雷斯吲哚甲及其制备方法和抗丙型肝炎病毒用途与流程

本发明属于医药生物领域，涉及从海洋来源的雷斯青霉菌获得新结构化合物雷斯吲哚甲(英文名称：raistrickindolea)制备方法；本发明还涉及所述化合物抗丙型肝炎病毒(hcv)感染的应用。

背景技术：

丙型肝炎病毒(hcv)对人类健康构成了严重的威胁，据估计全球约有1.7亿hcv慢性感染者[lauer,etal.新英格兰医学杂志，2001,345,41-51.]。全球每年死于hcv感染的人数超过39万[世界卫生组织，全球肝炎报告，2017]。慢性丙肝患者有很高的风险发展为致命性肝病并发症，包括肝硬化和肝癌。其中，肝硬化的发病率达到20％，而在肝硬化患者中，每年肝癌的发病率达到4％-5％。近年来，随着索非布韦等核苷/酸抑制剂的上市，丙肝治疗取得了重大进展。然而，由于治疗费用较高，耐药以及较窄的病毒特异性，丙肝治疗仍充满挑战，迫切需要研发具有新作用机制的抗hcv药物。

海洋微生物是药物先导化合物发现的重要来源。本发明从一株来源于海洋的雷斯青霉菌imb17-034(penicilliumraistrickii)的发酵液中，分离获得一个新结构的吲哚二酮哌嗪生物碱，命名为雷斯吲哚甲(英文名称：raistrickindolea，式i)。涉及式i所示化合物的化学结构、制备方法及抗丙型肝炎病毒应用，迄今为止，尚未见有关报道。

技术实现要素：

本发明目的之一是，提供一株产生雷斯吲哚甲(raistrickindolea)的产生菌。

该菌株为一种海洋真菌菌株，具体为雷斯青霉菌，优选为雷斯青霉菌imb17-034，系分离自三亚红树林采集的海泥样品，该菌株于2019年02月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，建议的分类命名：雷斯青霉penicilliumraistrickii，参据的生物材料：imb17-034，保藏编号：cgmccno.17185。

本发明目的之二是，提供一种新结构的化合物，雷斯吲哚甲。

本发明从海洋真菌雷斯青霉菌imb17-034(penicilliumraistrickii)的发酵产物中发现的新化合物雷斯吲哚甲(raistrickindolea)，其结构如式i所示。

该化合物的分子式c20h19n3o4，分子量365。

本发明目的之三是，提供化合物雷斯吲哚甲的制备方法。

本发明所述的化合物雷斯吲哚甲的制备方法，包括以下步骤：

(1)将活化的保藏编号为cgmccno.17185的雷斯青霉菌imb17-034接种于配方为马铃薯葡萄糖肉汤培养基(pdb)的发酵培养基中，制作种子液，随后，将种子液转接于大米固体发酵培养基中，培养；

(2)收集菌株固体发酵产物，加入有机溶剂超声提取，得到提取物；

(3)将提取物经c18反相闪式柱色谱分离，用10％、30％、50％、70％、100％浓度的有机溶剂梯度洗脱，得到5个洗脱组分(f1-f5)，取50％洗脱组分经凝胶柱分离，然后经hplc制备得到含有式i所示化合物。

优选的，本发明所述的化合物雷斯吲哚甲的制备方法，包括以下步骤：

(1)将活化的保藏编号为cgmccno.17185的雷斯青霉菌imb17-034接种于配方为马铃薯葡萄糖肉汤培养基(pdb)的发酵培养基中，28℃，200r/min，摇瓶培养3-5天制作种子液，随后，将种子液转接于大米固体发酵培养基中，28℃静置培养30天；

(2)收集菌株固体发酵产物，加入有机溶剂超声提取，得到提取物；

(3)将乙酸乙酯部分提取物经c18反相闪式柱色谱分离，依次用10％、30％、50％、70％、100％有机溶剂梯度洗脱，得到5个洗脱组分(f1-f5)，取50％洗脱组分经凝胶柱分离，然后经hplc制备得到含有式i所示化合物。

其中，步骤(1)中，所述的固体培养基选自：包括但不限于大米或以大米为主要成分的固体培养基。

其中，步骤(2)中，有机溶剂选自：氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙酸等碳链≤4的醇类、丙酮、丁酮、或以上溶剂的混合溶液。优选为，乙酸乙酯。

其中，步骤(3)中，馏分f1-f5为10％、30％、50％、70％、100％浓度的有机溶剂依次洗脱得到；

其中，所述溶剂选自：包括但不限于丙酮水溶液、碳链≤4的醇溶液、乙腈水溶液、或甲醇中一种或以上混合。

其中，式i所示化合物的hplc分离纯化过程如下：

溶剂选自：丙酮水溶液、碳链≤4的醇溶液、乙腈水溶液。

色谱柱选自：包括但不限于c18、c8、c3、苯基键合柱。

优选为：c-18色谱柱，10mm×250mm,30％mecn,4ml/min。

进一步优选的，本发明所述的化合物雷斯吲哚甲的制备方法，包括以下步骤：

(1)真菌imb17-034(penicilliumraistrickii)的发酵：

将活化的保藏编号为cgmccno.17185的雷斯青霉菌imb17-034，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)平板上，置于28℃恒温培养箱培养7-14天，用无菌铁铲取约1cm²的含菌琼脂块接种于100ml液体马铃薯葡萄糖肉汤培养基(pdb)发酵培养基，在500ml三角瓶中，28℃，200r/min，摇瓶培养5d制作种子液；随后，将种子液按10％的接种量，转接于大米固体发酵培养基，共30瓶，28℃静置培养30天；

(2)发酵产物的提取与浸膏的获得：

收集菌株imb17-034固体发酵产物，加入等体积乙酸乙酯超声提取3次，每次60min，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯提取物；

(3)式i所示化合物的分离

将乙酸乙酯部分提取物经c18反相闪式柱色谱分离，依次用浓度为10％、30％、50％、70％、100％甲醇-水溶液梯度洗脱，得到5个洗脱馏分(f1-f5)，取50％甲醇洗脱的f3组分经凝胶柱层析分离，用80％甲醇洗脱，得到16个馏分(f3-1-f3-16)，馏分e3-11经hplc色谱分离纯化(capcellmgii5μm，10mm×250mm,30％mecn,4ml/min)，即得。

本发明目的之四是，提供式i所示化合物或以其为活性成分的药物组合物在治疗丙型肝炎病毒(hcv)的药物中的应用。

本发明测试了所述雷斯吲哚甲对hcv病毒的抑制活性。实验结果显示该化合物对所试验的hcv病毒具有较好的抑制活性。表明所述化合物可用于制备抗hcv的药物。而以所述化合物作为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗hcv的药物组合物。所述药物及药物组合物可用于丙型肝炎的临床治疗。所述化合物也可与已知药物组成复方制剂用于丙型肝炎的治疗。

本发明中经微生物发酵制备式ⅰ所示雷斯吲哚甲的方法，可适用于其他能产生此类化合物的任何微生物。

而以所述衍生物作为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体、赋性剂或辅料配伍，可制成抗hcv的药物组合物。所述药物以及药物组合物可用于hcv感染的临床治疗。所述化合物也可与已知药物组成复方制剂用于丙型肝炎的治疗。

本发明的目的之五在于，提供以式i所示化合物为活性成分的药物组合物。

本发明的药物组合物，包括雷斯吲哚甲，以及药学上可接受的载体。

其中，药学上可接受的载体以重量计是药物组合物总重量的0.1-99.9％。

其中，药学上可接受的载体包括甘露醇、山梨醇、山梨酸或钾盐、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素a、维生素c、维生素e、维生素d、氮酮、edta二钠、edta钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土温60-80、司班-80、蜂蜡、羊毛脂、液体石蜡、十六醇、没食子酸酯类、琼脂、三乙醇胺、碱性氨基酸、尿素、尿囊素、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微晶中一种或以上；优选所述的载体为微晶纤维素、乳糖、淀粉、羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、滑石粉中一种或以上。

本发明的药物组合物，可以制备成任何要用剂型。所述的制剂为片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、贴剂任意一种；优选所述的制剂为胶囊剂、颗粒剂或片剂。

本发明中的雷斯吲哚甲的抗丙型肝炎病毒(hcv)活性，与文献报道的具有抗hcv)活性的天然产物相当[jardim,a.c.etal.virol.j.2018,15,34.；nishikori,s.etal.j.nat.prod.2016,79,442-6；]或者更优[li,b.etal.bioorg.med.chem.2019,27,560-567.]。尽管其活性强度低于新上市的抗hcv药物索非布韦(sofosbuvir)，但后者价格昂贵，给致患者造成的严重的经济负担。雷斯吲哚甲为全新结构骨架结构的抗hcv化合物，可能具有新的作用机制，因此可用于耐药hcv感染的治疗。此外，雷斯吲哚甲为微生物发酵得到的天然产物，原料易得，因此可以作为抗hcv的先导化合物进行结构优化以开发活性更好的抗hcv药物。

附图说明：

图1：式i所示化合物的高分辨电喷雾质谱

图2：式i所示化合物的¹hnmr谱

图3：式i所示化合物的¹³cnmr谱

具体实施方式：

本发明实施方案适用于从任何微生物，而不限于从雷斯青霉菌发酵产物中制备raistrickindolea及其衍生物。以下所列实施例是为帮助本领域技术人员更好的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>真菌imb17-034(penicilliumraistrickii)的鉴定

a)菌株来源：真菌imb17-034(penicilliumraistrickii)由本实验室从三亚红树林采集的海泥样品(18°24′09.00″n，109°51′08.00″e)中分离获得。

b)菌株鉴定：根据its、18s区域dna序列在微生物种属中的保守性，对真菌imb17-034(penicilliumraistrickii)进行鉴定。提取真菌imb17-034(penicilliumraistrickii)的基因组，pcr扩增其its和18srrna基因并进行测序，提交到ncbigenbank数据库获得登陆号为mk027053和mk204575，其序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

seqidno.1

seqidno.2

表明，该菌属于曲霉科青霉菌属中的一种，据此将该菌命名为雷斯青霉菌(penicilliumraistrickii)imb17-034，并于2019年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17185。

<实施例2>真菌imb17-034(penicilliumraistrickii)的发酵

将菌种孢子液接种于pda培养基平板[配方为：葡萄糖2.0g，马铃薯浸出粉0.3g，琼脂粉18g，去离子水100ml]上，置于28℃恒温培养箱培养7-14天，用无菌铁铲取约1cm²的含菌琼脂块接种于100ml液体pdb发酵培养基[配方为：葡萄糖2.0g，马铃薯浸出粉0.3g，去离子水100ml]，在500ml三角瓶中，28℃，200r/min，摇瓶培养5d制作种子液。接着，将种子液按10％的接种量，转接于大米固体发酵培养基[配方为：大米100g，蛋白胨0.3g，人工海盐3.0g去离子水100ml]，共30瓶，28℃静置培养30天。

<实施例3>发酵产物的提取与浸膏的获得

收集菌株imb17-034固体发酵产物，加入等体积乙酸乙酯超声提取3次，每次60min，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯提取物。

<实施例4>式i所示化合物的分离、制备及结构鉴定

将乙酸乙酯部分提取物经c18反相闪式柱(55mm×400mm)色谱分离，依次用10％、30％、50％、70％、100％甲醇-水溶液梯度洗脱，得到5个洗脱馏分(f1-f5)。取50％甲醇洗脱的f3组分经toyopearlhw-40凝胶柱层析分离，用80％甲醇洗脱，得到16个馏分(f3-1-f3-16)。馏分e3-11经hplc色谱分离纯化(capcellmgii5μm，10mm×250mm,30％mecn,4ml/min)，收集hresims准分子离子峰m/z366.1444得到雷斯吲哚甲。

式ⅰ所示化合物：雷斯吲哚甲的结构鉴定

白色粉末状,易溶于甲醇、dmso。高分辨电子喷雾质谱(hresims)显示出准分子离子峰m/z366.1444[m+h]⁺(图1)，结合核磁共振波谱(nmr)数据，确定其分子式为c20h20o4n3，不饱和度为13。式i所示化合物的uv光谱在240、295nm处显示出最大吸收峰，揭示化合物中存在不饱和结构单元。化合物的ir光谱在3353、1677，1615cm^-1处分别显示出羟基、羰基和苯环的特征吸收峰。式i所示化合物的¹hnmr谱(cd3od，图2)在低场处分别显出示一组邻位二取代的芳香共轭体系质子信号δh6.71(d,h-7),7.15(ddd,h-8),6.75(ddd,h-9),7.05(dd,h-10)和一组单取代苯环质子信号δh7.07(2h,dd,h-20,24),7.00(2h,t,h-21,23),6.84(tt,h-22)，一个连氧次甲基质子δh5.27(s,h-4)。在高场区显示出两个氨基酸α-碳质子δh4.38(ddd,h-14)和4.32(td,h-17)和两组亚甲基信号δh2.13(dd,h-13a),1.22(dd,h-13b)；2.97(dd,h-18a),2.84(dd,h-18b)。此外，在dmso-d6中测定的¹hnmr可观察到3个活泼质子信号δh5.79(s,oh-12),8.03(s,nh-16)和6.64(d,nh-5)。式i所示化合物的¹³cnmr谱(图3)和hsqc谱显示出20个碳信号，包括2个羰基碳δc168.0(c-15)和163.4(c-1)，3个为sp²杂化季碳，1个连氧季碳δc76.0(c-12)，12个次甲基碳(其中9个为sp²杂化，2个含氮次甲基)和2个亚甲基碳信号。

¹h-¹hcosy谱证实式i所示化合物中存在1个单取代苯环、1个邻位二取代苯环和2个-chch2-等4个自旋偶合体系(图3)。hmbc谱中，观察到h-7与c-9,c-11相关，h-10与c-6,c-8,c-12相关，h-4与c-6,c-11,c-12相关，结合这些碳的化学位移，提示结构中存在一个吲哚单元。根据c-12(δc76.0)的化学位移，表明其为连氧碳，推测其可能连有游离羟基。在dmso-d6中测定的hmbc谱中，oh质子(δh5.79)与c-11，c-12，c-13，c-4均有相关峰，证明oh连接在c-12位。h-18a、h-18b均与c-1,c-17(δc56.5),c-19,c-20,c-24的hmbc相关峰提示结构中存在α-苯丙氨酸残基。此外，hmbc谱中还观察到苯丙氨酸中的α-质子h-17(δh4.32)以及另一个含氮次甲基质子h-14(δh4.38)均分别与c-1和c-15(δc168.0)相关，确定结构中含有一个二酮哌嗪环结构单元。h-13a、h-13b与c-11,c-12,c-14,c-15以及c-4的hmbc相关，确定二酮哌嗪单元的c-14经亚甲基c-13与吲哚环的c-12位相连。以上所有结构单元，包括1个苯环，1个吲哚环，1个二酮哌嗪环共构成了12个不饱和度。根据次甲碳c-4(δc101.3)的化学位移，推测其为氮杂缩醛碳。根据分子式含有13个不饱和度以及分子组成，提示c-4与n-2通过氧原子相连构成了噁嗪环，从而完成了式i所示化合物平面结构的确定。

式i所示化合物的相对构型通过解析其roesy谱和1dnoe谱得到确定。在roesy谱中，观察至oh-12/h-4，oh-12/h-14，h-4/h-13a,h-14/h-13a的相关峰，表明这些质子位于噁嗪环的同侧(图3)。此外，在roesy谱中观察到h-10与h-13b较强的相关信号，提示h-10与h-13b均位于噁嗪环平面的另外一侧。在1dnoe谱中，照射h-14时，h-4和h-17显示出增益，进一步证实h-4、h-14与h-17均位于环平面的同侧。式i所示化合物的绝对构型利用高级marfey’s反应确定。酸水解产物的l-fdla衍生物保留时间分别为：phe(m/z460,37.3min)；d-fdla衍生物保留时间分别为:phe(m/z460,48.4min),说明式i所示化合物中的苯丙氨酸残基为l构型。据此，式i所示化合物的绝对构型确定为4r,12s,14s,17s。式i所示化合物为新结构，命名为雷斯吲哚甲(raistrickindolea)。

雷斯吲哚甲(1)的理化数据白色粉末状,易溶于甲醇、dmso。[α]²⁰d+3.3(c0.12,meoh)；uv(meoh)λmax(logε)240(3.12),295(2.62)nm；ecd(c2.74×10^-3m)λmax(△ε)248(+1.21),301(+0.11)nm；irvmax3353,2920,1677,1615,1469,1452,and1070cm^-1；¹h-nmr(cd3od,600mhz)和¹³cnmr(cd3od,125mhz)数据见表1。hres-ms:m/z366.1444[m+h]⁺(c20h20o4n3理论值为366.1448)。

表1.雷斯吲哚甲(raistrickindolea)的¹h和¹³cnmr数据(cd3od)

<实施例5>雷斯吲哚甲(raistrickindolea)的抗丙型肝炎病毒(hcv)活性试验

1.实验材料

检定细胞株：huh7.5人体肝脏细胞

所需试剂：eagle’smedium(dmem,invitrogen,ca,usa)，胎牛血清，青链霉素；rneasyminikit，vx95。

2.实验方法

(1)阳性药及待测样品稀释如下：

hcv测定，将20mm的药物储备液用dmem稀释至100μm，然后再按三倍进行梯度稀释，最低浓度为0.04μm，共计八个浓度梯度，每个药物浓度下设置三个复孔。细胞毒性测定最高浓度为200μm，按五倍梯度稀释，最低浓度为0.00256μm，共计八个浓度梯度，每个药物浓度下设置三个复孔。

抗hcv活性检测方法：huh7.5细胞以3×10⁴个/cm²的密度接种到96孔板中。培养24h细胞贴壁后，用hcv病毒上清液以45iu/细胞的病毒感染量感染正常huh7.5细胞，同时加入相应药物或阳性药对照处理。培养72h后，吸弃培养上清，用rneasyminikit提取细胞总rna，细胞hcvrna水平用qrt-pcr法检测。用reed&muench法计算半数有效浓度(ec50)。

细胞毒性检测方法：huh7.5细胞以3×10⁴个/cm²密度种入96孔板培养。培养24h后，吸弃培养液，细胞用100μl不同浓度的药液及溶剂对照处理。处理72h后，每孔加入10μl浓度为5μg/ml的mtt溶液，轻轻摇匀后继续培养。4h后，吸弃培养液，每孔加100μldmso，震荡10分钟以充分溶解甲瓒结晶。然后以630nm为参考波长，测定570nm处的吸光值。计算半数细胞毒性浓度(cc50)。

3.实验结果

雷斯吲哚甲(raistrickindolea)的抗hcv病毒活性如表2所示。目前，从天然产物中发现的抗hcv活性化合物的ec50值多数均在微摩尔水平。尽管雷斯吲哚甲对hcv的抑制活性低于阳性药vx-950，但与来自penicilliumherquei青霉菌的peniciherquamidec活性[nishikori,etal.j.nat.prod.2016,79(2),442-446]相当，强于来源于海洋真菌trichodermaharzianum的harzianoicacida和b[li,b.etal.bioorg.med.chem.2019,27(3),560-567]。因雷斯吲哚甲来自微生物发酵天然产物，相较合成产物易得、环保、低污染，以及可能作用于新的靶标，因此具有开发为抗hcv药物的应用前景。

表2.雷斯吲哚(raistrickindolea)抗hcv病毒活性