东乡野生稻oru-miR5505在培育耐盐性植物上的应用的制作方法

本发明涉及植物生物工程和植物改良基因工程领域，具体涉及非编码rna(核糖核酸)在培育耐盐性植物上的应用。

背景技术：

水稻(oryzasatival.)是人类赖以生存的重要粮食作物，是世界上一半以上人口的主食。近年来，由于世界人口的增长、老龄化的加剧、城市化建设的加快，以及部分地区植被破坏导致环境恶化等问题的出现，使得如何在有限的环境资源条件下提高水稻的产量和品质、保证粮食安全成为关系国计民生的重大问题。东乡野生稻起源于江西省东乡县(北纬28°14’)，是迄今发现的中国乃至全球分布最北的普通野生稻，富含众多优异特性和丰富的抗逆基因，是提高水稻耐逆性的重要遗传资源。

植物microrna是大约22～24个核苷酸的非编码rna(non-codingrna)。microrna主要介导植物的非生物应激反应，通过调控其靶基因在植物发育中起着重要的作用。在拟南芥、土豆和水稻中过量表达mir408(microrna408的简写)可以提高植物辐射利用效率和二氧化碳固定的能力，从而增强植物的光合作用，加快植物生长速度，也提高了水稻种子的产量。通过定位编码铜/锌超氧化物歧化酶的基因，研究者发现mir398与拟南芥非生物胁迫反应有关。mir319已经证明靶向编码植物特异转录因子tcp基因，通过改变植物叶片的形状，并增加叶片腊质含量和保水性来增强植物的耐旱耐盐性。在水稻中，过量表达mir393导致水稻对干旱和盐胁迫的抵抗力降低。

目前，虽然在模式植物中已报道了一些microrna，但是在其他非模式植物中仍有大量的物种特异microrna没有被发现。植物microrna为改良植物的耐盐性提供了一条新思路。东乡野生稻具有强耐盐特性，然而调控东乡野生稻耐盐性的分子机制还很落后。针对东乡野生稻的耐盐性，对其开展相关microrna分子调控机制研究，不仅能丰富现有microrna领域的研究成果，而且对于更加深入全面地阐明microrna特征、功能和种间进化等科学问题具有重要意义，并为培育水稻抗盐新品种奠定理论基础和提供优质基因资源。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供东乡野生稻oru-mir5505的应用，以提高植物的耐盐性。本发明的目的之二在于提供东乡野生稻oru-mir5505的前体序列片段。本发明的目的之三在于提供东乡野生稻oru-mir5505的前体序列片段编码基因。本发明的目的之四在于提供一种载体，其包含东乡野生稻oru-mir5505的前体序列片段编码基因。本发明的目的之五在于提供一种提高植物的耐盐性的方法。

在本发明的第一方面，提供东乡野生稻oru-mir5505在提高植物耐盐性上的应用。所述的东乡野生稻oru-mir5505来源于稻属野生稻(oryzarufipogon)，其核苷酸序列为序列表中的序列1。

在一个优选例中，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。

在另一个优选例中，所述的单子叶植物具体为水稻。

在本发明的第二方面，提供东乡野生稻oru-mir5505的前体序列片段，其核苷酸序列为序列表中的序列2。

在本发明的第三方面，提供东乡野生稻oru-mir5505的前体序列片段编码基因，其核苷酸序列为序列表中的序列3。

在本发明的第四方面，提供一种载体，其包含东乡野生稻oru-mir5505的前体序列片段编码基因。

在一个优选例中，所述的载体为将所述东乡野生稻oru-mir5505的前体序列片段编码基因插入pcambia1300-35s载体的kpni和sali之间得到的重组载体。

在本发明的第五方面，提供一种提高植物的耐盐性的方法，包括如下步骤：

(1)从东乡野生稻中获取东乡野生稻oru-mir5505的前体序列片段编码基因；

(2)将东乡野生稻oru-mir5505的前体序列片段编码基因导入到载体中，得到重组载体；

(3)将重组载体导入目的植物中，目的植物的耐盐性得以提高。

在一个优选例中，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。

在另一个优选例中，所述的单子叶植物具体为水稻。

本发明的有益效果：本发明将东乡野生稻oru-mir5505应用于提高植物的耐盐性，有利于提高植物在盐胁迫环境下的存活率。本发明提供了东乡野生稻oru-mir5505的前体序列片段编码基因，并将其导入到载体中，得到的重组载体再导入目的植物中，能够有效地提高提高植物的耐盐性。

附图说明

图1为表达载体pcambia1300-35s空载体示意图。

图2为东乡野生稻oru-mir5505过量表达转基因水稻株系miroe2-6、miroe3-4的阳性检测琼脂糖凝胶电泳图。

图3为转基因水稻的oru-mir5505表达量鉴定图。

图4a为oru-mir5505过量表达转基因水稻表型对比图。

图4b为oru-mir5505过量表达转基因水稻表型统计图。

具体实施方式

下述实施方式中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明人在东乡野生稻中发现了oru-mir5505，并获得了oru-mir5505的前体序列片段编码基因，具体操作过程如下：

(1)植物基因dna的提取：

选取0.5g四叶期东乡野生稻水稻的幼苗为材料，放入研钵中，加入液氮研磨成粉末，装入2ml离心管；离心管中加入600μl抽提液ctab(0.012gctab、0.06ml1mtris-hcl(ph8.0)、0.024ml0.5medta(ph8.0)、0.049gnacl)，充分混合，65℃水浴加热30min；12000rpm离心10min，将上清液转入新的1.5ml离心管中；加入600μl的氯仿/异戊醇(24:1)，缓慢混匀，冰浴20-30min；12000rpm离心10min，取上清，加入700μl预冷的异丙醇，-20℃沉淀90min；12000rpm离心10min，倒掉液体，用75％乙醇洗涤沉淀两次，自然风干后加入100μlddh2o溶解，得到基因组dna。

(2)pcr扩增：

提取的基因组dna用作模板，按以下体系进行pcr反应：2μl模板dna、0.5μlq5高保真聚合酶、10μl5×q5反应缓冲液、4μldntps(10mmol/l)、0.7μl左端引物(10μm)、0.7μl右端引物(10μm)，加ddh2o至终体积为50μl。

左端引物：5’-acaggtacccagcacagtctcgtgcattt-3’(下划线序列为kpni位点)；

右端引物：5’-acagtcgacacatccattgtggggatcat-3’(下划线序列为sali位点)。

pcr程序为：95℃预变性30s后进入pcr循环，循环参数为95℃10s→65℃30s→72℃30s，38个循环后在72℃继续合成5min，10℃保存。

扩增得到的目的片段经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，得到大约481bp的条带，在紫外投射切胶台上将含有目的基因的胶块用干净的刀片切下，放入2ml离心管中，用北京索莱宝科技有限公司(solarbioscience&techonlogyco.,ltd.)生产的琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收产物。进行测序分析，测序结果显示该pcr片段的核苷酸序列为序列表中的序列3，该pcr产物为oru-mir5505前体序列片段编码基因，其编码的oru-mir5505前体序列片段的核苷酸序列为序列表中的序列2。oru-mir5505的前体序列片段剪切成熟体为oru-mir5505，其核苷酸序列为序列表中的序列1。

在获得oru-mir5505前体序列片段编码基因后，本发明人将其插入到pcambia1300-35s中，得到重组载体，具体操作过程如下：

(1)目的片段与t载体连接：

使用宝日医生物技术(北京)有限公司(takara公司)生产的pmd^tm18-tvectorcloningkit试剂盒回收产物，将回收所得dna与t载体按以下体系进行连接：2μldna、0.5μlt载体、2.5μlsolution、5μlddh2o，终体积为10μl，16℃4h或室温放置过夜。

(2)t载体连接产物的转化

a)配置相应1llb液体培养基(5g细菌用酵母提取物，10g细菌用胰蛋白胨，10gnacl，超纯水定容至1l)和1llb固体培养基(5g细菌用酵母提取物，10g细菌用胰蛋白胨，10gnacl，15g琼脂粉，超纯水定容至1l)若干。高温高压灭菌配置培养基，待培养基冷却至50℃时加入相应抗生素(1l培养基加入ampicillin100mg/ml1ml，1l培养基加入kanamycin50mg/ml1ml)，将固体培养基倒平板，两种培养基可置于4℃冰箱密封保存备用。

b)使用北京全式金生物技术有限公司(transgenbiotech公司)生产的trans5αchemicallycompetentcell试剂进行转化。转化前取感受态细胞(大肠杆菌，100μl/管)冰上化冻，然后将目的基因与t载体的连接产物加入其中，轻轻混匀，再放回冰上冷置30min；然后，迅速将离心管放入42℃的恒温水浴锅中热激90s，立即取出放回冰上5min；向离心管中加入600μl不含抗生素的lb培养基于37℃150rpm振荡培养1h(待菌液成浑浊状)；最后，在经紫外杀菌后的超净工作台上将已经转化的感受态细胞加到含有ampicillin抗生素的lb固体培养基上，用涂布器将其均匀涂开、晾干，倒置平板于37℃恒温培养箱培养过夜。

(3)重组质粒的筛选与检测(t载体)：

挑取单克隆，通过以下反应体系进行菌液pcr鉴定：2μl模板、0.5μl左端引物(10μm)、0.5μl右端引物(10μm)、1.5μl10×taqbuffer(含mg⁺)、0.2μltaq聚合酶、0.3μldntps(10mmol/l)、10μlddh2o，终体积为15μl。引物序列左端引物：5’-cagcacagtctcgtgcattt-3’，右端引物：5’-acatccattgtggggatcat-3’；通过1.5％琼脂糖凝胶电泳结果挑选阳性克隆的pcr产物送到上海生工生物工程公司(sangonbiotech公司)测序。

(4)目的片段与pcambia1300-35s载体连接：

a)质粒的回收：挑取成功构建的t载体阳性克隆，于5mllb液体培养基(含有ampicillin)中37℃摇床培养过夜后回收质粒，与水稻过表达载体pcambia1300-35s经kpni、sali双酶切再连接成复合载体。质粒回收采用美国genview公司(gen-viewscientificinc)生产的gv-plasmiddnaminiextractionkit试剂盒，步骤如下：多次移取菌液于2.0ml离心管中，12000rpm离心1min，收集菌体(尽可能清除上清以免影响质粒纯度)；弃上清，加入250ml溶液gs1并剧烈摇晃使菌体悬浮；加入250μl溶液gs2，温和摇晃4-6次直至管内溶液逐渐清澈，放置不能超过2min；加入350μl溶液gs3，颠倒混匀并放置2min；待液体变浑浊后，12000rpm离心10min；将200μl溶液bl加入吸附柱并放入收集管中，12000rpm离心30s，弃收集管中渗流液体；然后放入收集管中，放置2min，12000rpm离心1min(此时质粒dna吸附于吸附柱中)；加入500μl洗液w1于吸附柱，静置2min，12000rpm离心1min；加入500μl洗液w2于吸附柱中二次洗涤后12000rpm离心2min；将吸附柱放入1.5ml离心管，开盖10min自然风干后，加入50μl65℃水浴加热的ddh2o，12000rpm离心2min后，质粒即在离心管中。

b)酶切体系和酶连体系的构建：

参考takara公司的限制性内切酶说明书设计，酶切体系如下：5μl质粒dna、5μl10×nebuffer2.1、1μlkpni、1μlsali-hf、38μlddh2o，终体积为50μl，37℃恒温过夜。

参考纽英伦生物技术(北京)有限公司(biolabs公司)的t4dnaligase说明书设计，酶连体系如下：1μlt载体阳性质粒酶切产物、3μlpcambia1300-35s酶切载体片段、0.5μlt4dnaligase、1μl10×buffer、4.5μlddh2o，终体积为10μl，室温过夜。

(5)pcambia1300-35s-oru-mir5505过表达载体质粒转化：

同t载体质粒转化过程，将已经转化的pcambia1300-35s-oru-mir5505过表达载体质粒感受态细胞加到含有kanamycin抗生素的lb固体培养基上，用涂布器将其均匀涂开、晾干，倒置平板于37℃恒温培养箱培养过夜。

此后，本发明人将重组载体导入目的植物(水稻品种“中花11”)中，获得转基因水稻，具体操作过程如下：

将上述pcambia1300-35s-oru-mir5505质粒转化农杆菌eha105。经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性克隆的过量表达工程菌，提取阳性克隆的过量表达工程菌的质粒，为pcambia1300-35s-oru-mir5505，将该阳性克隆的过量表达工程菌命名为eha105/pcambia1300-35s-oru-mir5505。

将eha105/pcambia1300-35s-oru-mir5505侵染水稻品种“中花11”(oryzasatival.cvzhonghua11，以下简称为野生型水稻)的愈伤组织，再将导入eha105/pcambia1300-35s-oru-mir5505的愈伤组织用含300mg/l头孢霉素的无菌水洗涤5遍，无菌滤纸吸干后转至n6d2s1培养基上，筛选一代；两周后，转移至n6d2s2培养基上筛选二代(2周/代)；取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基(1)，上，在培养箱(12小时光周期，白天28℃，夜晚25℃)中培养7天；然后转移至分化培养基(2)上，在培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，获得t0代oru-mir5505转基因水稻株系。

所用培养基如下表1：

表1所用培养基配方

为了验证获得的转基因水稻中oru-mir5505已成功过量表达，本发明人执行了以下操作过程：

(1)阳性克隆检测：

从上述获得的t0代oru-mir5505转基因水稻中提取总dna，使用潮霉素(hyg)扩增引物(引物序列左端引物：5’-cgagagcctgacctattgcat-3’，右端引物：5’-ctgctccatacaagccaaccac-3’)，按以下体系进行pcr反应：2μl模板dna、0.2μltaqdna聚合酶、1.5μl10×buffer(含mg²⁺)、0.3μldntps(10mmol/l)、1μl左端引物(10μm)、1μl右端引物(10μm)，加ddh2o至终体积为20μl。扩增得到的目的片段经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，从图2中可以看出，miroe1-1和miroe4-3的oru-mir1861h转基因水稻中得到大约481bp的条带。将阳性t0代oru-mir1861h转基因水稻移至温室栽培，按照不同株系收种，得到t1代转基因种子，在此基础上经过繁种得到纯合t2代种子，在以后的实验中选取编号为miroe1-1、miroe4-3的t2代oru-mir1861h转基因水稻作为材料。

(2)荧光定量pcr鉴定：

从编号为miroe1-1、miroe4-3的t2代oru-mir5505转基因水稻的幼苗中提取总rna，利用primer6.0程序(premierbiosoftinternational)设计基因茎环引物，引物序列：5’-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactagcgat-3’，并以u6引物为内标参照，引物序列：5’-atttggaccatttctcgatttgt-3’，使用mirnafirststrandcdnasymthesis(stem-loopmethod)(sangonbiotech公司)混合好体系，进行16℃30min，37℃30min，85℃5min反应，反转录成cdna。

将反转录产物稀释10倍，取2μl做模板，利用primer6.0程序(premierbiosoftinternational)设计基因引物，引物序列，左端引物：5’-gaggattcggtattgatcgct-3’，右端引物：5’-gtgcagggtccgaggtatt-3’。用u6引物作为内参，u6引物序列，左端引物：5’-cgataaaattggaacgatacaga-3’，右端引物：5’-atttggaccatttctcgatttgt-3’。利用tbgreen^tmpremixextaq^tmii(tlirnasehplus)试剂盒(takara公司)进行反应溶液的配置，在实时定量pcr仪stepone^tm上运行pcr程序，95℃30s；95℃5s，60℃30s；共40循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。根据ct值计算基因的相对表达量。

结果如图3所示，与野生型水稻(zhonghua11)相比，miroe1-1和miroe4-3的t2代转基因水稻幼苗中oru-mir5505的表达水平均有不同程度的升高，说明目的基因(oru-mir5505)已经过量表达。

采用同样的方法将空载体pcambia1300-35s转入野生型水稻中，得到t0代转空载体水稻，按照上述方法鉴定，oru-mir5505基因没有过量表达，将t0代转空载体水稻播种传代得到t2代转空载体水稻。

为了验证获得的转基因水稻的耐盐性，本发明人执行了以下操作过程：

将编号为miroe1-1和miroe4-3的t2代oru-mir5505转基因水稻种子和野生型水稻(zhonghua11，wt)种子，均浸润在纯水里，培养箱内32℃萌发后，播种于木村b培养液中，放置光照培养箱(光强为10000μmol/m²/s，光照时间为16h/d，温度为30℃)培养至4叶期；再将4叶期幼苗转至含有0.008g/mlnacl的木村b培养液里处理5天，然后转至正常木村b培养液，于光照培养箱内恢复培养7天，照相、统计存活率。每个株系20株，实验重复三次。

耐盐性处理结果如图4a所示(图片从左到右的株系分别为wt、miroe1-1、miroe4-3)，nacl处理前，t2代oru-mir5505转基因水稻和野生型水稻(zhonghua11，wt)无显著差异；nacl处理恢复后，与野生型水稻(zhonghua11，wt)相比，t2代oru-mir5505转基因水稻的耐盐性显著性提高。

耐盐性处理存活率统计结果如图4b所示：野生型水稻中花11(wt)和oru-mir5505的转基因t2代水稻株系(miroe1-1、miroe4-3)的三次存活率分别为20％、40.91％、75％；13.33％、69.23％、75％；25％、66.67％、66.67％。

可以看出，在盐胁迫下，野生型水稻中花11(wt)和oru-mir5505转基因水稻存活率都会降低，但oru-mir5505转基因水稻存活率较野生型显著性提高，说明oru-mir5505转基因水稻具有更强的耐盐性，oru-mir5505能帮助植物提高植物耐盐性。

上述木村b培养液组成如下：

a液母液：1l(200×)

b液母液：1l(200×)

ca(no3)2·4h2o17.235g

edta-fe母液：1l(1000×)

溶解5.57gfeso4·7h2o于200ml蒸馏水中，溶解7.45gna2edta于200ml蒸馏水中，加热na2edta溶液，加入feso4·7h2o溶液，不断搅拌，冷却后定容至1l。

微量元素母液：1l(1000×)

硅酸钠：每l木村b培养液用量100-300mg

1mol/lhcl：8.17ml37％hcl用蒸馏水稀释至1000ml

用1mol/lhcl调木村b培养液ph值为5.8。

实际应用中，取5mla液母液、5mlb液母液、1mledta-fe母液、1ml微量元素母液、100-300mg硅酸钠混合，加蒸馏水稀释至1l，用1mol/lhcl调ph值为5.8，得到il木村b培养液。

以上具体实施方式表明，将oru-mir5505的前体序列片段编码基因导入水稻中，得到oru-mir5505的过量表达植株；该植株与未转入该基因的水稻相比具有更强的耐盐性，说明oru-mir5505能帮助植物提高耐盐性。

序列表

<110>江西师范大学

<120>东乡野生稻oru-mir5505在培育耐盐性植物上的应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>东乡野生稻(oryzarufipogon)

<400>1

gaggauucgguauugaucgcua22

<210>2

<211>973

<212>rna

<213>东乡野生稻(oryzarufipogon)

<400>2

cagcacagucucgugcauuuagaaguucaacgacuacaccuuggcagcagaaggccuuca60

cuaaguuucuuggacuucaauaccgacgcaagggagccaagaauggagcagcugaugcuu120

ugucccgacgcagccauagagucgaucuugcagauaggcggagguaugauugcuugcucc180

uugcaugugaaggugggaaacaaggaaacagcagaaaugcuuacugggacauagccuucg240

guacgaguugaagggaagaggauugcuuggaaccucuaagacauggcaccccugccccuu300

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<211>973

<212>dna

<213>东乡野生稻(oryzarufipogon)

<400>3

cagcacagtctcgtgcatttagaagttcaacgactacaccttggcagcagaaggccttca60

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