用于快速检测高血压治疗与预后相关的SNP位点的试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学检测领域和心脑血管疾病领域，具体地，涉及一种用于快速检测高血压治疗与预后相关的snp位点的试剂盒。

背景技术：

2014年估计全国有心血管病患者2.9亿，其中高血压患者2.7亿，卒中患者至少700万，心肌梗死患者250万。通过对于心血管疾病并发症的发生和发展机制研究，发现遗传因素具有重要的作用。对易发的、流行的和临床的不同症状病例分析发现，单核苷酸多态性(snps)与疾病的发生与发展具有紧密关联性，尤其是非同义snp(nssnp)。

nejatizadeh等(2008)通过病例对照研究发现血管紧张素原基因agt的启动子和基因编码区中存在的一个普通的snp(g-6a，rs5051)和两个nssnps(t174m，rs4762；m235t，rs699)与高血压关联，这些多态性的存在导致了基因的转录水平和蛋白功能的改变，破环了肾素-血管紧张素系统，进而造成血管内皮的功能紊乱。verweij等(2013)发现在血浆血管舒缓素释放酶基因klkb1和凝血因子xii的基因f12中的snp(c/t和t/c)会导致血浆中前肾上腺髓质素中段肽(mr-pro-adm)和c-末端内皮素-1(ct-pro-et-1)水平升高，揭示了血浆中的血管舒缓素成为新的药物靶点的潜在性。mcdonough等(2013)比较分析了维拉帕米缓释剂(钙离子通道阻滞剂)和群多普利(β受体阻滞剂)对不同高血压个体进行治疗后心血管预后关联的功能基因分型，发现在唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素12基因siglec12存在一个nssnp，导致第29位置氨基酸变异为终止密码子，它与心血管预后具有关联性。在采用维拉帕米缓释剂和群多普利治疗时，那些终止密码子携带者出现相同的全因死亡、非致死性心肌梗塞和非致死性中风的风险。然而，那些gln/gln(g/g)基因型的患者采用维拉帕米缓释剂治疗时，出现的全因死亡、非致死性心肌梗塞和非致死性中风的风险显著高于采用群多普利治疗的患者。

这些nssnps的发现为诊断高血压患者的基因分型，使他们能够避免钙通道阻滞剂和β受体阻滞剂治疗所带来副作用的心血管预后，提供了理论基础，对于高血压个性化治疗选择具有重要的意义。因此，为满足临床的高通量、高精度、低成本的需求，建立合适的高血压患者基因分型技术，对我国高血压患者的个性化诊疗非常迫切。

技术实现要素：

针对于现有技术上存在的上述问题，本发明根据现有与高血压疾病和抗高血压治疗心血管预后关联nssnps数据信息，利用multi-realtime-as-pcr技术(多靶标实时定量等位基因特异性pcr)，目的是建立一种用于快速检测高血压治疗与预后相关基因snp位点的试剂盒，为我国高血压的个体化治疗药物选择和降低治疗造成的心血管预后风险提供保障。

本发明的第一方面是提供一种用于快速检测高血压治疗与预后相关的snp位点的试剂盒，该试剂盒包括分别用于检测klkb1/f12/siglec12/agt基因所对应的4个snp多态性位点的四对引物：

(1)第一引物对，用于检测klkb1基因rs4253238位点，包括：

上游引物：5′-ttctgtgctgcaaccaggtatc-3′(seqidno：3)；

下游引物：5′-atccatgcacgaaaataacttc-3′(seqidno：4)；

(2)第二引物对，用于检测f12基因rs2731672位点，包括：

上游引物：5′-ggctcatttgttaggaatgcta-3′(seqidno：5)；

下游引物：5′-acagagccagactctatctcaa-3′(seqidno：6)；

(3)第三引物对，用于检测siglec12基因rs16982743位点，包括：

上游引物：5′-gaggattaccagctgaagactc-3′(seqidno：7)；

下游引物：5′-gagcatcccggtctgtatgg-3′(seqidno：8)；

(4)第四引物对，用于检测agt基因rs2004776位点，包括：

上游引物：5′-accacaggagcatgagatg-3′(seqidno：9)；

下游引物：5′-tgaggcagagactgtcgtttgt-3′(seqidno：10)。

根据本发明，优选地，所述第一引物对、所述第二引物对、所述第三引物对和所述第四引物对的摩尔比为20-22：1-1.5：1-1.5：1。

根据本发明，进一步地，该试剂盒包括：阳性标准质粒kfsa-native；所述阳性标准质粒kfsa-native用于同时检测snp位点rs4253238/rs2731672/rs16982743/rs2004776，其中包含的snp位点rs4253238/rs2731672/rs16982743/rs2004776所对应的klkb1/f12/siglec12/agt基因片段序列如seqidno：1所示。

优选地，所述阳性标准质粒kfsa-native的载体为puc57载体质粒，seqidno：1所示序列采用全基因合成后克隆入puc57载体质粒，形成阳性标准质粒kfsa-native。

根据本发明，进一步地，该试剂盒包括：等位标准质粒kfsa-allele，所述等位标准质粒kfsa-allele用于同时检测snp位点rs4253238/rs2731672/rs16982743/rs2004776的变异，其中包含的snp位点rs4253238/rs2731672/rs16982743/rs2004776变异所对应的klkb1/f12/siglec12/agt基因片段序列如seqidno：2所示。

优选地，所述等位标准质粒kfsa-allele的载体为puc57载体质粒，seqidno：2所示序列采用全基因合成后克隆入puc57载体质粒，形成等位标准质粒kfsa-allele。

根据本发明，所述试剂盒还可以包括以下扩增试剂中的至少一种：荧光pcr扩增反应缓冲液、荧光染料和超纯水，例如，2×qpcrsybrgreenmastermix，50×roxreferencedye1。各组分的用量可根据需要确定，本发明对此没有特别限定。

采用上述快速检测试剂盒应用于一种高血压治疗与预后相关基因snp位点多态性快速检测方法，包括以下步骤：

(1)采集血液样品并提取其基因组dna；

(2)采用上述klkb1/f12/siglec12/agt基因多态位点的引物混合物，以实时荧光定量pcr法对基因组dna进行目的片段扩增；

(3)依据熔解曲线对snp位点的结果进行分析。

进一步地，步骤(2)中pcr扩增体系可以为：2×qpcrsybrgreenmastermix10μl、50×roxreferencedye10.4μl、引物混合物2-4μl、dna模板0.5-10ng，用ddh2o补足体积至20μl。

进一步地，步骤(2)中pcr扩增反应条件可以为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60.5℃退火20s，72℃延伸32s，进行30个循环；95℃10s，65℃1min，95℃15s，采集熔解曲线。

结果判定：根据熔解曲线，在相应位置出现峰型特征的判定为native状态，否则判定为mutant状态。

本发明的有益效果：本发明的试剂盒基于nssnp基因分型的multi-as-pcr引物设计，通过实时荧光定量pcr扩增，根据熔解曲线特征峰进行高血压治疗与预后风险基因snp分型，能够为高血压病人个性化诊疗提供依据。本发明的试剂盒具有操作简单、费用低、耗时短和结果可靠等特点，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明试剂盒中klkb1基因rs4253238位点的引物、f12基因rs2731672位点的引物、siglec12基因rs16982743位点的引物和agt基因rs2004776位点的引物在以阳性标准质粒kfsa-native为dna模板进行pcr扩增后，得到的pcr产物的2.5％琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为本发明试剂盒中klkb1基因rs4253238位点的引物、f12基因rs2731672位点的引物、siglec12基因rs16982743位点的引物和agt基因rs2004776位点的引物在以等位标准质粒kfsa-allele为dna模板进行pcr扩增后，得到的pcr产物的2.5％琼脂糖凝胶电泳结果。

图3为以阳性标准质粒kfsa-native为模板，采用本发明的试剂盒进行实时荧光定量pcr扩增得到的熔解曲线结果。

图4为以高血压患者血液dna为模板，采用本发明的试剂盒进行实时荧光定量pcr扩增得到的熔解曲线结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明不限于以下实施例。

以下实施例中，

(1)第一引物对(或称klkb1基因rs4253238位点的引物)，用于检测klkb1基因rs4253238位点，包括：

上游引物：5′-ttctgtgctgcaaccaggtatc-3′(seqidno：3)；

下游引物：5′-atccatgcacgaaaataacttc-3′(seqidno：4)；

(2)第二引物对(或称f12基因rs2731672位点的引物)，用于检测f12基因rs2731672位点，包括：

上游引物：5′-ggctcatttgttaggaatgcta-3′(seqidno：5)；

下游引物：5′-acagagccagactctatctcaa-3′(seqidno：6)；

(3)第三引物对(或称siglec12基因rs16982743位点的引物)，用于检测siglec12基因rs16982743位点，包括：

上游引物：5′-gaggattaccagctgaagactc-3′(seqidno：7)；

下游引物：5′-gagcatcccggtctgtatgg-3′(seqidno：8)；

(4)第四引物对(或称agt基因rs2004776位点的引物)，用于检测agt基因rs2004776位点，包括：

上游引物：5′-accacaggagcatgagatg-3′(seqidno：9)；

下游引物：5′-tgaggcagagactgtcgtttgt-3′(seqidno：10)。

所述阳性标准质粒kfsa-native含有seqidno：1所示序列，seqidno：1所示序列采用全基因合成后克隆入puc57载体质粒，形成阳性标准质粒kfsa-native。

所述等位标准质粒kfsa-allele含有seqidno：2所示序列，seqidno：2所示序列采用全基因合成后克隆入puc57载体质粒，形成等位标准质粒kfsa-allele。

实施例1-设计引物的工作效果检测和假阳性的排除

1、采用质粒小抽试剂盒，制备含有seqidno：1所示序列的阳性标准质粒kfsa-native和含有seqidno：2所示序列的等位标准质粒kfsa-allele，使用超微量蛋白核酸分析仪检测其浓度以及纯度，记录原始数据，将浓度和纯度都达到要求的dna置于-20℃冰箱保存备用。

2、采用常规pcr方法分别检测设计的klkb1基因rs4253238位点的引物、f12基因rs2731672位点的引物、siglec12基因rs16982743位点的引物和agt基因rs2004776位点的引物工作效率。反应体系为：

反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，60.5℃退火20s，72℃延伸32s，共20个循环；72℃再延伸7min；4℃处理1min；完成反应。反应完成后，采用2.5％琼脂糖凝胶电泳，获得电泳图片1和图片2。

结果分析：

图1显示在添加设计的klkb1基因rs4253238位点的引物、f12基因rs2731672位点的引物、siglec12基因rs16982743位点的引物和agt基因rs2004776位点的引物，在以阳性标准质粒kfsa-native作为dna模板时，在20cycle的反应循环后，获得扩增产物且达到可视化检测水平；在反应体系中没有添加引物，其他组成分不变时(空白组)，反应没有产生可以检测的扩增产物；结果表明引物工作效果良好。

图2显示在添加设计的klkb1基因rs4253238位点的引物、f12基因rs2731672位点的引物、siglec12基因rs16982743位点的引物和agt基因rs2004776位点的引物，在以等位标准质粒kfsa-allele作为dna模板时，在20cycle的反应循环后，反应没有产生可以检测的扩增产物；在反应体系中没有添加引物，其他组成分不变时(空白组)，反应同样没有产生可以检测的扩增产物；结果可以排除采用引物在以等位标准质粒kfsa-allele作为dna模板时获得结果的假阳性。

实施例2-本发明试剂盒标准反应体系和条件，以及结果判定依据的建立

1、阳性标准质粒kfsa-native的制备

采用质粒小抽试剂盒，操作过程按试剂盒说明书进行操作，制备含有seqidno：1序列的阳性标准质粒kfsa-native，使用超微量蛋白核酸分析仪检测其浓度以及纯度，记录原始数据，将浓度和纯度都达到要求的dna置于-20℃冰箱保存备用。

2、目的基因的实时定量pcr扩增

用klkb1基因rs4253238位点的引物、f12基因rs2731672位点的引物、siglec12基因rs16982743位点的引物和agt基因rs2004776位点的引物按摩尔比20-22：1-1.5：1-1.5：1混合，得到引物混合物，进行实时定量pcr扩增。

pcr扩增体系为：2×qpcrsybrgreenmastermix10μl、50×roxreferencedye10.4μl、引物混合物2.4μl、dna模板(阳性标准质粒kfsa-native)1μl，用ddh2o补足体积至20μl。

pcr扩增反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60.5℃退火20s，72℃延伸32s，进行30个循环；95℃10s，65℃1min，95℃15s，采集熔解曲线。结果如图3所示。

结果分析：

图3的熔解曲线为阳性标准质粒kfsa-native中的klkb1、f12、siglec12、agt基因的扩增情况，klkb1基因的rs4253238位点熔解曲线对应的特征峰tm为75.48℃，f12基因的rs2731672位点熔解曲线对应的特征峰tm为80.32℃，siglec12基因的rs16982743位点熔解曲线对应的特征峰tm为83.65℃，agt基因的rs2004776位点熔解曲线对应的特征峰tm为87.71℃。本例阳性kfsa-native质粒中同时检测出klkb1、f12、siglec12、agt基因的4个特征峰，表明kfsa-native质粒在klkb1基因的rs4253238位点、f12基因的rs2731672位点、siglec12基因的rs16982743位点、agt基因的rs2004776位点上均没有nssnp的突变。

实施例3-利用本发明试剂盒对高血压患者进行snp位点分析

1、样品的采集及其全基因组dna的提取

用edta抗凝管随机采集高血压患者的外周血3ml，采用vazyme公司的fastpureblooddnaisolationminikit提取受检者全基因组dna，操作过程按试剂盒说明书进行操作，获得的全基因组dna使用超微量蛋白核酸分析仪检测其浓度以及纯度，记录原始数据，将浓度和纯度都达到要求的dna置于-20℃冰箱保存备用。

2、目的基因的实时定量pcr扩增

用klkb1基因rs4253238位点的引物、f12基因rs2731672位点的引物、siglec12基因rs16982743位点的引物和agt基因rs2004776位点的引物按摩尔比20-22：1-1.5：1-1.5：1混合，得到引物混合物，进行实时定量pcr扩增。

pcr扩增体系为：2×qpcrsybrgreenmastermix10μl、50×roxreferencedye10.4μl、引物混合物2.4μl、dna模板(受检者全基因组dna)1μl，用ddh2o补足体积至20μl。

pcr扩增反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60.5℃退火20s，72℃延伸32s，进行30个循环；95℃10s，65℃1min，95℃15s，采集熔解曲线。结果如图4所示。

结果分析：

图4的熔解曲线为高血压患者klkb1、f12、siglec12、agt基因的扩增情况，klkb1基因的rs4253238位点熔解曲线对应的特征峰tm为76.37℃，f12基因的rs2731672位点熔解曲线对应的特征峰tm为81.32℃，依据实施例2中所建立的判定依据，可以确认此高血压患者klkb1基因的rs4253238位点、f12基因的rs2731672位点没有nssnp的突变；在siglec12基因的rs16982743位点、agt基因的rs2004776位点上可能存在突变。

上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的实施例。在不偏离所说明的实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110>江苏医药职业学院

<120>用于快速检测高血压治疗与预后相关的snp位点的试剂盒

<130>1900312

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1271

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

ttctgtgctgcaaccaggtggcataacctctcacctgattccttagctctagtgaagtta60

ttttcgtgcatggatggctcatttgttaggaatgtgacaacctccatggaaagagaaggc120

ctctagctttataattccagcaaaaatcctggggctgcctctcactggttcgatgtgggt180

taggtgttctttttttttttcttttgagatagagtctggctctgttccatatgtgcttcc240

ccagaccgcccaggtttgctgaatgtgaagcccattgaagacattcaagacaacctgcta300

caagccctggagctccagctgaagctgaaccaccctgagtcctcacagctgtttgccaag360

ctgctccagaaaatgacagacctcagacagattgtctggaagtctggagtctccaggtgg420

gcctggcacgtcagcgtcacattggccaagggtttcagcagtgattcggactctgcccac480

aggctgggctgcgtctcataaactgcaaggggtggctgggatcagctcagtgccacagag540

acagggctcccccccggcctgggcccaccattcccagacctcacccctgcactcacatat600

ggctgcttctgtcactgggccccaggtgacacctgcggagacagccgaggattaccagct660

gaagatgcagaagtccgtgacggtgcaggagggcctgtgtgtctctgtgctttgctcctt720

ttcctacccccaaaatggctggaatgactccgatccagttcatggctactggttctgggc780

agggtcccatacagaccgggatgctccagtggccacaaacaacccagcccagctgctgct840

gtccacggtggtgggcgtgttcacagccccaggcctgcacctgaagcagccgtttgtgca900

gggcctggctctctatacccctgtggtcctcccacgctctctggacttcacagaactgga960

tgttgctgctgagaagattgacaggttcatgcaggctgtgacaggatggaagactggcac1020

cacaggagcatgagccgtcatcttcacctttagcattcagcccgggagaagtagggagac1080

atagaaggggcaggtgctggccaagaggcaggggcaggagaggagaaggcggaggggcac1140

tcagggcgagggtgtcaggcccgccaccccagagcaccattactcccaggacgcggctgc1200

gtgcagacctggaaccagcctagggagcagccgcagatcacaactgagaacaaacgacag1260

tctctgcctca1271

<210>2

<211>1271

<212>dna

<213>homosapiens

<400>2

ttctgtgctgcaaccaggtggtataacctctcacctgattccttagctctagtgaagtta60

ttttcgtgcatggatggctcatttgttaggaatgtggcaacctccatggaaagagaaggc120

ctctagctttataattccagcaaaaatcctggggctgcctctcactggttcgatgtgggt180

taggtgttctttttttttttcttttgagatagagtctggctctgttccatatgtgcttcc240

ccagactgcccaggtttgctgaatgtgaagcccattgaagacattcaagacaacctgcta300

caagccctggagctccagctgaagctgaaccaccctgagtcctcacagctgtttgccaag360

ctgctccagaaaatgacagacctcagacagattgtctggaagtctggagtctccaggcgg420

gcctggcacgtcagcgtcacattggccaagggtttcagcagtgattcggactctgcccac480

aggctgggctgcgtctcataaactgcaaggggtggctgggatcagctcagtgccacagag540

acagggctcccccccggcctgggcccaccattcccagacctcacccctgcactcacatat600

ggctgcttctgtcactgggccccaggtgacacctgcggagacagccgaggattaccagct660

gaagatgtagaagtccgtgacggtgcaggagggcctgtgtgtctctgtgctttgctcctt720

ttcctacccccaaaatggctggaatgactccgatccagttcatggctactggttctgggc780

agggtcccatacagaccgggatgctccagtggccacaaacaacccagcccagctgctgct840

gtccatggtggtgggcgtgttcacagccccaggcctgcacctgaagcagccgtttgtgca900

gggcctggctctctatacccctgtggtcctcccacgctctctggacttcacagaactgga960

tgttgctgctgagaagattgacaggttcatgcaggctgtgacaggatggaagactggcac1020

cacaggagcatgagccatcatcttcacctttagcattcagcccgggagaagtagggagac1080

atagaaggggcaggtgctggccaagaggcaggggcaggagaggagaaggcggaggggcac1140

tcagggcgagggtgtcaggcccgccaccccagagcaccattactcccaggacgcggctgc1200

gtgcagacctggaaccagcctagggagcagccgcagatcacaactgagaacaaacgacag1260

tctctgcctca1271

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ttctgtgctgcaaccaggtatc22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

atccatgcacgaaaataacttc22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggctcatttgttaggaatgcta22

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

acagagccagactctatctcaa22

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gaggattaccagctgaagactc22

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gagcatcccggtctgtatgg20

<210>9

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

accacaggagcatgagatg19

<210>10

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

tgaggcagagactgtcgtttgt22