一株降解菲的菌株及其在土壤修复中的应用的制作方法

本发明涉及环境微生物学领域，具体涉及一株降解菲的菌株及其在土壤修复中的应用。

背景技术：

燃烧衍生的残留物(pyro-genic)含有相对大量的高分子量的pahs。例如，发生木材燃烧，化石燃料的气化/液化，碳生产和使用的场所经常被高浓度的荧蒽，芘，苯和苯并[a]芘污染。由于多环芳烃是杂酚油(pahs质量占比85％)的主要成分，与煤焦油或沥青生产和使用相关的工业活动将导致大量的菲，荧蒽和芘的排放。焦炭生产通常与包含蒽，菲和苯并[a]芘的材料有关。

土壤是自然环境要素的重要组成之一，它是地质力以及生物地球化学长期演化而成，是人类环境的重要组成要素，是为人类提供食物的生产资料，是人类社会最基本，最重要，不可替代的自然资源。多环芳烃在土壤中的污染具有持久性和隐蔽性，使得其危害难以被察觉。且由于多环芳烃与土壤之间有较强的疏水作用，使得不同土壤中多环芳烃难以从土壤表面脱附进入水相而被微生物完全降解利用。

近年来，微生物降解萘、菲等低分子量的pahs的机理研究较为透彻，但对于高分子pahs的代谢途径了解还较为有限，主要原因是目前分离出的能高效降解高分子pahs的菌株较少。微生物降解pahs的机理研究是探究微生物对pahs降解能力及代谢产物的基础，也是将其应用于环境修复的必要条件。萘代表最简单的多环芳烃，而蒽和菲的结构在许多致癌性pahs(如苯并[a]芘，苯并[a]蒽)中被发现，而菲代表最小的同时具有湾区和k区的多环芳烃，因而菲常被用作研究致癌pahs的模型底物。

aitken等人[1]从具有降解bap能力的各种污染场所(石油，机油，木材处理厂和炼油厂)中分离出11个菌株。该生物体被鉴定为包含至少三种假单胞菌属，以及农杆菌属，芽孢杆菌属，伯克霍尔德菌属和鞘氨醇单胞菌属。据报道[2-4]，bap能被包含红球菌，分枝杆菌以及假单胞菌属和黄杆菌属的混合培养物降解。romero等人[5]从石油炼油厂严重污染的溪流中分离出铜绿假单胞菌。发现该物种在高浓度的菲中活跃生长，并在30天内将其完全除去。

目前，多坏芳烃高效降解菌主要集中在假单胞菌、芽孢杆菌属，伯克霍尔德菌属。但是很多菌株的降解周期很长，且实际应用很少。

[1]aitkenmdstringfellowwt,nagelrd,kazungac,etal.characteristicsofphenanthrene-degradingbacteriaisolatedfromsoilscontaminatedwithpolycyclicaromatichydrocarbons[j].canadianjournalofmicrobiology,1998,44(8):743-752.

[2]walteru,beyerm,kleinj,etal.degradationofpyrenebyrhodococcussp.uw1[j].appliedmicrobiology&biotechnology,1991,34(5):671-676.

[3]trzesickamlynarzd,wardop.degradationofpolycyclicaromatichydrocarbons(pahs)byamixedcultureanditscomponentpurecultures,obtainedfrompah-contaminatedsoil.[j].canadianjournalofmicrobiology,1995,41(6):470.

[4]schneiderj,grosserr,jayasimhuluk,etal.degradationofpyrene,benz[a]anthracene,andbenzo[a]pyrenebymycobacteriumspstrainrjgii-135,isolatedfromaformercoalgasificationsite[j].applied&environmentalmicrobiology,1996,62(1):13-19.

[5]romeromc,cazaumc,giorgieris,etal.phenanthrenedegradationbymicroorganismsisolatedfromacontaminatedstream[j].environmentalpollution,1998,101(3):355-359.

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株降解菲的菌株，为降解土壤中多环芳烃污染物提供高效的菌制剂，同时具有较好的广谱性。

本发明的另一个目的是提供该降解菲的菌株在土壤修复中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一株降解菲的菌株，该菌株命名为pseudomonassp.lphe-2，属于假单胞菌属，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2019年3月8号，保藏编号为gdmccno：60603。

经过鉴定，该菌株pseudomonassp.lphe-2为革兰氏阴性菌，菌落呈乳白色，中间凸起，形状为圆形，边缘整齐、光滑，表面湿润，粘稠，易挑起；在扫描电镜显微镜下放大8000倍及12000倍观察，可以观察到菌株lphe-2形态多为短杆状，有少量球状和长杆状，可以看到有分裂趋势的长杆状，大小为0.5μm×(0.8-1.0)μm。

本发明还提供所述的降解菲的菌株pseudomonassp.lphe-2与表面活性剂协同在多环芳烃污染土壤修复中的应用；所述多环芳烃选自芴、菲、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、苯并[a]芘中的一种或多种，所述表面活性剂为tween-80或鼠李糖脂。

降解条件为：温度为30℃，ph为6，溶解氧10.72mg/l，搅拌转速180rpm，添加200mg/l丙酮酸钠，菌株的接种量为5％，表面活性剂加入量为0.25mg/g。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

①本发明菌株pseudomonassp.lphe-2具有快速高效降解phe的能力，降解期间无其他难降解物质产生。降解彻底，其最佳ph为6.0，温度为30℃，菌株接种量为5％，添加丙酮酸钠作为共代谢物具有最优的降解效果。

②本发明菌株pseudomonassp.lphe-2可以和表面活性剂联用，对pahs降解具有广谱性，短时间内降解率高。菌株pseudomonassp.lphe-2对菲芘污染土壤中phe，pyr的3天降解率分别为98.99％、54.13％；菌株pseudomonassp.lphe-2对实际污染土壤中flu，phe，flt，pyr，baa，bap的3天降解率分别为87.32％，87.66％，53.74％，53.97％，80.19％，94.84％，表明菌株pseudomonassp.lphe-2具有良好的实际应用前景。

附图说明

图1是pseudomonassp.lphe-2扫描电子显微镜图。

图2是pseudomonassp.lphe-2生长及降解菲性能与ph的变化关系图

图3是pseudomonassp.lphe-2生长及降解菲性能与温度的变化关系图。

图4是pseudomonassp.lphe-2生长及降解菲性能与共代谢物质的变化关系图。

图5是pseudomonassp.lphe-2的生长曲线图。

图6是菲的降解速率与吐温-80的浓度的变化关系图。

图7是多环芳烃(菲和芘)的降解速率与溶解氧含量的变化关系图。

图8是pseudomonassp.lphe-2在实际pahs污染土壤降解效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1本发明菌株的富集培养、纯化、筛选及鉴定

(1)培养基

(i)msm培养基：nan034.0g、nh4cl22.0g、kh2p041.5g、na2hp040.5g、cacl20.01g、mgcl20.2g、1ml微量元素溶液、去离子水1l，调至ph＝7.0，121℃灭菌20min。(使用中均添加一定量的菲，且由于菲是半挥发性的，所以在培养基灭菌后再在超净工作台上操作添加菲。)

(ii)选择培养基(固体培养基)：nan034.0g、kh2p041.5g、na2hp040.5g、cacl20.01g、mgcl20.2g、琼脂20.0g、微量元素溶液1ml、去离子水1l，ph＝7.0，121℃灭菌20min。

(iii)富集培养基：蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、nacl10.0g，溶入1l去离子水中，用naoh及hcl调至ph＝7.0，121℃灭菌20min。

(2)菌株的富集培养、纯化

分别量取10ml徐州环宇焦化厂污泥样，并倒入100ml灭过菌富集培养基中，30℃恒温培养，摇床转速为180r/min。后面转接到选择培养基中，菲初始浓度为50mg/l，多次转接直至菲降解菌大量增殖。

(3)菌种的分离与纯化

使用接菌环挑取少量富集的培养液，并在选择培养基上以“z”字形划线。培养基中长出后后，目测观察，挑取颜色，形态和大小各异的单菌落转移至新鲜的msm培养基，以菲为唯一碳源，浓度为50mg/l。培养6天后，将菌株划线并分离，重复上述操作直至获得具有相同菌落特征的菌株。

为了保证筛菌的成功，同时对多株菌进行驯化。根据菌种生长情况及降解稳定性，逐级提高选择培养基中菲的浓度至100mg/l，150mg/l，200mg/l……为确保试验无菌环境，本阶段的试验除培养与配药外，其余操作均在超净工作台完成。

(4)菌种鉴定

①本发明菌株lphe-2的菌落形态特征：菌落呈乳白色，中间凸起，形状为圆形，边缘整齐、光滑，表面湿润，粘稠，易挑起

②本发明菌株lphe-2的菌体形态特征：在扫描电镜显微镜形态多为短杆状，有少量球状和长杆状，可以看到有分裂趋势的长杆状，大小为0.5μm×(0.8-1.0)μm。

扫描电镜预处理：

0.2mpbs缓冲液：ph＝7.4，将19ml0.2mol/lnah2po4与81ml0.2mol/lna2hpo4混合。

2.5％戊二醛溶液：10ml的25％戊二醛与50ml的0.2mol/lpbs缓冲液混合，并用去离子水定容至100ml。取2ml富集的菌液置于离心机上离心浓缩，弃去上层清液，用0.2mpbs缓冲溶液清洗菌体一遍，并维持细胞渗透压；向菌体中加入2.5％戊二醛并混匀，然后于冰箱中静置4h左右；在8000rpm下离心5min，用去离子水清洗三次；再分别用浓度为50％、70％、90％、100％的酒精脱水；用纯乙酸异戊酯置换酒精两次，每次保持10min；于8000rpm下离心5min，将离心管敞口放入滤纸叠成的小盒中于40℃的恒温干燥箱中烘8h以上；将干燥好的菌株粉末涂抹在导电胶电胶带上，离子溅射镀金后，使用quanta250扫描电镜观察细菌形态。

③本发明菌株lphe-2的16srdna基因片段的pcr扩增及种属分析：筛选菌株为细菌类，因此选用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒进行菌株基因组dna的提取。设计引物27f：5'agagtttgatcmtggctcag3'(seqidno：1)，1492r：5'tacggytaccttgttacgactt3'(seqidno：2)，片段长度1500bp，将样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行16srdna测序。

测序后得到菌株lphe-2的16srdna长度为1450bp的序列，如seqidno:3。根据菌株lphe-2的16srdna序列，将序列在ncbi中进行blast分析，用mega6.0软件，采用邻近-连接(neighbor-joining)构建进化树，比较其同源序列。通过blast分析可知菌株lphe-2与pseudomonashunanensis(jx545210)相似度最高，为98.87％。结合菌株lphe-2的菌落形态，初步确定菌株为假单胞菌属，并将其命名为pseudomonassp.lphe-2。

实施例2菌株pseudomonassp.lphe-2的培养

(1)本发明菌株的培养条件优化

种子液制备：取保存的斜面培养基于室温条件下放置2h，使用无菌滴管吸取0.5ml无机盐培养基(所述无机盐培养基的组成：nano34.0g、nh4cl22.0g、kh2po41.5g、na2hpo40.5g、cacl20.01g、mgcl20.2g、1ml微量元素溶液、去离子水1l，调ph＝7.0，121℃灭菌20min；所述微量元素溶液的组成：feso4·7h2o2g、znso4·7h2o0.03g、h3bo30.3g、cocl3·6h2o0.3g、nicl2·6h2o0.02g、na2moo4·2h2o0.03g、去离子水1l，调ph＝7.0。)滴入到斜面上，轻微震荡后，取0.2ml菌悬液于固体培养基上划线分离培养96h。从固体培养基上挑取生长状况良好的菌株，接种到添加菲的无菌无机盐培养基中，其中菲的浓度为100mg/l，在30℃，180rpm条件下作为接种种子液。为保证试验结果的一致性，接种菌液均通过无机盐培养基调节到od600＝0.6后进行后续试验。

①不同ph值

将灭菌的无机盐培养基的初始ph分别调节到5、6、7、8、9五个梯度，研究不同ph条件下，菌株lphe-2的生长状况及其对菲降解效果的影响。各试验组菲的浓度均为100mg/l，装液量均为100ml/250ml，接种量5％(od600＝0.6)，每组设置3个平行，放置于30℃，180rpm的恒温震荡箱中培养5d后，取样测定其od600，萃取后测定其中菲的浓度，并计算其降解率。菌株lphe-2的生长量及对菲的降解量随初始ph值的变化呈现大体一致的趋势。当培养基的初始ph值在5-7范围时，菌株lphe-2对菲的降解量也较高，且ph为6左右时，菌株lphe-2对菲的降解量最高，可达到68.19mg/l。菌株lphe-2适宜在弱酸性的环境下生长，且最适合生长的ph值为6。

②不同温度

本部分试验通过调节恒温震荡箱的温度分别为15℃、25℃、30℃、35℃、45℃五个梯度，研究温度对于菌株lphe-2生长状况及降解效果的影响。各试验组菲的浓度均为100mg/l，装液量均为100ml/250ml，初始ph均为7.0，接种量5％(od600＝0.6)，每组设置3个平行，摇床转速均为180rpm，培养5d后，取样测定其od600，萃取后测定其中菲的浓度，并计算其降解量。菌株lphe-2的最佳培养温度为30℃，此时菌株生长量也最大。此时，降解量可达50.1mg/l。菌株较为适宜生长的温度在30-35℃附近，在此温度范围内，菌株生长量较大，且降解效果较好。

③不同共代谢物质

通过添加葡萄糖、乙酸钠、苯酚、丙酮酸钠四种小分子碳源，浓度均为200mg/l，研究添加不同共代谢物对于菌株pseudomonassp.lphe-2的生长及降解效果的影响，以不加其他碳源的一组作为对照组。各组中菲的浓度为100mg/l，装液量为100ml/250ml，初始ph7.0，接种量5％(od600＝0.6)，每组设置3个平行，放置于30℃，180rpm的恒温震荡箱中培养5d后，取样测定其od600，萃取后测定其中菲的浓度，并计算其降解量。不添加共代谢物的对照组相比，添加葡萄糖和乙酸钠的两组，菌株生物量均有所增加，但降解量却偏低，说明这两种小分子碳源能为菌株lphe-2提供生长能量来源，但同时也与菲形成碳源竞争关系，细菌倾向于利用分子量小、结构简单的碳源，导致对菲的降解效果变差。添加苯酚和丙酮酸钠作为共代谢物时，降解量高于空白对照组。原因可能是苯酚能够诱导开环的酶，这些开环酶同时可以用于对于菲的开环降解。菌株lphe-2降解菲的最佳共代谢物为丙酮酸钠，降解量可达到77.79mg/l。

(2)本发明菌株pseudomonassp.lphe-2的生长曲线测定

最佳培养条件为：初始ph＝6.0，温度30℃，添加200mg/l丙酮酸钠作为共代谢物质，考察初始菲浓度为100mg/l时菌株的生长状况。结果见图5。由图5可知菌株的对数生长期约为10-20h，生长迅速。

实施例3菌株pseudomonassp.lphe-2在菲和芘污染土壤修复中的应用

本试验所用土样采集于中国矿业大学环测学院西门南侧花园，除去表层植被后以五点法进行取样。采集回来的土样经自然风干后，剔除石块、树枝等杂质，过2mm样品筛。将＞2mm的土块粉碎后过2mm样品筛，混匀，待用。

将风干过筛的土样送至中科院红壤站进行理化性质的测定。具体包括ph、有机碳、全氮、全磷、速效磷及速效钾六个指标。各试验组泥浆制备方法如下：根据需要称取自然土200g/份，放于大玻璃培养皿中，向其中加入含菲和芘的甲醇溶液，使土样中菲和芘的终浓度为100mg/kg，搅拌混合均匀，置于避光通风处老化一周，此时甲醇已完全挥干。制备泥浆时，向土样中加入灭菌的无机盐培养基，搅拌混合均匀。

土壤理化性质测定结果如表1所示。

表1土壤理化性质

菌悬液制备：将在选择培养基中培养2d的菌液分装于灭菌的50ml离心管中，以3000rpm离心10min，弃去上层清液，加入新鲜的无机盐培养基震荡冲洗2次，消除菌体携带的碳源影响。将浓缩获得菌体集中于三角烧瓶中，用无机盐培养基调整菌体浓度至od600＝0.6，备用。需加菌的各试验组加菌量为液体总体积的5％。

泥浆体系水土比为2：1，在ph＝6.0，30℃，180rpm，添加200mg/l丙酮酸钠，条件下摇床培养6d，取样测定水相及土相中的菲含量。其中水相中均未检出，土相添加不同浓度tween-80的结果如图6所示。

由图可知，添加tween-80浓度小于其cmc值时，土壤中菲的降解受到抑制，而高于cmc值时，菲的降解效率有明显提高，且随tween-80浓度的提高降解效率会进一步升高。原因在于表面活性剂添加对于菲存在两种作用，即碳源竞争和增溶作用。当tween-80浓度低于其cmc值时，其在系统中主要起到碳源竞争的作用，故菲的降解率受到一定抑制；当浓度大于cmc值，tween-80在系统中主要起到增溶作用，促进细菌对菲的接触及降解。tween-80等表面活性剂可诱导细胞膜不饱和脂肪酸含量的增加，提高细胞膜通透性，有利于pahs的跨膜运输。当tween-80浓度为100mg/l时，phe的降解率达80.68％。

菌株pseudomonassp.lphe-2与表面活性剂具有协同效应，表面活性剂能够强化生物修复效果，因而后续试验选用tween-80，添加量定为100mg/l。

实施例4

与实施例3不同的是，本实施例中在生物泥浆反应器中进行。

通过调节不同的曝气量调节泥浆相中的溶解氧。测定四种不同曝气量情况下的溶解氧分别为7.37mg/l，8.95mg/l，10.72mg/l和11.89mg/l，并调节ph＝6.0、温度30℃，水土比2:1，搅拌转速为180rpm，添加200mg/l丙酮酸钠为小分子共代谢物质，添加表面活性剂tween-80100mg/l。其中菌株lphe-2的接种量为5％(初始od600＝0.6)。在生物泥浆反应器中反应3d后测定土壤中菲和芘的含量，并分别计算其降解率，结果如图7所示。

由图可知，随着泥浆相中溶解氧的增加，菲和芘的降解率有所增加，但对于溶解氧为10.72mg/l和11.87mg/l时，菲的降解率分别是98.99％，98.97％，菲和芘的降解率分别为54.13％，56.67％，菲和芘的降解率均几乎不变。这说明增大溶解氧有利于好氧菌株pseudomonassp.lphe-2的生长，进而提高对菲和芘的降解效果。因而在保证降解效果的情况下，考虑到节约能源，确定最佳溶解氧为10.72mg/l。

实施例5菌株lphe-2在多环芳烃污染土壤修复中的应用

本实施例中的试验土样为天津某焦化厂污染场地土壤，选取其中污染浓度最高的6种pahs进行降解特性研究，分别为芴(flu)、菲(phe)、荧蒽(flt)、芘(pyr)、苯并[a]蒽(baa)和苯并[a]芘(bap)。各参数设置均为前述确定最佳条件，即30℃，搅拌转速180rpm，溶解氧10.72mg/l，水土比2:1，添加200mg/l丙酮酸钠为小分子共代谢物质，添加表面活性剂tween-80100mg/l。其中菌株lphe-2的接种量为5％(初始od600＝0.6)。从接种菌株时开始，分别于0，12h，24h，36h，48h，60h，72h取样，测定其中6种pahs的浓度，并绘制降解曲线如8所示。在实际污染土壤成分复杂的情况下，菌株lphe-2对pahs依然具有很好的降解效果。芴(flu)、菲(phe)、荧蒽(flt)、芘(pyr)、苯并[a]蒽(baa)和苯并[a]芘(bap)的降解率分别为87.32％，87.66％，53.74％，53.97％，80.19％，94.84％。

序列表

<110>中国矿业大学

<120>一株降解菲的菌株及其在土壤修复中的应用

<160>3

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<210>1

<211>20

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<213>人工序列(artificialsequence)

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tacggytaccttgttacgactt22

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<212>dna

<213>假单胞菌(pseudomonassp.lphe-2)

<400>3

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