本发明属于环境微生物领域，更具体地，涉及一种利用氧化亚铁硫杆菌酸化脱钙提取甲壳素的方法。
背景技术：
甲壳素(c8h13o5n)n，又称甲壳质、几丁质，英文名chitin自然界中，甲壳素广泛在于低等植物菌类、虾、蟹、昆虫等甲壳动物的外壳、真菌的细胞壁等。甲壳素是地球上仅次于纤维素的第二大生物多糖，也是地球上唯一大量存在的天然碱性多糖，它广泛存在于自然界中，在食品、医药、医用材料、化工、高分子材料、农业和环保等领域具有非常重要的应用价值。目前工业上常采用强酸、强碱在高温条件下处理虾蟹壳来制备甲壳素，这种方法不仅酸、碱耗量大，污染严重，而且产品特性不稳定(如脱乙酰度、分子量和乙酰基位置不可控)。
氧化亚铁硫杆菌是一种以氧化亚铁来获得自身细胞生长和代谢所需要的能量的化能自养微生物，其主要特征为微生物在氧化亚铁过程中产生氢离子，实现水体环境的酸化(ph最低可降至2.0以下)。目前尚未有利用氧化亚铁硫杆菌生物酸化技术应用于动物甲壳脱钙制备甲壳素的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有甲壳素制备方法中大量使用强酸强碱等化学试剂的技术不足，提供一种环境友好的利用氧化亚铁硫杆菌酸化脱钙提取甲壳素的方法。
本发明所采取的技术方案是：
氧化亚铁硫杆菌在提取甲壳素中的应用。
一种利用氧化亚铁硫杆菌提取甲壳素的方法，包括以下步骤：
s1.脱钙：将甲壳与氧化亚铁硫杆菌菌液混合脱钙，过滤后得上清液a及沉淀物脱钙甲壳粉末；
s2.脱蛋白：将步骤s1中沉淀物脱钙甲壳粉末用碱液煮，固液分离后，得沉淀物脱蛋白甲壳粉末；
s3.重复脱钙脱蛋白：将步骤s2中脱蛋白甲壳粉末加入步骤s1上清液a中，再次混合脱钙，并重复步骤s2进行碱液煮脱蛋白；至少重复1次该脱钙脱蛋白操作；
s4.最终固液分离后所得沉淀物即为甲壳素。
优选的，步骤s1所述氧化亚铁硫杆菌菌液的制备方法为在培养基中添加亚铁盐后，接种氧化亚铁硫杆菌，25～37℃、120～240rpm培养36～72h，ph降至4～5时停止培养。
优选的，所述培养基的配方为：每1000ml水中含有(nh4)2so43.3～3.7g、kcl0.11～0.12g、k2hpo40.05～0.06g、ca(no3)2·4h2o0.016～0.017g、mgso4·7h2o0.58～0.59g。
更优选的，所述培养基的配方为：每1000ml水中含有(nh4)2so43.5g、kcl0.119g、k2hpo40.058g、ca(no3)2·4h2o0.0168g、mgso4·7h2o0.583g。
优选的，所述亚铁盐在培养基中的浓度为0.1～0.2mol/l。
优选的，所述亚铁盐优选为硫酸亚铁、硝酸亚铁中的至少一种。
优选的，步骤s1所述混合脱钙的条件为25～37℃、120～240rpm培养2～10h。
更优选的，步骤s1所述混合脱钙的条件为28～32℃、150～200rpm培养3～6h。
优选的，步骤s1所述甲壳与氧化亚铁硫杆菌菌液的质量比为1：2～10。
优选的，步骤s2所述用碱液煮的具体操作为用0.5～2mol/l碱液煮沸10～30h。
优选的，所述碱液选自氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种，更优选为氢氧化钠，氢氧化钠。
优选的，步骤s3所述混合脱钙的反应条件为28～37℃、120～200rpm培养2～10h。
更优选的，步骤s3所述混合脱钙的反应条件为28～32℃、150～200rpm培养3～6h。
优选的，所述甲壳包括虾壳、蟹壳；
优选的，所述甲壳为破碎的甲壳，破碎后的直径为1～10mm，破碎后的直径更优选为2～5mm。
本发明的有益效果是：
1.通过氧化亚铁硫杆菌的生物酸化作用，可以在不添加酸的条件下实现动物甲壳中钙的高效脱除，整个生产过程中不使用酸性等化学试剂，环境友好，拓宽了产品的使用面具有广泛应用前景。
2.与现有化学酸脱钙技术比较，利用氧化亚铁硫杆菌培养的生物酸化溶液可以通过微生物培养持续产酸并回用于动物甲壳重复脱钙，进一步提高酸化脱钙的效果。
3.本发明方法经过重复脱钙与脱蛋白的步骤，能够得到高纯的甲壳素，提取方法简单，提取效果显著。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明应用。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料。除非特别说明，下述实施例中使用的设备为本领域常规使用的设备。
实施例1
按照以下步骤提取甲壳素：
(1)粗破碎：将虾壳粗破碎处理，所得的虾壳直径为2～5mm。
(2)氧化亚铁硫杆菌菌液制备：在含0.15mol/l硫酸亚铁的微生物基础培养基中接种氧化亚铁硫杆菌，30℃、150rpm培养72h，此时菌液体系ph为4.1。微生物基础培养基配方为：(nh4)2so43.5g、kcl0.119g、k2hpo40.058g、ca(no3)2·4h2o0.0168g、mgso4·7h2o0.583g，水1000ml。
(3)一次脱钙：将破碎后的虾壳与氧化亚铁硫杆菌菌液按照质量比1：2的比例混合，25℃、200rpm培养4h，固液分离后所得固体为脱钙虾壳粉末，上清液备用。
(4)一次脱蛋白：将脱钙虾壳粉末采用2mol/l氢氧化钠溶液煮沸脱蛋白10h；固液分离后所得固体为脱蛋白虾壳粉末。
(5)二次脱钙与脱蛋白：将脱蛋白虾壳粉末加入步骤(3)上清液，30℃、150rpm培养5h后再次脱钙，脱钙后重复步骤(4)脱蛋白。固液分离后所得的脱蛋白虾壳粉末为甲壳素。
甲壳素经自来水清洗至中性后于90℃烘干。经检测，钙的去除率为96.67％，蛋白质的去除率为85.67％。
实施例2
按照以下步骤提取甲壳素：
(1)粗破碎：将虾壳粗破碎处理，所得的虾壳直径为2～5mm。
(2)氧化亚铁硫杆菌菌液制备：在含0.1mol/l硫酸亚铁的微生物基础培养基中接种氧化亚铁硫杆菌，28℃、180rpm培养60h，此时菌液体系ph为4.2。微生物基础培养基配方为：(nh4)2so43.5g、kcl0.119g、k2hpo40.058g、ca(no3)2·4h2o0.0168g、mgso4·7h2o0.583g，水1000ml。
(3)一次脱钙：将破碎后的虾壳与氧化亚铁硫杆菌菌液按照质量比1：7的比例混合，28℃、180rpm培养2h，固液分离后所得固体为脱钙虾壳粉末，上清液备用。
(4)一次脱蛋白：将脱钙虾壳粉末采用1mol/l氢氧化钾溶液煮沸脱蛋白30h；固液分离后所得固体为脱蛋白虾壳粉末。
(5)二次脱钙与脱蛋白：将脱蛋白虾壳粉末加入步骤(3)上清液，28℃、180rpm培养10h后再次脱钙，脱钙后重复步骤(4)脱蛋白。固液分离后所得的脱蛋白虾壳粉末为甲壳素。
甲壳素经自来水清洗至中性后于90℃烘干。经检测，钙的去除率为94.78％，蛋白质的去除率为84.12％。
实施例3
按照以下步骤提取甲壳素：
(1)粗破碎：将蟹壳粗破碎处理，所得的蟹壳直径为1～10mm。
(2)氧化亚铁硫杆菌菌液制备：在含0.15mol/l硝酸亚铁的微生物基础培养基中接种氧化亚铁硫杆菌，25℃、200rpm培养72h，此时菌液体系ph为5.0。微生物基础培养基配方为：(nh4)2so43.5g、kcl0.119g、k2hpo40.058g、ca(no3)2·4h2o0.0168g、mgso4·7h2o0.583g，水1000ml。
(3)一次脱钙：将破碎后的蟹壳与氧化亚铁硫杆菌菌液按照质量比1：5的比例混合，30℃、240rpm培养8h，固液分离后所得固体为脱钙蟹壳粉末，上清液备用。
(4)一次脱蛋白：将脱钙蟹壳粉末采用0.5mol/l氢氧化钠与氢氧化钾的混合溶液煮脱脱蛋白20h，温度为100℃；固液分离后所得固体为脱蛋白蟹壳粉末。
(5)二次脱钙与脱蛋白：将脱蛋白蟹壳粉末加入步骤(3)上清液，30℃、200rpm培养2h后再次脱钙，脱钙后重复步骤(4)脱蛋白。固液分离后所得的脱蛋白蟹壳粉末为甲壳素。
甲壳素经自来水清洗至中性后于90℃烘干。经检测，钙的去除率为95.41％，蛋白质的去除率为83.87％。
实施例4
按照以下步骤提取甲壳素：
(1)粗破碎：将虾壳粗破碎处理后所得的虾壳直径为1～10mm。
(2)氧化亚铁硫杆菌菌液制备：在含0.2mol/l硫酸亚铁的微生物基础培养基中接种氧化亚铁硫杆菌，37℃、240rpm培养36h，此时菌液体系ph为4.0。微生物基础培养基配方为：(nh4)2so43.5g、kcl0.119g、k2hpo40.058g、ca(no3)2·4h2o0.0168g、mgso4·7h2o0.583g，水1000ml。
(3)一次脱钙：将破碎后的虾壳与氧化亚铁硫杆菌菌液按照质量比1：10的比例混合，37℃、120rpm培养10h，固液分离后所得固体为脱钙虾壳粉末，上清液备用。
(4)一次脱蛋白：将脱钙虾壳粉末采用1.5mol/l氢氧化钠溶液煮脱脱蛋白15h，温度为100℃；固液分离后所得固体为脱蛋白虾壳粉末。
(5)二次脱钙与脱蛋白：将脱蛋白虾壳粉末加入步骤(3)上清液，37℃、120rpm培养3h后再次脱钙，脱钙后重复步骤(4)脱蛋白。固液分离后所得的脱蛋白虾壳粉末为甲壳素。
甲壳素经自来水清洗至中性后于90℃烘干。经检测，钙的去除率为97.85％，蛋白质的去除率为87.52％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。