本发明涉及一种双酶法制备可溶性的酵母葡聚糖寡糖的方法，属于生物医药领域。
背景技术：
酵母β-葡聚糖是存在于酵母细胞壁中的一种多糖，具有增强免疫、抗氧化、抗辐射等多种生理功能。酵母β-葡聚糖是以β-1,3-葡聚糖为主，β-1,6-葡聚糖为辅的一种混合多糖，其中85％左右为水不溶性。目前经提取纯化等工艺得到的酵母β-葡聚糖产品为水不溶性葡聚糖。酵母葡聚糖已被多个国家批准为新食品配料，广泛运用于功能食品和化妆品的生产中，但其水溶性较差导致其应用范围受到了一定的限制。
为了提高酵母葡聚糖的水溶性，目前应用较多的是采用化学和物理的手段对其结构进行修饰，改性增溶。化学方法有羧甲基化、硫酸化和磷酸化等，使用大量有机溶剂，污染严重、费用较高。物理方法有超声处理和机械破碎等，物理修饰改性是一个随机性的过程，其降低相对分子质量的范围无法控制。另外，也有酶法制备可溶性酵母葡聚糖，但使用的是商品化的葡聚糖酶，价格昂贵，专一性差，水解过程难以控制，水解产物分子量范围不均一。
技术实现要素：
本发明提供了一种制备可溶性酵母葡聚糖的方法，采用专一性的葡聚糖水解酶对酵母葡聚糖进行水解，产生分子量范围均一的可溶性小分子酵母葡聚糖。本发明具有操作工艺简单、可行性高、无需使用有机溶剂、绿色环保、生产成本低且产品纯度高的优点，为生产高纯度水溶性酵母葡聚糖提供可行的方法。
本发明公开了一种双酶法制备可溶性酵母葡聚糖寡糖的方法，是向反应体系中按照10～20u葡聚糖水解酶/mg葡聚糖添加水不溶性酵母葡聚糖和葡聚糖水解酶溶液，反应一定时间制备得到可溶性酵母葡聚糖。
在本发明的一种实施方式中，所述方法中，葡聚糖水解酶包括β-1,3-葡聚糖水解酶(gly5m)和β-1,6-葡聚糖水解酶(bt3312)。
在本发明的一种实施方式中，β-1,3-葡聚糖水解酶和β-1,6-葡聚糖水解酶的酶活之比为2～5:1。
在本发明的一种实施方式中，所述gly5m或bt3312，在微生物中异源表达。
在本发明的一种实施方式中，所述gly5m是将ncbi中genbank:abd82280.1的基因在枯草芽孢杆菌或大肠杆菌中进行表达得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述bt3312是将ncbi中genbank:aao78418.1的基因在枯草芽孢杆菌或大肠杆菌中进行表达得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述水不溶性酵母葡聚糖为商业化的酵母葡聚糖。
在本发明的一种实施方式中，所述水不溶性酵母葡聚糖溶液是用20mm、ph7.5的tris-hcl缓冲液配制成浓度为1～100g/l的溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述葡聚糖水解酶溶液为纯酶液，不含其它盐，其中反应体系中添加酶活单位数(u)与酵母葡聚糖质量(mg)比为10～20：1。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系溶液的ph值控制在4.0～9.0之间。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系溶液的ph值为7.5。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系的温度在10℃-65℃之间。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系的温度为37℃。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系的反应时间为4～24h。
在本发明的一种实施方式中，所述水溶性酵母葡聚糖得率超过50％以上，分子量为1万～50万道尔顿。
本发明的第二个目的是提供所述方法在制备含寡糖的产品中的应用。
有益效果：水不溶性酵母葡聚糖的糖链通过三股螺旋的形式结合，形成网络，难以水溶。本发明通过利用β-1,3-葡聚糖水解酶和β-1,6-葡聚糖水解酶的酶切作用将水不溶性酵母葡聚糖糖苷键断裂，使得大分子葡聚糖水解为分子量为1万～50万道尔顿的寡糖或还原糖从而增加葡聚糖在水中的溶解性，可溶性酵母葡聚糖得率(即溶解率)可达36～50％。在改性过程中，生物酶解法条件温和，只降低葡聚糖的聚合度而不改变其天然结构，因此本发明方法对葡聚糖的生物活性影响较低，可广泛应用于食品、生物医药以及化妆品领域中。
附图说明
图1gly5m及bt3312在枯草芽孢杆菌或者大肠杆菌中表达的酶活，其中，两种酶催化反应都基于底物酿酒酵母葡聚糖。
图2gly5m和bt3312水解产物液相色谱分析图谱。对照：底物不加酶37℃保温12h；bt3312：底物经bt3312在37℃条件下水解12h；gly5m：底物经gly5m在37℃条件下水解12h；bt3312/gly5m：底物经bt3312和bt3312在37℃条件下水解12h。
图3gly5m和bt3312水解产物的溶解率。bt3312：底物经bt3312在37℃条件下水解12h；gly5m：底物经gly5m在37℃条件下水解12h；bt3312/gly5m：底物经bt3312和bt3312在37℃条件下水解12h。
图4gly5m和bt3312添加不同比例时水解产物的溶解率。
具体实施方式
gly5m：β-1,3-葡聚糖水解酶，编码该酶的基因序列参见ncbi中genbank:abd82280.1
bt3312：β-1,6-葡聚糖水解酶，编码该酶的基因序列参见ncbi中genbank:ae015928.1
gly5m、bt3312的酶活测定方法：以提取酵母葡聚糖(商业化产品)为底物，构建催化反应体系，包括20mmtris-hcl(ph7.5)，10mg/ml酵母葡聚糖及gly5m或bt3312，37℃，反应0.5h后100℃加热5min终止反应后，加入二硝基水杨酸(dns)，沸水浴反应10min，在540nm波长下测定吸光值。
实施例1工具酶gly5m、bt3312的制备
(1)重组大肠杆菌的摇瓶表达
以诱导性载体pet系列载体pet28a为载体，分别构建pet28a-gly5m、pet28a-bt3312，转化大肠杆菌bl21细胞得到转化子。挑取以pet系列载体构建的重组菌株单菌落于3mllb培养基(加入终浓度为50μg/ml的卡那青霉素)中，37℃，200rpm培养过夜。按1％(v/v)的比例转接50mltb培养基(加入终浓度为50μg/ml的卡那青霉素)，37℃，200rpm培养2h至od600nm大约在0.6-0.8，加入终浓度为0.1mm的iptg，诱导12h。将上述培养物于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，用预冷的tris-hcl(ph7.5)清洗、重悬菌体至50ml，冰浴超声，条件为：400w，工作2s，间歇3s，200个循环至菌液澄清，14000rpm，4℃离心20min，收集上清，即为粗酶液。对粗酶液的酶活进行测定，结果显示(图1)，gly5m酶活为960u/ml；bt3312的酶活为1950u/ml。
(2)重组枯草芽孢杆菌的摇瓶表达
以pma5为表达载体，分别构建pma5-gly5m、pma5-bt3312，转化枯草芽孢杆菌168细胞得到转化子。挑取构建的重组菌株单菌落于3mllb培养基(加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)中，37℃，200rpm培养过夜。按1％(v/v)的比例转接50ml的无机盐培养基(加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)，37℃，200rpm培养60h。将上述培养物于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，用预冷的tris-hcl(ph7.5)清洗、重悬菌体至50ml，冰浴超声，条件为：400w，工作2s，间歇3s，200个循环至菌液澄清，14000rpm，4℃离心20min，收集上清，即为粗酶液。对粗酶液的酶活进行测定，结果显示(图1)，gly5m酶活为165u/ml；bt3312的酶活为540u/ml。
实施例2gly5m、bt3312的水解产物hplc检测
以提取酵母葡聚糖为原料，分别构建如下催化反应体系：
(1)20mmtris-hcl(ph7.5),4mg/ml酵母葡聚糖及终浓度400u/mlgly5m；
(2)20mmtris-hcl(ph7.5),4mg/ml酵母葡聚糖及终浓度100u/mlbt3312；
(3)20mmtris-hcl(ph7.5),4mg/ml酵母葡聚糖及终浓度200u/mlgly5m和终浓度50u/mlbt3312，
将(1)～(3)的催化反应体系于37℃，反应6h后100℃加热5min终止反应。
将水解后的产物离心得到可溶性酵母葡聚糖(浓度约5mg/ml)，使用孔径为0.22μl的膜过滤后，采用高效液相色谱-体积排阻色谱进行分析。采用ultrahydrogeltm色谱柱(300mm×7.8mm，美国沃特斯公司)，条件如下：0.1mnano3溶液作为流动相，流速恒定保持在0.9ml/min。柱温保持在40℃，进样量为10μl。结果如图2所示
实施例3gly5m、bt3312的水解产物溶解率测定
提取酵母葡聚糖为原料，分别构建如下催化反应体系：
(1)20mmtris-hcl(ph7.5),25mg/ml酵母葡聚糖及终浓度4000u/mlgly5m；
(2)20mmtris-hcl(ph7.5),25mg/ml酵母葡聚糖及终浓度1000u/mlbt3312；
(3)20mmtris-hcl(ph7.5),25mg/ml酵母葡聚糖及终浓度2000u/mlgly5m和终浓度500u/mlbt3312，
将上述催化反应体系分别于37℃，反应12h，定时取样，于12000rpm离心10min收集上清，蒽酮法测得上清中的总糖含量。按照
实施例4不同比例gly5m、bt3312的催化效果
以提取酵母葡聚糖为原料，建如下催化反应体系：20mmtris-hcl(ph7.5),25mg/ml酵母葡聚糖，终浓度500u/mlgly5m，分别按照β-1,3-葡聚糖水解酶(gly5m)：β-1,6-葡聚糖水解酶(bt3312)为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1的比例进行催化反应，反应条件通实施例3，结果显示gly5m和bt3312的添加比例为(3～5)：1时，可溶性酵母葡聚糖溶解率可达36～50％。当β-1,3-葡聚糖水解酶(gly5m)：β-1,6-葡聚糖水解酶(bt3312)的比例为1：1时，可溶性酵母葡聚糖溶解率为15％；当β-1,3-葡聚糖水解酶(gly5m)：β-1,6-葡聚糖水解酶(bt3312)的比例为2:1时，可溶性酵母葡聚糖溶解率为20％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。