一种性能稳定的黑米花青素单体及分子修饰制备方法与流程

本发明属于色素研究技术领域，具体涉及一种性能稳定的黑米花青素单体（矢车菊素-3-葡萄糖苷，c3g）及分子修饰制备方法。

背景技术：

花青素，又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属类黄酮化合物，也是植物花瓣中的主要呈色物质。近年来，国内外对花青素的生理功能进行了大量的研究，且取得了丰硕的研究成果。研究发现，经常食用花青素可明显改善视力、缓解肝功能障碍、抑制肿瘤活性、减缓老年斑的沉积，而且具有抗氧化延缓衰老的功能。同时，花青素还是一种较为安全的天然色素，大量开发花青素，不仅可满足人们对其作为药物、化妆品及保健食品的需求，而且可替代对人体有害的人工合成色素的使用。

但是，花青素结构决定了其在自然状态下不稳定，易发生降解；同时外界环境因素也是影响花青素稳定性的重要因素，如光照、ph值、温度、酶及氧化还原剂等。因此，提高花青素的稳定性对于拓宽花青素的利用具有积极的促进作用。而目前主要通过微胶囊法来提高天然活性物质在食品工业中的应用，但微胶囊壁材大都易溶于食品中常见的水环境，因此一定程度上限制了微胶囊技术的应用。我们在前期的试验中发现，将黑米花青素的主要单体（c3g），以化学或者生物酶为催化剂，在非水环境中与酰基供体产生酰基化反应，得到的衍生物对金属离子、温度、光线的稳定性显著提高，而且对益生菌的增殖作用也较大地提高。

技术实现要素：

为了提高花青素的稳定性，减少反应过程中副产物的产生，本发明提供一种性能稳定的黑米花青素单体及分子修饰制备方法。

一种性能稳定的黑米花青素单体为酰化矢车菊素-3-葡萄糖苷，由矢车菊素-3-葡萄糖苷经过p-香豆酸、苹果酸、月桂酸和对羟基苯甲酸修饰制得，酰化矢车菊素-3-葡萄糖苷为棕褐色粉末状，其纯度≥95%。

一种性能稳定的黑米花青素单体的分子修饰制备方法的具体操作步骤如下：

利用4a分子筛将反应介质干燥，将酰基供体和矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末按照10～50:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，反应物与反应介质的固液比为（1:1-2），连续搅拌至完全溶解，加入novozym435脂肪酶，novozym435脂肪酶在溶液中浓度为5～40mg/ml，最后加入浓度100mg/ml的4a分子筛吸收反应过程中产生的水，在30～50℃下，反应100～168h，得到矢车菊素-3-葡萄糖苷反应液；

所述反应介质为叔戊醇或乙腈或正丁醇中的一种；

所述酰基供体为p-香豆酸或苹果酸或月桂酸或对羟基苯甲酸中的一种；

所述矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末的纯度大于99.0%；

通过制备型液相色谱，利用乙腈洗脱，得到只含有矢车菊素-3-葡萄糖苷修饰产物的分离液；

将所述分离液预冷冻，真空冷冻干燥机中，在真空度0.05～0.1mpa、冷冻干燥温度-20～-60℃条件下，干燥至水分含量≤5%，得到棕褐色粉末状的酰化矢车菊素-3-葡萄糖苷。

制备矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）的操作步骤如下：

（1）清洗去杂

除去黑米中肉眼可见的杂质和霉变的颗粒；

（2）粉碎浸提

用去离子水清洗除杂后的黑米，粉碎，过50～100目筛；按照质量体积比1kg:10～20l取黑米和水，加入浓度1～3%的柠檬酸溶液调节ph为2.5～6.0，在20～55℃下，浸提2～5h，得到黑米花青素浸提液；

（3）离心分离

离心处理黑米花青素浸提液，使固液分离，取上清液，得到黑米花青素水提液；

（4）树脂纯化

利用ab-8树脂纯化黑米花青素水提液，乙醇洗脱，收集黑米花青素乙醇洗脱液；

（5）纳滤浓缩

利用分子量200～400da的纳滤膜浓缩黑米花青素乙醇洗脱液，收集截留液，得到黑米花青素浓缩液；

（6）制备黑米花青素粗提物

将黑米花青素浓缩液真空冷冻干燥至水分含量≤5%，获得粉末状的黑米花青素粗提物；

（7）矢车菊素-3-葡萄糖苷提取纯化

按体积比1：3-5，将黑米花青素粗提物用酸液复溶，通过制备型液相色谱，利用甲醇和乙腈洗脱，得到只含有矢车菊素-3-葡萄糖苷的分离液；

（8）真空冷冻干燥

将矢车菊素-3-葡萄糖苷的分离液真空冷冻干燥至水分含量≤5%，即得矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末。

进一步限定的制备矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）的技术方案如下：

步骤（3）中，通过碟片式离心机，在5000～10000r/min下，除去黑米花青素浸提液中的淀粉、蛋白质、多糖等杂质。

步骤（4）中，先用3～9倍柱体积的去离子水洗脱柱子，再按照ab-8树脂体积的1～4倍进行上样，最后用浓度为65～95%的乙醇洗脱，洗脱体积2～5倍柱体积。

步骤（5）中，纳滤浓缩条件：压力0.4～0.8mpa、温度20～45℃条件下冷冻干燥。

步骤（6）中，真空干燥操作如下：在温度0～-2℃条件下，将黑米花青素浓缩液预冷冻0.5～1h；在真空冷冻干燥机中，真空度0.05～0.1mpa、温度-20～-60℃条件下。

步骤（7）中，所述酸液为浓度100%的p-香豆酸或浓度100%的苹果酸、月桂酸或对羟基苯甲酸。

步骤（8）中，在温度0～-2℃条件下，将矢车菊素-3-葡萄糖苷分离液预冷冻0.5～1h；在真空冷冻干燥机中，真空度0.05～0.1mpa、温度-20～-60℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末状的矢车菊素-3-葡萄糖苷粉末。

本发明的有益技术效果体现在以下方面：

（1）本发明利用novozym435酶修饰花青素单体c3g的方法，提高了花青素的稳定性（修饰后的花青素单体c3g的稳定性提高50%以上）；利用制备型高效液相色谱分离纯化花青素修饰产物，提高了花青素修饰后的纯化效率（纯度为95%以上）。

（2）修饰方法采用酶法修饰

化学修饰反应条件难于控制，反应产物复杂，后期分离纯化困难；本发明利用novozym435酶修饰花青素单体矢车菊素-3-葡萄糖苷，酶法修饰由于其高度专一性、安全性、高效性、反应条件温和及便于控制等优点，且酶法修饰产物较单一，结合制备型液相色谱，产物易于分离纯化。将黑米花青素的单体（c3g），以novozym435酶为催化剂，在非水环境中与p-香豆酸、苹果酸、月桂酸和对羟基苯甲酸等产生酰基化反应，得到的衍生物酰化矢车菊素-3-o-葡萄糖苷）的稳定性显著提高。

（3）花青素稳定性提高

本发明在整个提取、纯化过程中，采用中温浸提，离心除杂，冷冻干燥法干燥，最大程度保证花青素单体不被破坏；在此基础上，在维持花青素原有活性基本不变的情况下，通过改变花青素的结构来提高其稳定性。目前，天然产物主要采用微胶囊法包埋，避免外界环境因素对其稳定性造成影响，常用的壁材如阿拉伯胶、麦芽糊精等均溶于水，而食品大部分均含有水体系，这就会对微胶囊壁材造成损伤，从而影响其包埋效果。而本发明从花青素结构入手，通过改变其相关空间结构来提高其稳定性，延缓花青素在不同条件下的降解，参见图2，利用本发明方法获得的矢车菊素-3-葡萄糖苷修饰产物与未修饰矢车菊素-3-葡萄糖苷相比，在常温、光照等条件下的稳定性提高了约50%以上，因酰化矢车菊素-3-o-葡萄糖苷的稳定性进一步提高。

附图说明

图1为矢车菊素-3-葡萄糖苷的产品液相色谱图。

图2为c3g被p-香豆酸为酰基供体（为例）成功修饰的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。

实施例1

矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末的制备操作步骤如下：

（1）清洗去杂：除去黑米中肉眼可见的杂质其霉变的颗粒；

（2）粉碎浸提：将除杂后的黑米粉碎，过50目筛；按照质量体积比为1kg:10l取黑米和水，再用1%的柠檬酸溶液调节其ph值为2.5，在20℃下，浸提2h，得到黑米花青素浸提液；

（3）离心分离：通过碟片式离心机，在5000r/min下，将黑米花青素浸提液进行固液分离，除去浸提液中的淀粉、蛋白质、多糖等杂质，取上清液，得到黑米花青素水提液；

（4）树脂纯化：利用ab-8树脂纯化黑米花青素水提液，先用3倍柱体积的去离子水洗脱柱子，再按照树脂体积的1倍进行上样，最后用浓度为65%的乙醇洗脱，洗脱体积2倍柱体积，收集黑米花青素乙醇洗脱液；

（5）纳滤浓缩：利用分子量为200da的纳滤膜浓缩黑米花青素乙醇洗脱液，操作压力0.4mpa，温度20℃，收集截留液，得到黑米花青素浓缩液；

（6）真空冷冻干燥：在温度0℃条件下，将黑米花青素浓缩液预冷冻0.5h；放入真空冷冻干燥机中，在真空度0.05mpa、冷冻干燥温度-20℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末状的黑米花青素粗提物，即为黑米花青素粉末；

（7）提取纯化：按体积比1：3将黑米花青素粗提物用酸液复溶，酸液为浓度100%的p-香豆酸，通过制备型液相色谱，利用甲醇和乙腈洗脱，得到只含有c3g的分离液；

（8）真空冷冻干燥：在温度0℃条件下，将矢车菊素-3-葡萄糖苷分离液预冷冻0.5h后，放入真空冷冻干燥机中，在真空度0.05mpa、冷冻干燥温度-20℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末即为c3g粉末；所述矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末的纯度为99.15%。矢车菊素-3-葡萄糖苷的产品液相色谱图如图1所示。

实施例2

矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末的制备操作步骤如下：

（1）清洗去杂：除去黑米中肉眼可见的杂志其霉变的颗粒；

（2）粉碎浸提：将除杂后的黑米粉碎，过100目筛；按照质量体积比为1:20（kg/l）取黑米和水，再用3%的柠檬酸溶液调节其ph为6.0，在55℃下，浸提5h，得到黑米花青素浸提液；

（3）离心分离：通过碟片式离心机，在10000r/min下，将黑米花青素浸提液进行固液分离，除去浸提液中的淀粉、蛋白质、多糖等杂质，取其上清液，得到黑米花青素水提液；

（4）树脂纯化：利用ab-8树脂纯化黑米花青素水提液，先用9倍柱体积的去离子水洗脱柱子，再按照树脂体积的4倍进行上样，最后用浓度为95%的乙醇洗脱，洗脱体积5倍柱体积，收集黑米花青素乙醇洗脱液；

（5）纳滤浓缩：利用分子量为400da的纳滤膜浓缩黑米花青素乙醇洗脱液，操作压力0.8mpa，温度45℃，收集截留液，得到黑米花青素浓缩液；

（6）真空冷冻干燥：在温度-2℃条件下，将黑米花青素浓缩液预冷冻1h后，放入真空冷冻干燥机中，在真空度0.1mpa、冷冻干燥温度-60℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末即为黑米花青素粗提物；

（7）c3g提取纯化：按体积比1：5将花青素粗提物用酸液复溶，酸液为浓度100%的苹果酸酸，通过制备型液相色谱，利用甲醇和乙腈洗脱，得到只含有c3g的分离液；

（8）真空冷冻干燥：在温度-2℃条件下，将矢车菊素-3-葡萄糖苷分离液预冷冻1h后，放入真空冷冻干燥机中，在真空度0.1mpa、冷冻干燥温度-60℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末即为c3g粉末；所述矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末的纯度为99.15%。

实施例3

矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末的制备操作步骤如下：

（1）清洗去杂：除去黑米中肉眼可见的杂志其霉变的颗粒；

（2）粉碎浸提：将除杂后的黑米粉碎，过100目筛；按照质量体积比为1:20（kg/l）取黑米和水，再用3%的柠檬酸溶液调节其ph为6.0，在55℃下，浸提5h，得到黑米花青素浸提液；

（3）离心分离：通过碟片式离心机，在10000r/min下，将黑米花青素浸提液进行固液分离，除去浸提液中的淀粉、蛋白质、多糖等杂质，取其上清液，得到黑米花青素水提液；

（4）树脂纯化：利用ab-8树脂纯化黑米花青素水提液，先用9倍柱体积的去离子水洗脱柱子，再按照树脂体积的4倍进行上样，最后用浓度为95%的乙醇洗脱，洗脱体积5倍柱体积，收集黑米花青素乙醇洗脱液；

（5）纳滤浓缩：利用分子量为400da的纳滤膜浓缩黑米花青素乙醇洗脱液，操作压力0.8mpa，温度45℃，收集截留液，得到黑米花青素浓缩液；

（6）真空冷冻干燥：在温度0℃条件下，将黑米花青素浓缩液预冷冻0.5h，放入真空冷冻干燥机中，在真空度0.1mpa、冷冻干燥温度-60℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末即为黑米花青素粗提物；

（7）c3g提取纯化：按体积比1：5将花青素粗提物用酸液复溶，酸液为浓度100%的月桂酸酸液，通过制备型液相色谱，利用甲醇和乙腈洗脱，得到只含有c3g的分离液；

（8）真空冷冻干燥：在温度0℃条件下，将矢车菊素-3-葡萄糖苷分离液预冷冻0.5h后，放入真空冷冻干燥机中，在真空度0.1mpa、冷冻干燥温度-60℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末即为c3g粉末；所述矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末的纯度为99.15%。

实施例4

矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末的制备操作步骤如下：

（1）清洗去杂：除去黑米中肉眼可见的杂志其霉变的颗粒；

（2）粉碎浸提：将除杂后的黑米粉碎，过100目筛；按照质量体积比为1:20（kg/l）取黑米和水，再用3%的柠檬酸溶液调节其ph为6.0，在55℃下，浸提5h，得到黑米花青素浸提液；

（3）离心分离：通过碟片式离心机，在10000r/min下，将黑米花青素浸提液进行固液分离，除去浸提液中的淀粉、蛋白质、多糖等杂质，取其上清液，得到黑米花青素水提液；

（4）树脂纯化：利用ab-8树脂纯化黑米花青素水提液，先用9倍柱体积的去离子水洗脱柱子，再按照树脂体积的4倍进行上样，最后用浓度为95%的乙醇洗脱，洗脱体积5倍柱体积，收集黑米花青素乙醇洗脱液；

（5）纳滤浓缩：利用分子量为400da的纳滤膜浓缩黑米花青素乙醇洗脱液，操作压力0.8mpa，温度45℃，收集截留液，得到黑米花青素浓缩液；

（6）真空冷冻干燥：在温度-2℃条件下，将黑米花青素浓缩液预冷冻1h后，放入真空冷冻干燥机中，在真空度0.1mpa、冷冻干燥温度-60℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末即为黑米花青素粗提物；

（7）c3g提取纯化：按体积比1：5将花青素粗提物用酸液复溶，酸液为浓度100%的对羟基苯甲酸，通过制备型液相色谱，利用甲醇和乙腈洗脱，得到只含有c3g的分离液；

（8）真空冷冻干燥：在温度-2℃条件下，将矢车菊素-3-葡萄糖苷分离液预冷冻1h后，放入真空冷冻干燥机中，在真空度0.1mpa、冷冻干燥温度-60℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末即为c3g粉末；所述矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末的纯度为99.15%。

实施例5

一种性能稳定的黑米花青素单体（c3g）的分子修饰制备操作步骤如下：

（1）酶法修饰c3g：利用4a分子筛将反应介质叔戊醇干燥，将酰基供体p-香豆酸和矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末按照10:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，反应物与反应介质的固液比为1:1，连续搅拌至完全溶解，加入novozym435脂肪酶，使novozym435脂肪酶在溶液中浓度为5mg/ml，最后加入浓度100mg/ml的4a分子筛吸收反应过程中产生的水，在30℃下，反应100h，得到矢车菊素-3-葡萄糖苷反应液；

（2）c3g修饰产物纯化：

通过制备型液相色谱，利用乙腈洗脱，得到只含有c3g修饰产物的分离液；

（3）真空冷冻干燥：

将修饰产物分离液预冷冻后放入真空冷冻干燥机中，在真空度0.05mpa、冷冻干燥温度-20℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末即为c3g修饰产物（其纯度≥95%）。c3g被p-香豆酸为酰基供体（为例）成功修饰的质谱图如图2所示。

实施例6

一种性能稳定的黑米花青素单体（c3g）的分子修饰制备操作步骤如下：

（1）酶法修饰c3g：利用4a分子筛将反应介质乙腈干燥，将酰基供体苹果酸和矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末按照50:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，反应物与反应介质的固液比为（1:2,），连续搅拌至完全溶解，加入novozym435脂肪酶，使novozym435脂肪酶在溶液中浓度为40mg/ml，最后加入浓度100mg/ml的4a分子筛吸收反应过程中产生的水，在50℃下，反应168h，得到矢车菊素-3-葡萄糖苷反应液；

（2）c3g修饰产物纯化：通过制备型液相色谱，利用乙腈洗脱，得到只含有c3g修饰产物的分离液；

（3）真空冷冻干燥：将修饰产物分离液预冷冻后放入真空冷冻干燥机中，在真空度0.1mpa、冷冻干燥温度-60℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末即为c3g修饰产物（其纯度≥95%）。

实施例7

一种性能稳定的黑米花青素单体（c3g）的分子修饰制备操作步骤如下：

（1）酶法修饰c3g：利用4a分子筛将反应介质正丁醇干燥，将酰基供体月桂酸和矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末按照10:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，反应物与反应介质的固液比为（1:1,），连续搅拌至完全溶解，加入novozym435脂肪酶，使novozym435脂肪酶在溶液中浓度为5mg/ml，最后加入浓度100mg/ml的4a分子筛吸收反应过程中产生的水，在30℃下，反应100h，得到矢车菊素-3-葡萄糖苷反应液；

（2）c3g修饰产物纯化：通过制备型液相色谱，利用乙腈洗脱，得到只含有c3g修饰产物的分离液；

（3）真空冷冻干燥：将修饰产物分离液预冷冻后放入真空冷冻干燥机中，在真空度0.1mpa、冷冻干燥温度-60℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末即为c3g修饰产物（其纯度≥95%）。

实施例8

一种性能稳定的黑米花青素单体（c3g）的分子修饰制备操作步骤如下：

（1）酶法修饰c3g：利用4a分子筛将反应介质叔戊醇干燥，将酰基供体对羟基苯甲酸和矢车菊素-3-葡萄糖苷（c3g）粉末按照50:1的摩尔比加入干燥后的反应介质中，反应物与反应介质的固液比为（1:2），连续搅拌至完全溶解，加入novozym435脂肪酶，使novozym435脂肪酶在溶液中浓度为40mg/ml，最后加入浓度100mg/ml的4a分子筛吸收反应过程中产生的水，在50℃下，反应168h，得到矢车菊素-3-葡萄糖苷反应液；

（2）c3g修饰产物纯化：通过制备型液相色谱，利用乙腈洗脱，得到只含有c3g修饰产物的分离液；

（3）真空冷冻干燥：将修饰产物分离液预冷冻后放入真空冷冻干燥机中，在真空度0.1mpa、冷冻干燥温度-60℃条件下，干燥至水分含量≤5%，获得粉末即为c3g修饰产物（其纯度≥95%）。