本发明涉及微生物筛选技术领域，具体涉及一种镉活化微生物的摇瓶复筛方法。
背景技术：
随着我国工业化及农业发展步伐的加快，化肥农药的大量使用、污水灌溉、矿产资源的不合理开发和利用、电子废弃物倾倒与拆解等，致使土壤污染情况日趋严重。土壤污染类型大致分为无机型、有机型及复合型污染，调查数据显示，其中无机污染物(重金属)超标点位数高达82.8％。其中，镉作为生活环境中常见的有害污染物，由于其不良影响(氧化应激、多种酶活性的变化、与dna和rna等生物分子的相互作用等)以及由此产生的潜在风险而成为人类健康的一个重要风险。世界卫生组织(who)将镉列为重点研究的食品污染物；国际癌症研究机构(iarc)将镉认定为i类致癌物。镉在体内累积一定程度，能够损害泌尿系统、使身体结缔组织损伤、生殖系统功能障碍、致畸，且能引发乳腺癌。
目前，重金属污染土壤的修复已成为社会发展过程中亟待解决的问题之一。其中，微生物修复、微生物-植物联合修复等生物修复技术具有安全、环保、低耗的优势，且符合我国建立环境友好型社会的目标宗旨，具有很大的发展潜力。因此，在微生物修复技术中，功能微生物资源的筛选是能否有效提高修复效率的关键步骤之一。活化重金属功能的微生物复筛方法主要通过摇瓶发酵，将发酵液添加于重金属污染土培养的方式进行复筛。如通过平板指示剂变色法进行初筛，得到产酸菌，再通过摇瓶发酵将发酵液添加到污染土壤中，摇床培养一段时间后，添加浸提剂，提取有效态重金属，采用原子吸收法测定样品cd、as、zn浓度，比较供试菌株活化重金属效果，但该方法耗时较长且稍显复杂。因此，急需一种能够高效且简单筛选重金属活化微生物的筛选方法。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种镉活化微生物的摇瓶复筛方法，方法操作过程简单易行，且耗时相对较短，可以在前期平板初筛结果的基础上，通过摇瓶发酵的方法，直接或间接测得菌株的镉离子活化量，通过数据直观比较各供试菌株的活化效果，也体现出菌株对镉离子的吸附情况。
为实现上述目的，本发明提供一种镉活化微生物的摇瓶复筛方法，包括如下步骤：
1)将供试菌株在无菌条件下接种于盛有含镉培养基的摇瓶中发酵培养，并以培养基中接种蒸馏水作为对照组；含镉培养基中的镉含量记作m1；
2)将步骤1)发酵培养后的培养物和对照组分别分离得到滤渣和上清液；培养物的上清液稀释后测定镉离子浓度，得到培养基与供试菌株镉离子活化量之和m2；对照组的上清液稀释后测定镉离子浓度，得到对照组中的镉含量记作m3；
3)将培养物的滤渣用去离子水清洗至滤液中基本无镉离子存在后，用酸溶解滤渣中的难溶性镉物质，分离得到培养物滤渣的上清液，稀释后测定镉离子浓度，得到剩余难溶镉量m4；
4)计算后判断供试菌株的镉活化能力及镉吸附能力。
进一步地，所述供试菌株包括细菌菌株、放线菌菌株、真菌菌株等所有可能具有镉活化能力的微生物。
进一步地，所述含镉培养基包括葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、含镉物质。
进一步地，所述含镉物质包括氢氧化镉、碳酸镉、磷酸镉等所有含镉物质。含镉物质可以是直接商购得，或者是相关溶液反应配制而成。
所述碳酸镉可由硝酸镉、硫酸镉、氯化镉溶液中的一种或几种与碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵溶液中的一种或几种配制而成；
所述磷酸镉可由硝酸镉、硫酸镉、氯化镉溶液中的一种或几种与磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵、磷酸钾溶液中的一种或几种配制而成；
所述氢氧化镉可由硝酸镉、硫酸镉、氯化镉溶液中的一种或几种与氢氧化钠、氢氧化钾、氨水溶液中的一种或几种配制而成。
进一步地，所述含镉培养基包括葡萄糖5-15g/l，蛋白胨5-15g/l，酵母粉3-5g/l，氯化钠4-7g/l，含镉物质1-5g/l，ph6.5-7.3。
进一步地，所述含镉培养基包括葡萄糖5-15g/l，蛋白胨5-15g/l，酵母粉3-5g/l，氯化钠4-7g/l，碳酸镉1-5g/lg/l，ph6.5-7.3。
进一步地，所述含镉培养基包括葡萄糖5-15g/l，蛋白胨5-15g/l，酵母粉3-5g/l，氯化钠4-7g/l，氢氧化镉1-5g/l，ph6.5-7.3。
进一步地，所述含镉培养基包括葡萄糖5-15g/l，蛋白胨5-15g/l，酵母粉3-5g/l，氯化钠4-7g/l，磷酸镉1-5g/l，ph6.5-7.3。
进一步地，所述摇瓶的装液量为50-100ml/250ml。
进一步地，所述发酵培养的条件为：置于恒温震荡摇床在20-40℃，140-180r/min下培养24-72h。
进一步地，当供试菌株为细菌菌株时，培养条件为：置于恒温震荡摇床在28-37℃，140-180r/min下培养24-48h；当供试菌株为放线菌菌株时，培养条件为：置于恒温震荡摇床在25-28℃，140-180r/min下培养48-72h；当供试菌株为真菌菌株时，培养条件为：置于恒温震荡摇床在26-30℃，140-180r/min下培养48-72h。
进一步地，步骤2)中，所述分离可以是过滤或离心分离。
进一步地，所述稀释是指采用去离子水稀释50-200倍。优选为50～100倍。
进一步地，所述测定镉离子浓度采用原子吸收火焰分光光度计测定。
进一步地，步骤3)中所述酸为ph3.0-5.0的hcl溶液。酸所用的溶解体积为50-100ml，酸的量要保证滤渣中剩余的难溶性镉与hcl充分反应。
进一步地，步骤4)中所述计算的方法如下：计算(m1-m4)粗略得到培养物中的镉离子总活化量，当(m1-m4)≈m2时，由(m2-m3)粗略得到菌株的镉活化量；当(m1-m4)＞m2时，由(m1-m4-m3)粗略得到菌株的镉活化量，同时由(m1-m4-m2)粗略得到菌株的镉吸附量。
进一步地，所述判断方法如下：
当(m1-m4)≈m2时，说明供试菌株对镉具有活化能力，但对已被活化的镉离子基本无吸附作用；
当(m1-m4-m3)所得值大于0，同时(m1-m4-m2)所得值大于0，则判断供试菌株对镉具有吸附能力和活化能力。
另一方面，本发明提供一种实现上述方法的培养基，其包括包括葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、含镉物质。
进一步地，所述含镉物质包括氢氧化镉、碳酸镉、磷酸镉等所有含镉物质。
进一步地，所述含镉培养基包括葡萄糖5-15g/l，蛋白胨5-15g/l，酵母粉3-5g/l，氯化钠4-7g/l，含镉物质1-5g/l，ph6.5-7.3。
进一步地，所述含镉培养基包括葡萄糖5-15g/l，蛋白胨5-15g/l，酵母粉3-5g/l，氯化钠4-7g/l，碳酸镉1-5g/lg/l，ph6.5-7.3。
进一步地，所述含镉培养基包括葡萄糖5-15g/l，蛋白胨5-15g/l，酵母粉3-5g/l，氯化钠4-7g/l，氢氧化镉1-5g/l，ph6.5-7.3。
进一步地，所述含镉培养基包括葡萄糖5-15g/l，蛋白胨5-15g/l，酵母粉3-5g/l，氯化钠4-7g/l，磷酸镉1-5g/l，ph6.5-7.3。
本发明相对于现有技术，具有如下优点之处：
本发明提供一种镉活化微生物的摇瓶复筛方法，方法操作过程简单易行，且耗时相对较短，可以在前期平板初筛结果的基础上，通过摇瓶发酵的方法，直接或间接测得菌株的镉离子活化量，可通过数据直观比较各供试菌株的活化效果，该方法也可体现出菌株对镉离子的吸附情况。此外，活化量的大小也反映了菌株的镉耐受性强弱，可为重金属污染微生物修复技术中优良菌种资源的筛选提供有效方法。
本发明提供的方法适用菌株范围广，且培养时间短，培养条件简单，测试时间短，可实现批量筛选。
本发明所复筛得到的菌株用于实际重金属污染土壤生物修复，具有与复筛方法得到的结果一致的效果，说明本发明摇瓶复筛方法的有效性。
本发明还提供一种实现上述方法的培养基，其适用培养的菌株范围广，具有简单、高效的特点。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1细菌菌株的摇瓶复筛方法
本实施例提供了一种镉活化微生物的摇瓶复筛方法，当供试微生物为细菌菌株时，其包括以下步骤：
1)供试细菌菌株共5株，编号为：ntgb01、ntgb52、ntgb60、ntgb100、ntgb111。将供试细菌菌株在无菌条件下接种于装有0.065g的氢氧化镉培养基的摇瓶中发酵培养，并以培养基中接种蒸馏水作为对照组。其中摇瓶的装液量为50ml/250ml；培养条件为：置于恒温震荡摇床在30℃，180r/min下培养24-48h；其中，发酵培养基配方为：葡萄糖5g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉3g/l，氯化钠5g/l，氢氧化镉1.3g/l，ph7.0。
2)将1)中发酵培养后的培养物通过离心或过滤分离得到滤渣和上清液，将上清液稀释50-100倍，然后用原子吸收火焰分光光度计测定上清液中的镉离子浓度，计算得到培养基与供试细菌菌株镉离子活化量之和m2；
3)测定1)中对照组的上清液镉离子活化量，将上清液稀释50-100倍，然后用原子吸收火焰分光光度计测定上清液中的镉离子浓度，计算得到m3；
4)将2)中的滤渣用去离子水清洗、过滤，反复多次直至滤液中基本无镉离子存在；
5)将4)中滤渣置于洁净干燥的三角瓶中，添加50mlph5.0的hcl溶液，震荡一段时间，直至滤渣中的难溶性镉物质基本溶解，经离心或过滤，将滤液稀释50-100倍，用原子吸收火焰分光光度计测定滤液中的镉离子浓度，计算得到剩余的难溶镉量m4；
6)计算(m1-m4)粗略得到培养物中的镉离子总活化量，当(m1-m4)≈m2时，由(m2-m3)粗略得到菌株的镉活化量；当(m1-m4)＞m2时，由(m1-m4-m3)粗略得到菌株的镉活化量，同时由(m1-m4-m2)粗略得到菌株的镉吸附量。具体结果见表1～2.
表1.供试细菌菌株各指标测量结果
表2.供试细菌菌株对难溶性镉的活化及吸附效果数据分析
由表1、2中数据分析可知，供试细菌菌株ntgb01、ntgb60在摇瓶发酵后对镉离子基本上无吸附效果；菌株ntgb52、ntgb100、ntgb111则具有不同程度的吸附效果，但总体上活化性优于吸附性。
实施例2放线菌菌株的摇瓶复筛方法
本实施例提供了一种镉活化微生物的摇瓶复筛方法，当供试微生物为放线菌菌株时，其包括以下步骤：
1)供试放线菌菌株共5株，编号为：ntgs41、ntgs46、ntgs54、ntgs411、ntgs418。将供试放线菌菌株在无菌条件下接种于含有0.065g氢氧化镉培养基的摇瓶中发酵培养，并以培养基中接种蒸馏水作为对照组。其中摇瓶的装液量为50ml/250ml；培养条件为：置于恒温震荡摇床在27℃，160r/min下培养48-72h；发酵培养基配方为：葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，氢氧化镉1.3g/l，ph7.2。
2)将1)中发酵培养后的培养物通过离心或过滤分离得到滤渣和上清液，将上清液稀释50-100倍，然后用原子吸收火焰分光光度计测定上清液中的镉离子浓度，计算得到培养基与供试放线菌菌株镉离子活化量之和m2；
3)测定1)中对照组的上清液镉离子活化量，将上清液稀释50-100倍，然后用原子吸收火焰分光光度计测定上清液中的镉离子浓度，计算得到m3；
4)将2)中的滤渣用去离子水清洗、过滤，反复多次直至滤液中基本无镉离子存在；
5)将4)中滤渣置于洁净干燥的三角瓶中，添加50mlph4.0的hcl溶液，震荡一段时间，直至滤渣中的难溶性镉物质基本溶解，经离心或过滤，将滤液稀释50-100倍，用原子吸收火焰分光光度计测定滤液中的镉离子浓度，计算得到剩余的难溶镉量m4；
6)计算(m1-m4)粗略得到培养物中的镉离子总活化量，当(m1-m4)≈m2时，由(m2-m3)粗略得到菌株的镉活化量；当(m1-m4)＞m2时，由(m1-m4-m3)粗略得到菌株的镉活化量，同时由(m1-m4-m2)粗略得到菌株的镉吸附量。
具体结果见表3、4。
表3.供试放线菌菌株各指标测量结果
表4.供试放线菌菌株对难溶性镉的活化及吸附效果数据分析
由表3、4中数据分析可知，供试放线菌菌株ntgs41、ntgs46在发酵培养后，对镉离子基本上呈现出活化效果；ntgs54、ntgs411、ntgs416对镉离子具有不同程度的吸附效果，吸附量较小。
实施例3真菌菌株的摇瓶复筛方法
本实施例提供了一种镉活化微生物的摇瓶复筛方法，当供试微生物为真菌菌株时，其包括以下步骤：
1)供试真菌菌株共3株，编号为：ntgf82、ntgf102、ntgf104。将供试真菌株在无菌条件下接种于装有0.153g碳酸镉培养基的摇瓶中发酵培养，并以培养基中接种蒸馏水作为对照组。其中摇瓶的装液量为100ml/250ml；培养条件为：置于恒温震荡摇床在28℃，160r/min下培养48-72h；发酵培养基配方为：葡萄糖10g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，碳酸镉1.53g/l，ph6.5。
2)将1)中发酵培养后的培养物通过离心或过滤分离得到滤渣和上清液，将上清液稀释100-200倍，然后用原子吸收火焰分光光度计测定上清液中的镉离子浓度，计算得到培养基与供试真菌菌株镉离子活化量之和m2；
3)测定1)中对照组的上清液镉离子活化量，将上清液稀释100-200倍，然后用原子吸收火焰分光光度计测定上清液中的镉离子浓度，计算得到m3；
4)将2)中的滤渣用去离子水清洗、过滤，反复多次直至滤液中基本无镉离子存在；
5)将4)中滤渣置于洁净干燥的三角瓶中，添加100mlph3.0的hcl溶液，震荡一段时间，直至滤渣中的难溶性镉物质基本溶解，经离心或过滤，将滤液稀释100-200倍，用原子吸收火焰分光光度计测定滤液中的镉离子浓度，计算得到剩余的难溶镉量m4；
6)计算(m1-m4)粗略得到培养物中的镉离子总活化量，当(m1-m4)≈m2时，由(m2-m3)粗略得到菌株的镉活化量；当(m1-m4)＞m2时，由(m1-m4-m3)粗略得到菌株的镉活化量，同时由(m1-m4-m2)粗略得到菌株的镉吸附量。
具体结果见表5、6。
表5.供试真菌菌株各指标测量结果
表6.供试真菌菌株对难溶性镉的活化及吸附效果数据分析
由表5、6中数据分析可知，供试真菌菌株ntgf82、ntgf102发酵培养后，均对镉离子基本没有吸附效果；ntgf104对镉离子具有一定的吸附效果。
实验例4细菌菌株的摇瓶复筛方法应用
在上述实施例的基础上，进一步提供了一种镉活化微生物的摇瓶复筛方法的应用，当供试微生物为细菌菌株时，其包括以下步骤：
一、试验土壤
供试土壤取于湖南省浏阳市水稻田，为重金属镉污染土壤，全镉(总镉量)：(3.66±0.05)mg/kg；土壤ph6.63，将土壤自然风干，去除植物根茎等杂物，碾碎，过80目筛备用。
二、试验方法
(1)发酵液制备将细菌菌株ntgb01、ntgb52、ntgb60、ntgb100、ntgb111进行发酵培养，制得发酵液；
(2)菌悬液制备将发酵液在8000r/min离心10min，弃去上清液，菌体沉淀使用去离子水清洗、离心，重复3次，收集菌体备用，称取5g湿菌体溶于50ml去离子水中得到菌悬液；
(3)土壤培育分别称取50g镉污染土于200ml干净烧杯中，将不同供试细菌菌株菌悬液50ml于污染土中，以添加50ml去离子作为对照组，不同处理土壤常温下培育7d，期间每天用玻璃棒均匀搅拌，自然风干后研磨过筛备用；
(4)有效镉提取准确称取5g对照组及处理组土壤于25ml三角瓶中，加入25mldtpa提取剂，25℃、180r/min震荡处理2h，5000r/min，离心10min，取适量上清液，过0.22μm水系滤膜，用原子吸收分光光度计测定各处理镉污染土中的有效镉含量(mg/kg)。
经测定，各处理镉污染土中的有效镉含量如下表7。
表7.供试细菌菌株的镉活化及吸附效果
实验例5放线菌菌株的摇瓶复筛方法应用
在上述实施例的基础上，进一步提供了一种镉活化微生物的摇瓶复筛方法的应用，当供试微生物为放线菌菌株时，供试菌株包括ntgs41、ntgs46、ntgs54、ntgs411、ntgs418。
试验土壤及试验方法同实验例4。
经测定，各处理镉污染土中的有效镉含量如下表8。
表8.供试放线菌菌株的镉活化及吸附效果
实验例6真菌菌株的摇瓶复筛方法应用
在上述实施例的基础上，进一步提供了一种镉活化微生物的摇瓶复筛方法的应用，当供试微生物为真菌菌株时，供试菌株包括ntgf82、ntgf102、ntgf104。
试验土壤及试验方法同实验例4。
经测定，各处理镉污染土中的有效镉含量如下表9。
表9.供试真菌菌株的镉活化及吸附效果
由实施例1、2、3数据分析可知，当(m1-m4)≈m2时，即培养物中的镉离子总活化量与培养基与供试微生物菌株镉离子活化量之和相差不大，说明供试菌株对镉具有活化能力，但菌株对已被活化的镉离子基本无吸附作用；当(m1-m4)＞m2时，即培养物中的镉离子总活化量大于培养基与供试微生物菌株镉离子活化量之和，说明菌株对已被活化的镉离子具有吸附作用。因此，本发明提供的一种镉活化微生物的摇瓶复筛方法综合考虑了供试菌株的活化及吸附作用，由所测指标粗略得到菌株的活化量和吸附量，从而筛选出目的菌株。
由实验例4、5、6数据分析可知，供试菌株在镉污染土中所体现出的活化或吸附效果与实施例1、2、3结果一致，说明本发明所提供的方法可用来进一步复筛具有镉活化能力的功能菌株。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所衍生出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。