一种分段补料发酵生产鲜味肽的方法与流程

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种分段补料发酵生产鲜味肽的方法。

背景技术：

鲜味是五种基本味觉之一，能使人产生愉悦的味觉体验。鲜味肽是继谷氨酸钠、鸟苷酸及肌苷酸等鲜味剂之后的新型肽类鲜味剂，不仅具有鲜美的味道，还能提供氨基酸类营养物质。在大量的鲜味肽中，氨基酸序列为ser-ser-arg-asp-glu-gln-ser-arg(ssrdeqsr)的鲜味肽具有显著的呈鲜特征，不仅可以单独用于食品调味，还可作为前体物与糖类共同参与美拉德反应并产生醇厚的鲜味及特殊芳香气味，用于食物的增鲜与增香，因此，该鲜味肽在调味品领域具有巨大的市场潜力。

鲜味肽大规模生产是其在调味品领域广泛应用的基础。目前，鲜味肽的制备方法主要有：化学合成法、蛋白酶解法和生物发酵生产法。化学合成法通过氨基酸前体直接合成鲜味肽，成本较高，多用于实验室研究，难以满足大批量生产鲜味肽的需求；蛋白酶解法通过酶解、分离、纯化获得鲜味肽，常用于寻找和鉴定新的鲜味肽，但由于步骤繁多、设备要求高，依然不适用于鲜味肽的工业生产；生物发酵生产法是将鲜味肽编码基因整合到工程菌中，并通过高密度发酵大量获得鲜味肽的技术，由于成本低廉及操作简单等优势，是大规模生产鲜味肽最理想的方法。当前对于鲜味肽的生物发酵生产研究尚处于起步阶段，已有研究报道将牛肉风味肽编码基因构建到酵母中发酵生产，但其发酵产量约为0.17g/l，要想实现工业化，必须进一步优化发酵工艺提高产量。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供一种分段补料发酵生产鲜味肽的方法，以解决鲜味肽工业生产困难的问题。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种分段补料发酵生产鲜味肽的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将鲜味肽生产菌株接种至lb固体培养基上，在37℃条件下活化培养8～10h；

(2)摇瓶培养：取活化后的鲜味肽生产菌株接种至lb液体培养基中，在200rpm、37℃条件下培养至od600＝0.6，之后按0.05％～0.2％的接种量转入lb液体培养基中，在200rpm、37℃条件下摇瓶培养8h作为种子培养液备用；

(3)分段补料发酵：将种子培养液接种至基础发酵培养基中进行培养，当基础培养基中碳源浓度在5g/l以下时启动指数补料控制，进行指数流加补料，自诱导生产鲜味肽；指数流加的补料速度如(1)式所示：

式中f表示补料流加速率；μ表示菌体比生长速率，并且μ分段；x0表示开始补料时发酵罐内的菌体浓度；v0表示开始补料时发酵罐内的培养基体积；sf表示补料培养基中的底物葡萄糖浓度；yx/s菌体生长基于底物的得率系数，t表示补料时间。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤(1)中鲜味肽包括氨基酸序列为ser-ser-arg-asp-glu-gln-ser-arg的多肽。

进一步，鲜味肽的表达菌为枯草芽孢杆菌，表达载体为pma09srfa，启动子为具有自诱导特性的srfa启动子。

进一步，步骤(3)中μ值分段包括4个阶段，时间从补料开始时计算，分别为0～4h、4～8h、8～14h、14～20h，各阶段的μ值分别为0.45～0.5、0.25～0.35、0.15～0.2、0～0.1。

本发明的有益效果是：本发明通过调节鲜味肽发酵过程中的补料速度，使发酵环境更加适合于菌体b.subtiliswb800/pma09srfa-10ssrdeqsr的实际生长情况，能够在充分满足菌体碳源需求的同时，有效地避免了因碳源积累而引起的底物抑制，并提高目标产物的产量，为鲜味肽及蛋白质的大规模生产奠定了理论基础。

附图说明

图1为鲜味肽蛋白电泳结果图；m代表标准蛋白，1代表表达菌株破碎液，2代表鲜味肽10ssrdeqsr纯化液；

图2为多阶段μ值调控指数补料发酵自诱导生产鲜味肽发酵图；“□”表示dcw，“☆”表示鲜味肽产量，“△”表示葡萄糖浓度，“—”表示do；

图3定μ值调控指数补料发酵自诱导生产鲜味肽发酵图；“■”表示dcw，“★”表示鲜味肽产量，“▲”表示葡萄糖浓度，“—”表示do。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例一：鲜味肽高效自诱导生产菌株的构建

以专利cn108148116a中构建完成的鲜味肽重组质粒载体作为pcr模板，使用全质粒pcr对自诱导型启动子srfa进行同源臂设计，从而构建高效自诱导表达鲜味肽的重组质粒。自诱导启动子srfa的基因序列如seqidno.1所示，全质粒pcr的同源臂序列设计结果如表1所示，使用全质粒pcr扩增技术获得鲜味肽自诱导表达载体，得到带有自诱导表达启动子的载体质粒pma09srfa-10ssrdeqsr。

表1全质粒pcr的同源臂序列

通过饥饿化学法制备b.subtiliswb800感受态细胞，每0.5ml感受态细胞加入10μl新构建的鲜味肽重组自诱导表达质粒pma09srfa-10ssrdeqsr，于37℃、100rpm/min条件下培养90min，吸取100μl培养液涂布卡那霉素(kana)抗性平板筛选阳性转化子，获得鲜味肽高效生产工程菌b.subtiliswb800/pma09srfa-10ssrdeqsr。

取获得的工程菌接种至含有kana抗生素的5mllb液体培养基中，在200rpm、37℃条件下培养至od600＝0.6。之后按0.1t％的接种量转入含有50mllb液体培养基的250ml摇瓶中进行发酵培养，发酵培养在200rpm、37℃条件下进行，发酵时间25h。收集发酵液于12000rpm离心10min，分别收集发酵上清液和表达菌株沉淀。使用蒸馏水对表达菌株重悬，并超声破碎，镍柱亲和层析纯化收集鲜味肽纯化液。分别取40μl表达菌株破碎液和鲜味肽纯化液，加入5×sds上样缓冲液煮沸10min，12000rpm离心2min，于5％浓缩胶、15％分离胶的sds-page进行蛋白电泳。电泳结果如图1所示，泳道1、2处清晰可见约为10kda左右的蛋白条带，表明鲜味肽10ssrdeqsr在工程菌中成功表达。

实施例二：多阶段μ值调控指数补料发酵生产鲜味肽

1.生产所用培养基

lb固体培养基(g/l)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、氯化钠10、琼脂粉15。

lb液体培养基(g/l)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、氯化钠10。

基础发酵培养基(g/l)：柠檬酸氢二铵7.5、硫酸钠2.0、硫酸铵20.0、氯化铵3.5、磷酸氢二钾14.6、一水磷酸二氢钠4.0、七水硫酸镁1.0、微量金属离子溶液3.0ml、葡萄糖20.0(单独灭菌)。

微量金属离子溶液(g/l)：氯化钙0.5、七水硫酸锌0.18、一水硫酸锰0.1、乙二胺四乙酸二钠10.05、氯化铁8.35、五水硫酸铜0.16、六水氯化钴0.18。

补料培养基(g/l)：葡萄糖800。

2.种子培养基扩大培养

将鲜味肽生产菌株b.subtiliswb800/pma09srfa-10ssrdeqsr接种至lb固体培养基上，在37℃条件下进行活化培养8～10h。然后挑取该活化的鲜味肽生产菌单菌落接种至5mllb液体培养基中，在200rpm、37℃条件下培养至od600＝0.6，之后按0.05％～0.2％接种量转入50mllb液体培养基中进行摇瓶培养8h，得到种子培养液；摇瓶培养条件为200rpm、37℃。

3.分段补料发酵

将上述摇瓶培养的鲜味肽生产菌种子液接种至基础发酵培养基中进行培养，当基础培养基中碳源浓度在5g/l以下范围时启动指数补料控制，多阶段μ值调控策略如表2所示，指数补料流加速率通过方程式(1)计算获得。

式(1)中，f表示补料流加速率，μ表示菌体比生长速率，x0表示开始补料时发酵罐内的菌体浓度，v0表示开始补料时发酵罐内的培养基体积，sf表示补料培养基中的底物葡萄糖浓度，yx/s菌体生长基于底物的得率系数，t表示补料时间。

在补料过程中，通过每小时调整一次补料流加速率f值来模拟指数流加。在整个发酵过程中，培养温度为37℃，使用氨水调控培养条件ph为7，同时通过自动调节通入的空气流速和搅拌速度将发酵液中的do维持在30％左右。发酵40h后，发酵过程图如图2所示，最终得到菌体dcw和产物浓度分别为42.27g/l和1.54g/l。

表2实施例2多阶段μ值调控策略

对比例一：定μ值调控指数补料发酵生产鲜味肽

在整个发酵过程中，补料策略以指数流加方程式(1)进行，在整个发酵过程中μ的值保持为0.16，通过每小时调整一次补料流加速率f值来模拟指数流加，该流加发酵所用的培养基成分和发酵条件按照实施例2所述条件进行。发酵40h后，发酵过程图如图3所示，结果表明菌体浓度和鲜味肽的产量分别达到了34.52g/l和1.32g/l。

结果分析

对比实施例二基于多阶段μ值调控指数补料发酵和对比例一中的定μ值指数流加发酵发酵结果，发现前者的鲜味肽产量比后者提高了17％。该结果表明，基于多阶段μ值调控指数补料发酵控制更加适合于菌体b.subtiliswb800/pma09srfa-10ssrdeqsr的实际生长情况，能够在充分满足菌体碳源需求的同时，有效地避免了因碳源积累而引起的底物抑制，并提高目标产物的产量，为鲜味肽及蛋白质的大规模生产奠定了理论基础。

虽然结合实施例及附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

序列表

<110>衡阳师范学院

<120>一种分段补料发酵生产鲜味肽的方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>607

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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tgcctttttttcggtttttgcgcggtacacatagtcatgtaaagattgtaaattgcattc120

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