，但是底物仍然对大肠杆菌有抑制作用，其收率比较低。
技术实现要素：
为了解决现有技术化学酶法中菌体易于受到反应底物的抑制导致胸苷收率较低的问题，本发明的目的在于提供一种固定化大肠杆菌制备胸苷的方法。
本发明是通过如下方案实现的：
以固定化大肠杆菌为催化剂、2-脱氧-α-d-核糖-1-磷酸二环己基胺盐和胸腺嘧啶为底物、磷酸盐缓冲液为溶剂，反应合成胸苷，具体步骤包括如下：
(1)将2-脱氧-α-d-核糖-1-磷酸二环己基胺盐和胸腺嘧啶溶于磷酸盐缓冲液中，再加入固定化大肠杆菌，进行反应，然后将固定化大肠杆菌进行分离，得到反应液；
(2)将所述反应液依次经过冷藏、过滤、减压蒸干和提纯，得到胸苷。
优选地，所述2-脱氧-α-d-核糖-1-磷酸二环己基胺盐溶于磷酸盐缓冲液后的摩尔浓度为100～150mm，所述胸腺嘧啶溶于磷酸盐缓冲液后的摩尔浓度为400～600mm，所述固定化大肠杆菌的质量浓度为为200～600g/l。
优选地，所述磷酸盐缓冲液的ph值为7.5～9.5，更优选为8。
优选地，所述反应的温度为50～70℃，反应时间为10h。
优选地，所述固定化大肠杆菌采用包埋法，以pva和卡拉胶为包埋基材、超细活性炭为添加剂、饱和硼酸和kci溶液为固定剂溶液制备得到，具体为：
(1)将pva浸泡在水中，加入卡拉胶，加热使pva溶解，得到混合溶液，待用；
(2)将大肠杆菌种子接种于液体培养基中，依次经过培养、离心、洗涤和再次离心，得到大肠杆菌细胞；
(3)将上述大肠杆菌细胞和灭菌的超细活性炭加入到步骤(1)中的混合溶液中，混匀后，滴加灭菌的固定剂溶液进行成型，得到固定化大肠杆菌。
优选地，所述混合溶液中pva的质量浓度为7～12％，卡拉胶的质量浓度为0.4～1.2％；所述大肠杆菌细胞和超细活性炭的质量比为5：1，大肠杆菌细胞的质量浓度为1～2g/l。
优选地，所述固定剂溶液为饱和硼酸和kcl溶液，其中固定剂溶液中kcl的质量分数为4％。
有益效果：
(1)本发明采用固定化大肠杆菌制备胸苷，较好的提高了菌体对底物的耐受性，其稳定性得到提高，使得制备胸苷的收率提高，结果表明，经提纯后，胸苷纯度可达97％以上，收率达90％以上。
(2)包埋材料中添加活性碳，极大得提高了反应的收率，表明活性炭降低了固定化大肠杆菌的内扩散阻力，有利于物质在固定化大肠杆菌中的扩散，提高了反应速率，使得胸苷的收率大大提高。
(3)本发明制备的固定化大肠杆菌操作稳定性好，重复利用性高，有利于节省培养大肠杆菌的成本。
(4)本发明制备胸苷的工艺简单、原料成本低、反应条件温和以及可规模化生产。
具体实施方式
实施例1
本实施例的一种固定化大肠杆菌制备胸苷的方法，具有以下步骤：
(1)首先，将3g聚乙烯醇(pva)浸泡在50ml蒸馏水中24h，再加入0.3g卡拉胶，在110℃保温30min灭菌并使pva充分溶解，混合溶液降温到45℃并保温待用。
(2)将一环成熟的大肠杆菌种子(大约是1×106个)接种于30ml液体培养基中，30℃、100r/min振荡培养28h，培养液装于无菌离心管中；3000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤，再次离心，得到大肠杆菌细胞。
(3)将50mg步骤②所得大肠杆菌细胞和10mg灭菌的超细活性碳加入到步骤①的混合溶液中，混匀后用针管滴人经灭菌的饱和硼酸和kci溶液(其中kcl的质量分数为7％)中进行成型36h，得到固定化大肠杆菌细胞，置于ph＝7.0的磷酸盐缓冲溶液中，于4℃下保存待用。
(4)将4.12g2-脱氧-α-d-核糖-1-磷酸二环己基胺盐和5.04g胸腺嘧啶溶于100mlph＝8.0的磷酸盐缓冲溶液中，再加入20g步骤③制备的固定化大肠杆菌细胞，于50℃下反应10h将固定化大肠杆菌细胞分离。
(5)将步骤(4)得到的反应液置于4℃冰箱冷藏2～5天，过滤，弃去滤渣，加入适量活性炭脱色，过滤得到透明液体，于60℃减压蒸干，得到微黄色固体粉末。然后用硅胶柱进行分离，选用体积比甲醇：二氯甲烷＝1：15的洗脱剂，进行等度洗脱，合并胸苷部分，得到白色晶体样品2.03g，收率85％，纯度97％。
实例2～实例7
实施例2～7的方法过程与实施例1基本相同，不同之处见表1，其中底物1是2-脱氧-α-d-核糖-1-磷酸二环己基胺盐，底物2是胸腺嘧啶：
表1
由表1可以看出，在其它条件相同的情况下，实施例6效果最好，其中2-脱氧-α-d-核糖-1-磷酸二环己基胺盐的浓度为150mm，胸腺嘧啶的浓度为600mm，反应温度65℃，胸苷收率达到90％，纯度97.0％。
对比例1～对比例2
对比例1～对比例2的方法过程与实施例6基本相同，不同之处见表2，其中底物1是2-脱氧-α-d-核糖-1-磷酸二环己基胺盐，底物2是胸腺嘧啶：
表2
由表2可以看出，实施例6中固定化大肠杆菌催化底物浓度明显高于游离大肠杆菌，具有良好的底物耐受性，同时其也具有良好的操作稳定性和重复利用性，结果表明，固定化大肠杆菌在重复使用6次后仍表现出较好的催化活性，无明显失活现象；而对比例2中的游离大肠杆菌由于受到反应底物的抑制，其活性受到限制，最终使胸苷的收率较低，较固定化大肠杆菌制备的胸苷的收率低近30％；从实施例6和对比例1的对比可以看出，包埋材料中添加活性碳，极大得提高了反应的收率，表明活性炭降低了固定化大肠杆菌的内扩散阻力，有利于物质在固定化大肠杆菌中的扩散，提高了反应速率，使得胸苷的收率大大提高。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围内。