小报春花香相关基因PfLIS/NES及其用途的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种调控植物花香的基因及其用途。

背景技术：

植物花香在香精香料工业方面具有重要经济价值，也是观赏植物的重要特征之一，它可以刺激人类的嗅觉细胞产生愉悦感，提高植物观赏价值。例如在对香豌豆切花的调查中发现，花香比花色和花型更能影响消费者的决定。近年来，花香研究已经成为了一个热门研究领域，研究内容除香气成分检测与分析、释放节律分析和花香基因克隆外，通过研究植物挥发性化合物对一些心理或生理疾病治疗效果的芳香疗法也在进行中。

植物花香的主要成分是分子量低且易挥发的各种化合物，其中以萜类和苯基/苯丙烷类为主，并少量伴有脂肪酸衍生物和一些其它(尤其是含氮或硫)化合物等。大多数植物的花香化合物种类在20到60种之间，不同物种间的花香组成在挥发成分的数量、特性和相对含量上差异很大。

植物通过mva途径和mep途径生成了萜烯类化合物的底物ipp和dmapp，其中，1分子ipp和1分子dmapp经gpps催化，缩合生成了gpp，gpp能在各类单萜合酶的作用下形成相应的单萜物质，也能通过g10h进入裂环烯醚萜生物合成途径，生成挥发性的生物碱；2分子ipp和1分子dmapp在fpps的催化下形成的fpp是大多数倍半萜和三萜的前体物质；3分子ipp和1分子dampp经ggpps催化生成ggpp，这是二萜和四萜类化合物的前体物质。在萜烯类化合物合成途径中，上游的hmgr、dxs和dxr与下游的各类单萜合酶都是控制花香物质生成的重要基因。

1994年pichersky等从仙女扇(clarkiabreweri)中克隆到第一个花香基因——芳樟醇合成酶，此后，越来越多的花香基因相继被克隆出来。利用基因工程技术改良植物花香，调控花香物质生物合成成为研究热点。但由于花香调控的复杂性，大多数试验并未能取得预期的效果。如lücker等将lis转入矮牵牛中后并未在转基因植株中检测到芳樟醇，而是发现大量非挥发性的衍生物；orlova等将bpbt转入矮牵牛，发现转基因植物形态出现了预期之外的较大变化。前者是因为转基因植物中的挥发性化合物被修饰成了不挥发的物质，而后者是由于部分代谢通量的改变而影响了植物的发育情况。此外，如果细胞中没有足够的可供催化的底物，也很难产生相应的挥发性物质，即使有，也难以被人类的嗅觉器官感知。

2000年，北京林业大学与昆明黑龙潭公园合作开展小报春的引种驯化研究，并将驯化成功的小报春作为观赏花卉应用于公园绿化，此后，国内一些学者对小报春基本生物学特性和栽培育种等方面进行了相关研究。在花香研究方面，jia利用动态顶空采集技术与气相色谱-质谱联用(gc-ms)技术对小报春初花期、盛花期及末花期的花香挥发物进行收集和分析，并运用归一化法对测试结果进行了初步定量，试验共检测到小报春的花香成分69种，包含萜烯类化合物10种，苯基/苯丙烷类芳香族化合物21种，脂肪酸衍生物38种，其中芳樟醇、水杨酸甲酯、α-松油醇相对含量较大，推测其可能是小报春花香的关键成分；此外，研究还发现在小报春开放过程中，萜烯类化合物的相对含量呈低-高-低的变化趋势；苯基/苯丙烷类化合物的相对含量呈逐渐升高的趋势；脂肪酸衍生物中脂类在初花期含量达最大值，而醇类化合物的相对含量呈高-低-高的趋势变化。

lis/nes可以同时编码芳樟醇/橙花叔醇合成酶基因，控制芳樟醇和橙花叔醇的生成。人们普遍认为，单萜类化合物的生物合成发生在质体中，以gpp为底物通过mep途径合成，而倍半萜以fpp为底物通过mva途径在细胞质中合成(aharonietal.，2005)。gpp和fpp作为单萜和倍半萜生物合成的前体物质分别存在于质体和细胞质中，导致双功能单萜和倍半萜合成酶缺乏底物而不能发挥其功能。值得一提的是最近研究表明萜类合成的两条途径并不是孤立存在的，而是在细胞质和质体之间存在着某种交互使用机制(岳跃冲，2011)。lücker等在拟南芥、烟草和马铃薯的代谢工程研究中发现，其细胞质中少量的fpp存在，质体中也有少量的gpp的存在(lückeretal，2007；吴等，2006)，虽然存在的量很少，但为单萜、倍半萜双功能酶发挥其活性提供了可能。草莓fanes1在拟南芥和马铃薯质体的过度表达形成了少量的橙花叔醇，比芳樟醇产生量低100到300倍(aharonietal.，2003)。来自金鱼草的amnes/lis-1基因定位在质体中，能同时合成橙花叔醇和芳樟醇(nagegowdaetal，2008)。贺志荣(2013)从茶树中克隆得到gslis/nes基因，并且在大肠杆菌中表达，以gpp为底物的反应中，能检测到大量的芳樟醇和少量的萜稀和罗勒稀产生。然而在含底物fpp的反应中，只能检测到大量的橙花叔醇产生，没有其它的倍半萜产生。将该基因转入到烟草中，株转基因植株的叶片能够释放大量的芳樟醇。

从以上研究可以看出迄今为止，关于小报春分子方面的研究还是一片空白。纵观整个报春花属，在高通量测序技术方面的研究也比较薄弱，因此，利用最新一代高通量测序技术对小报春进行转录组测序不仅可以丰富报春花属的分子信息，也可为后续的研究提供优质可靠的基因资源。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供一种小报春花香相关基因pflis/nes及其用途。

首先，本发明提供小报春pflis/nes蛋白，其为：

1)由seqidno.2所示的氨基酸组成的蛋白质，或

2)在seqidno.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明成功的克隆了小报春芳樟醇/橙花叔醇合酶基因(pflis/nes)的全长序列，该序列包含一个长为1638的完整开放阅读框，并且具有萜类物质特有的天冬氨酸富集区保守序列。随后对该基因全长进行了生物信息学分析，预测分子量62.9kda，预测等电位为5.60，属于不稳定蛋白。另外分析表明，该蛋白疏水性较强，没有明显的信号肽和跨膜结构。对其二级结构和三级结构预测分析可知该蛋白以ɑ-螺旋为主，占70％。有趣的是该基因亚细胞定位预测表明该蛋白有56.5％的可能性定位在细胞质，而在细胞质中主要生成倍半萜和三萜类物质，以fpp为底物通过mva途径产生。

本发明还提供编码所述的小报春pflis/nes蛋白的基因，优选地，所述序列如seqidno.1所示。

本发明还提供含有所述基因的载体、宿主细胞、工程菌。

本发明还提供所述基因在植物花香挥发性物质生成和调控中的应用。

在本发明一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使转基因植物释放或者增加香气挥发性物质芳樟醇的含量。

本发明还提供一种花香挥发性物质含量提高的转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将基因的载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

本发明成功的克隆了小报春芳樟醇/橙花叔醇合酶基因(pflis/nes)的全长序列，该序列包含一个长为1638的完整开放阅读框，并且具有萜类物质特有的天冬氨酸富集区保守序列。该基因在花中表达量最高，而不同花期的荧光定量结果表明，该基因在盛花期表达量最高。将该基因转入拟南芥，以纯化的芳樟醇为标品，采用固相微萃取结合气象色谱-质谱联用技术(spme-gc-ms)收集并检测t2代转基因拟南芥纯合植株的叶片香气成分，结果表明，在转基因植株中测得了挥发性芳樟醇，其平均鲜重达到0.2781±0.0375μg/g，而对照拟南芥未检测到芳樟醇的存在。试验证明pflis/nes在拟南芥中可催化产生芳樟醇，因此pflis/nes是芳樟醇合成酶基因。

附图说明

图1所示为pflis/nes基因的5’race电泳图。

图2所示为pflis/nes基因全长扩增电泳图。

图3所示为pflis/nes蛋白疏水性预测图。

图4所示为pflis/nes蛋白信号肽预测。

图5所示为pflis/nes蛋白三级结构预测图。

图6所示为pflis/nes蛋白系统进化树。

图7所示为gapdh溶解曲线(a)pflis/nes溶解曲线(b)。

图8所示为pflis/nes基因基因在小报春不同组织(a)和不同花期(b)的表达检测。

图9所示为pcambia2300-pflis/nes载体示意图。

图10所示为转基因拟南芥的pcr鉴定结果。图中阳性为阳性质粒对照，阴性为水，1-4为拟南芥不同转基因株系。

图11所示为转基因拟南芥pflis/nes基因的qrt-pcr结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

利用illmina高通量测序平台完成了小报春初花期和盛花期2个样品的转录组测序，建立了小报春不同花期转录组数据库，共获得11.07gbcleandata。denovo组装后共获得94,644条unigene，经blast软件与nr、swiss-prot、kegg、cog、kog、go和pfam数据库进行比对，共有34,468条unigene获得注释信息。

通过对注释的分析和筛选，在差异表达基因里找出大量与花香物质代谢合成相关的基因，再利用ncbi的blastx比对，寻找同源性高且基因注释功能明确的unigenes。此外，利用差异表达基因的kegg富集分析结果，对小报春转录组数据进行pathway富集性分析，在萜类主链合成、柠檬烯和蒎烯降解、二萜生物合成和脂肪酸代谢等途径中找寻与花香合成相关的unigenes。经分析比对，从海量转录组数据中共筛选出与花香物质代谢合成相关的芳樟醇/橙花叔醇合成酶基因，具体信息见表1。

表1与花香相关的差异表达基因lis/nes

注：t01：盛花期样品；t02：初花期样品

实施例2小报春芳樟醇/橙花叔醇合成酶pflis/nes全长cdna的克隆

设计race引物，nes-5’：gattacgccaagcttcaaagacggagaatcgtggctgtgtg，以花朵的cdna为模板，根据试剂盒说明书进行5’racepcr，扩增得到一条大小约为1000的清晰条带(图1)。将获得的5’端序列与已有的目的片段进行拼接，得到一段1781的片段，包含一个1638完整的开放阅读框，从开放阅读框两头设计引物，nes-r:ctatatcttgcttaaatcattacac；nes-f:atggcaaatctaactgagtttgaaat扩增到一条大小约为1700的清晰条带(图2)，序列如seqidno.1所示，编码的蛋白质序列如seqidno.2所示。

实施例2小报春pflis/nes基因生物信息学分析

1.蛋白保守结构域预测

经ncbi比对显示,pflis/nes蛋白属于terpene-synth家族，含有萜类基因家族的金属结合域。

2.pflis/nes蛋白一级结构分析

(1)蛋白的基本理化性质分析

用expasy-protparamtool对所克隆到的pflis/nes基因的一级蛋白结构进行分析，结果显示该蛋白的理论分子量约为62.9kd，预测等电位为5.60，分子式为c2828h4406n728o833s31，原子量为8826，在构成pflis/nes蛋白的20种氨基酸中亮氨酸(l)和赖氨酸(k)谷氨酸(e)含量最高，分别为11.4％和8.1％，色氨酸(w)含量最少，为1.9％，强碱性氨基酸(k、r)占10.7％、强酸性氨基酸(d、e)占13.4％、疏水性氨基酸(a、i、l、f、w、v)占34.8％、极性氨基酸(n、c、q、s、t、y)占28.1％、其它氨基酸(m、g、h、p)占13.2％(图2-6)。预测半衰期(estimatedhalf-life)为30h，不稳定性(instabilityindex)为43.38，认为该蛋白是不稳定蛋白。脂溶指数(aliphaticindex)为92.15。带负电荷的残基有73个(asp+glu)，带正电荷的残基58个(arg+lys)。

(2)疏水性分析

用protscale分析pflis/nes蛋白的疏水区，预测显示该蛋白最大亲水区位于450个氨基酸出，为-3.244，最大疏水区位于405个氨基酸处，为2.178，该蛋白总平均亲水性为0.749，该值大于0的时候表明该蛋白疏水性较强(图3)，推测该蛋白为不可溶性蛋白。

(3)信号肽预测分析

利用signalp软件预测pflis/nes蛋白的信号肽，结果没有检测到明显的信号肽(图4)。

(4)磷酸化位点预测分析

prosite分析结果表明，pflis/nes蛋白中含有6个n-糖基化位点，10个酪蛋白激酶ii磷酸化位，4个n-豆蔻酰化位点，7个蛋白激酶c磷酸化位点，1个微体c-末端靶向信号。用netphos3.1对pflis/nes蛋白磷酸化位点进行预测，结果显示该蛋白含有26个丝氨酸、9个苏氨酸和7个酪氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。

(5)蛋白的跨膜结构预测

tmhmm分析表明，该蛋白没有明显的跨膜结构。

3.pflis/nes蛋白二级结构分析

预测结果显示，pflis/nes基因二级结构以ɑ-螺旋为主，占70％，其次是无规则卷曲，较少的延伸链和β-转角分布于该结构中。

4.pflis/nes蛋白三级结构预测分析

以3n0f.1.a.pdb作为同源模板。在ncbi中搜索下载对应序列，经mega比对后通过usertemplatemodol进行同源建模。通过deepview(swiss一pdbviewerv4.0pc)对所创建的蛋白三维结构模型进行观察，结构显示由pflis/nes肽链所构建的几维模型由29段α-螺旋和2段β-折叠构成(图5)。

5.pflis/nes蛋白亚细胞定位预测

根据预测结果显示，该蛋白有56.5％的可能性定位在细胞质。有13.0％的可能定位在质体中。

6.同源性分析

将pflis/nes蛋白序列输入到ncbiblast进行搜索同源序列，下载相似度高的序列通过dnaman进行比对。比对结果如下，该蛋白与山茶、雷公藤、猕猴桃、非洲草莓、黑杨、葡萄lis/nes蛋白的相似性分别为：49.25％、44.65％、48.73％、45.84％、46.16％、47.20％。

7.系统进化分析

用ncbi搜索并下载同源序列，导入mega中采用neighbor-join的方式进行系统进化树的创建。结果如图6所示，可以看出该基因与茶树关系较近，与其物种关系较远。

实施例3小报春pflis/nes基因表达特异性分析

以小报春不同组织：根、花葶、叶、花和4个不用花期：花蕾期、初花期、盛花期、末花期的花器官为试验材料。花蕾期的标准为：花瓣被萼片包住，未展开；初花期的标准为：花瓣向外伸展但未完全打开；盛花期的标准为：花瓣完全展开；末花期的标准为：花瓣皱缩，变色向外翻卷。

提取上述样品的rna,反转录成cdna，进行pflis/nes的表达分析。

引物设计：根据qpcr要求进行设计引物，并送上海生物科技股份有限公司进行合成。

qnes-f:gggtggcggaattgacaagg；

qnes-r:acggagaatcgtggctgtgt。

选取gapdh作为内参基因，qpcr反应结束后,对仪器所得到的数据进行分析，按照公式计算目的基因表达量,其中△△ct＝(待测组目的基因ct一待测组gapdhct)-(对照组目的基因ct-对照组gapdhct)。选择表达量较低的组织作为参照。

qgapdh-f：aacgagaaggaatacacatc；

qgapdh-r：ctaatggagcaagacagtt。

实时定量pcr结果显示内参基因gapdh和pflis/nes溶解曲线有单一的溶解峰，无杂峰，说明该反应特异性好，实验结果可信(图7)。通过分析得出pflis/nes主要在小报春的花器官中表达，而在根、花葶和叶中的表达量较低。从花的不同发育阶段来看，pflis/nes在盛花期表达量最高，其次是末花期，在初花期表达量最少(图8)。

实施例4小报春pflis/nes基因的功能验证

从克隆载体中酶切下pflis/nes基因，然后连接到植物表达载体pcambia2300中，构建了小报春pflis/nes基因的植物超表达载体pcambia2300-pflis/nes(或35s::pflis/nes)，载体示意图如图9所示。

将构建好的载体转化入根癌农杆菌，用于转化拟南芥。采用本领域熟知的花序浸染法进行拟南芥的遗传转化。

将通过农杆菌花序侵染获得的转基因拟南芥t0代种子播种在含50mg/lkan的ms固体培养基上进行阳性植株筛选，成功转入目的基因的拟南芥能够在抗性培养基上正常生长，而未成功转入的则在子叶期黄化死亡，分别收获种子后继续进行抗性筛选，将表现出分离比接近3:1的株系各单株分别移栽收种，并继续进行抗性筛选，获得t2代纯合体转基因单株。

提取t0代kan抗性筛选出的拟南芥和野生型wt植株的叶片基因组dna，以小报春pflis/nes基因特异引物nes-f和nes-r进行pcr检测。结果表明，野生型拟南芥wt及阴性对照没有扩增出目的条带外，其余kan抗性株系均扩增出与目的片段大小一致的条带，说明目的基因pflis/nes已成功插入到转基因拟南芥的基因组中(图10)。

提取在含相应抗生素的ms固体培养基上播种后生长约15天的t2代纯合体转基因拟南芥和野生型拟南芥wt幼苗整株总rna，以拟南芥actin为内参基因，进行qrt-pcr检测目的基因的表达。pflis/nes的qrt-pcr引物同前。拟南芥actin的引物如下：

actin-f：cttcgtcttccacttcag；

actin-r：atcataccagtctcaacac。

结果如图11所示。结果显示，野生型拟南芥wt中几乎没有检测到pflis/nes基因的表达，各个阳性株系皆有不同程度的表达。

对得到的共12株t2代转基因纯合拟南芥植株为试验材料，通过固相微萃取spme的方法收集转基因拟南芥与对照拟南芥叶片的挥发性物质，以纯化的芳樟醇标准品为对照，经gc-ms分析，定量检测转基因拟南芥与对照挥发性芳樟醇的释放情况。结果表明，共8株转基因拟南芥测得了芳樟醇的释放，各个阳性株系皆有不同程度的表达，其释放量的平均鲜重为0.2781±0.0375μg/g，而对照拟南芥未检测到芳樟醇的存在。试验证明pflis/nes在拟南芥中可催化产生芳樟醇，因此pflis/nes是芳樟醇合成酶基因。

表2spme-gc-ms分析拟南芥香气成分

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>四川天艺优境环境科技有限公司

四川农业大学

<120>小报春花香相关基因pflis/nes及其用途

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1638

<212>dna

<213>小报春(primulaforbesii)

<400>1

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aacaaatcgcttttgcccaagaacaacttgtttcacgttgaagtttcaactatgcatgag120

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<213>小报春(primulaforbesii)

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<213>小报春(primulaforbesii)

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<213>小报春(primulaforbesii)

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<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

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<210>9

<211>19

<212>dna

<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

<400>9

atcataccagtctcaacac19