分离的鲤抗病毒蛋白Pdcd6ip及抗病毒活性的制作方法

本发明涉及淡水鱼类基因工程技术领域，尤其涉及一种分离的鲤抗病毒蛋白pdcd6ip及抗病毒活性。

背景技术：

我国为水产养殖大国，但是近些年来伴随着水产养殖业的不断发展，水生动物疾病尤其是病毒性疾病的发病率呈现明显的上升趋势。这对我国的水产养殖业及进出口贸易均造成了巨大的经济损失，严重制约着我国水产养殖业的健康和可持续发展。其中，鲤春病毒血症(springviraemiaofcarp，svc)是一种由鲤春病毒血症病毒(springviraemiaofcarpvirus，svcv)导致的暴发性出血症。该病是一种以出血为主要临床症状并伴有高度传染性的急性流行病，能在鲤、锦鲤、草鱼、鲢、鳙、鲫等多种鲤科经济鱼类和观赏鱼类发生明显症状。svc常于春季在水温8～20℃，尤其是13～15℃时暴发流行，该病的暴发与水温和鱼体健康状况密切相关，水温越适宜、鱼体健康状况越差越容易感染。病鱼常聚集于出水口处，体色发黑，眼球突出，肛门红肿，腹部膨大及严重腹水，呼吸缓慢，往往失去平衡而侧游。该病发病急、死亡率可高达90％左右，严重危害渔业生产并造成毁灭性打击，因此世界动物卫生组织oie将其列为必须申报的重要疫病。2008年，农业部第1125号公告更是将该病列为“中华人民共和国进境动物一类传染病”，也是迄今唯一被列为一类传染病的鱼类疫病，是我国鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。

目前，国际上通行的控制该病的有效措施是进行鲤春病毒血症的监测，及早发现并进行隔离或扑杀，尚缺乏有效控制鲤春病毒血症的药物和方法。因此加强svcv抗病毒机制的研究，寻求有效的预防和治疗方法具有极为重要的理论和实践意义。

程序性细胞死亡6互作蛋白pdcd6ip(programmedcelldeath6-interactingprotein)，也称为alix或aip1，由pdcd6ip基因编码，是内吞体分选转运复合体iii((endosomalsortingcomplexesrequiredfortransportiii,escrt-iii)的组成部分，还在调控程序性细胞死亡中起到了重要作用。研究表明，pdcd6ip可以结合细胞凋亡相关蛋白alg-2、escrt-iii中的cin85,endophilins,chmp4b和tsg101等蛋白。此外，pdcd6ip可以结合病毒的晚期结构域，包括p(s/t)ap、yxxl、ppxy等，参与了有包膜病毒如人类免疫缺陷病毒hiv、马传染性贫血病毒eiav等的出芽及水泡性口炎病毒vsv复制过程中核衣壳从内体到细胞质的转运。pdcd6ip在多种分子机制中发挥了不可或缺的桥梁作用，而病毒成分细胞内的转运及完整病毒的出芽为病毒正常复制所必不可少。因此，pdcd6ip在调节病毒感染和复制中具有重要作用，其表达与否及表达水平的高低将影响病毒的感染和复制。eiav中研究表明，pdcd6ip的过表达抑制了其复制。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种鲤抗病毒蛋白，具有针对鲤春病毒血症的抗病毒活性，降低svcv感染性，抑制svcv病毒复制功能，同时对于普通细胞的细胞活性的影响低，为svcv病毒感染的治疗提供新的药物靶点。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种鲤抗病毒蛋白(pdcd6ip)，具有针对鲤春病毒血症的抗病毒活性，降低svcv感染性，抑制svcv病毒复制功能，同时也不会影响普通细胞的细胞活性，为svcv的治疗提供新的药物靶点，克服现有技术的不足。

为实现上述目的，本发明提供了一种分离的鲤抗病毒蛋白pdcd6ip基因，所述pdcd6ip基因的核苷酸序列是seqidno：1中第1-2610bp所示的序列。

本发明还提供了一种分离的鲤抗病毒蛋白pdcd6ip，所述蛋白pdcd6ip编码的氨基酸序列是seqidno：2中所示的序列。

进一步地，所述蛋白pdcd6ip具有能够与鲤春病毒血症病毒(svcv)基质蛋白m中的ppxy结构域结合的片段。

本发明还提供了一种包含所述pdcd6ip基因的核苷酸序列的重组表达质粒。

本发明还提供了一种制备所述重组表达质粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤一、提取鲤的rna，反转录所述rna获得鲤总cdna；

步骤二、设计pdcd6ip基因的正向引物和反向引物，以所述步骤一获得的所述鲤总cdna为模板扩增，得到扩增产物；

步骤三、将所述步骤二得到的所述扩增产物进行分子克隆，得到重组表达质粒。

进一步地，所述步骤二还包括在扩增前，还需在所述鲤总cdna的上下游分别引入nhei、ecori酶切位点。

进一步地，正向引物和所述反向引物分别为pci-pdcd6ip-f和pci-pdcd6ip-r，其中pci-pdcd6ip-f的dna序列为ttagctagccaccatggcgacgtttatttctgtc，所述pci-pdcd6ip-r的dna序列为cggaattcctactgttgggggtagtagggct。

进一步地，所述扩增产物为2610bp的dna片段。

本发明还提供了一种所述鲤抗病毒蛋白pdcd6ip基因在制备抗鲤春病毒血症病毒药物组合物中的应用。

本发明还提供了一种所述鲤抗病毒蛋白pdcd6ip在制备抗鲤春病毒血症病毒药物组合物中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益的技术效果：

(1)本发明的鲤抗病毒蛋白pdcd6ip的表达可以影响鲤春病毒血症病毒(svcv)的增殖，且抑制了svcv病毒的复制功能，降低了svcv病毒的感染性；

(2)本发明的鲤抗病毒蛋白pdcd6ip的过表达对于普通细胞的细胞活性的影响极低；

(3)本发明的pdcd6ip基因和pdcd6ip蛋白为制备抗鲤春病毒血症病毒药物提供了新的靶点。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的pdcd6ip基因片段的扩增结果示意图；

图2是本发明的一个较佳实施例的利用免疫印迹法检测pdcd6ip过表达情况的结果示意图；

图3是本发明的一个较佳实施例的利用细胞增殖/毒性检测试剂cck-8检测pdcd6ip过表达对细胞活性的影响结果数据图；

图4是本发明的一个较佳实施例的利用间接免疫荧光法检测pdcd6ip蛋白对病毒感染的影响的荧光成像图片；

图5是本发明的一个较佳实施例的利用荧光定量pcr检测pdcd6ip蛋白对病毒增殖的影响结果数据图；

图6是本发明的一个较佳实施例的应用的pci-neo空载体的结构示意图谱；

图7是本发明的一个较佳实施例的制备的重组表达质粒pci-pdcd6ip的结构示意图谱；

图8是本发明的一个较佳实施例的制备的重组表达质粒pci-flag-pdcd6ip的结构示意图谱。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

(1)鲤的rna提取

采用经典的trizol法提取待测样品总rna。取鲤组织块用眼科剪剪碎后直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，研磨充分后转入离心管，取50-100mg组织加入1mltrizol，混匀，室温(15-25℃)放置10min，然后4℃，12000×g，离心5min。

取上清加入200μl氯仿，振荡混匀后室温放置15min，4℃，12000×g，离心15min。

取上层水相至另一新的离心管，加入500μl异丙醇，冰上放置10min，4℃，12000×g，离心15min。

弃上清，加入冰上预冷的75％的乙醇1ml洗涤沉淀，4℃，7500×g，离心10min。

弃上清，室温晾干，用无rna酶的水溶解rna沉淀，立即进行反转录。

(2)反转录获得鲤总cdna；

采用invitrogen公司的反转录试剂盒，按照说明书操作步骤进行cdna合成，具体步骤如下：

在pcr反应管中依次加入1μg上述提取的所述rna、1μl随机六聚体引物、补充无rna酶水至总体积12μl；于65℃反应5min，立即置于冰上，然后加入4μl5×reactionbuffer，1μlribolockrnaseinhibitor，2μl10mmdntpmix和1μlrevertaidm-mulvrt，25℃反应5min，之后42℃保温45min获得鲤总cdna。

(3)鲤pdcd6ip基因扩增

首先利用primerexpress5.0软件，设计pdcd6ip基因的正向引物和反向引物，并分别在所述鲤总cdna的上下游引入nhei、ecori酶切位点，以所述鲤总cdna为模板进行pcr扩增，引物序列为：

pci-pdcd6ip-f：ttagctagccaccatggcgacgtttatttctgtc；

pci-pdcd6ip-r：cggaattcctactgttgggggtagtagggct。

pcr反应体系为：50μl反应体系，包括ddh2o30.5μl，10×labufferii(mg2+plus)5μl，dntpmixture(2.5mmol/l)8μl，上下游引物(10μmol/l)各2μl；lataqpolymerase(5u/μl)0.5μl，cdna模板2μl。

pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸3min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保温。

pcr扩增产物采用1.0％琼脂糖电泳，核酸染色剂染色。电压120v，电泳30min，标准分子量作对照，扩增得到2610bp的扩增产物，扩增结果如图1所示。

(4)重组表达质粒pci-pdcd6ip和pci-flag-pdcd6ip的构建

按照经典的分子克隆操作方法，用dna胶回收试剂盒进行pcr片段的切胶纯化回收，然后分别将pci-neo载体(购于promega公司，图谱如图6所示)和回收的所述扩增产物的pcr片段用nhei和ecori37℃双酶切3h，酶切片段纯化回收。回收片段在t4-dna连接酶作用下，于16℃连接过夜。将连接产物转化dh5α大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆扩大培养，pcr进行鉴定。阳性克隆进一步通过测序、比对确定重组质粒序列的正确性，命名为pci-pdcd6ip，所有样品均由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

pci-flag-pdcd6ip质粒的构建方法如下：在pci-pdcd6ip引物中起始密码子atg前插入flag标签序列，分别设计合成引物pci-flag-pdcd6ip-f1：ttagctagccaccatggattacaaggatgacgacgat和pci-flag-pdcd6ip-f2：ggatgacgacgataagatggcgacgtttatttctgtc，以测序正确的pci-pdcd6ip质粒为模板，用pci-flag-pdcd6ip-f2和pci-pdcd6ip-r引物对进行第一轮pcr，pcr产物胶回收后，再以第一轮pcr产物为模板，用pci-flag-pdcd6ip-f1和pci-pdcd6ip-r引物对进行第二轮pcr，pcr产物胶回收，余下步骤同pci-pdcd6ip质粒的构建方法。

重组表达质粒pci-pdcd6ip和pci-flag-pdcd6ip的图谱分别如图7和图8所示。

(5)重组表达质粒和空载体的制备

将30μl测序正确的单克隆的菌液接种到3ml含50ug/ml的氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，220rpm，摇床过夜培养，用质粒提取试剂盒(购于invitrogen公司)提取所述重组质粒pci-pdcd6ip和所述空载体pci-neo质粒，具体步骤如下：

将过夜培养的菌液置于1.5ml离心管中，室温，12000×g离心1min，弃尽上清，重复以上操作直至所有菌液离心完；

在细菌沉淀中加入250μlresuspensionsolution悬浮沉淀；

加入250μllysissolution温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步骤不宜超过5min；

加入350μlneutralizationsolution并充分上下翻转4-6次，室温，12000×g，离心5min；

吸去上清并转移至吸附柱(试剂盒内提供)，室温，12000×g，离心1min，弃滤液；

用500μlwashsolution洗两次，弃滤液；室温，12000×g，离心空柱1min；

吸附柱移入新的1.5ml离心管中，在吸附柱膜中央加50μleluent，室温静置2min，12000×g离心1min。

(6)重组表达质粒和空载体转染epc细胞

具体步骤如下(以24孔细胞培养板为例)：

转染前一天，根据转染目的确定细胞密度，如果转染后收集细胞western检测，第二天待细胞密度达到约90％时转染，若转染后观察蛋白定位，密度可适当降低；

转染：a先将0.8μgdna溶于50μlopti-mem培养基中；b将2μllipo2000溶于50μlopti-mem培养基中，混匀，室温放置5min；然后将ab两管混合，室温放置20min；

期间将24孔板内培养基换成无血清培养基，每孔400μl。若孔内没有死细胞可以不换，不影响转染效率；

将ab管混合物加入24孔板对应孔中，前后左右轻轻混匀，置培养箱中，4-6h后换成含10％血清的培养基。

(7)检测重组质粒pci-pdcd6ip过表达对细胞活性的影响

利用细胞增殖/毒性检测试剂cck-8(购于dojindo公司)检测过表达对细胞活性影响，cck-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析，其基本原理为，该试剂中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐(wst-8)，它在电子载体1-methoxypms的作用下能被细胞内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲臜，生成甲臜的量与细胞数成正比，可间接测定活细胞数量。具体步骤如下：

转染前一天，接种100μlepc细胞悬液到96孔细胞培养板中，培养过夜，待细胞密度达到约70％-90％时按前述方法转染所述重组表达质粒pci-pdcd6ip和所述空载体pci-neo；

分别于转染后12h、36h和72h向每孔中加入10μl的cck-8；

将培养板在培养箱内孵育1小时，利用酶标仪测定450nm处的吸光度。

结果如图3所示，表明重组质粒pci-pdcd6ip过表达并不影响细胞的活性。

(8)westernblot免疫印迹实验

具体步骤如下：

所述重组表达质粒pci-flag-pdcd6ip和所述空载体pci-neo转染epc细胞24小时后，弃上清，用pbs洗两次，每次3min，加入ripa细胞裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，冰上孵育10min裂解细胞，将裂解液转移到1.5mlep管中，12000×g，离心5min,取20μl离心上清和5μl的5×蛋白上样缓冲液混匀，95℃煮5min，进行sds-page。sds-page凝胶的制备采用sds-page凝胶配制试剂盒(购于上海翊圣公司)；

裁剪与凝胶大小完全吻合的滤纸和pvdf膜，在转移缓冲液中平衡15min；

凝胶电泳结束后，拆卸凝胶夹层，去除浓缩胶，凝胶于适量转移缓冲液室温平衡10min；

用转印缓冲液润湿墨板，组装转印夹层，注意及时需要排出气泡。在恒压下转移蛋白20v，40min；

转膜完后，将膜取出，放入杂交盒，加10ml5％pbst-bsa封闭液封闭，37℃封闭2h或4℃封闭过夜；

倒掉封闭液，加入稀释好的flag标签抗体(一抗，购于sigma公司，以体积比1：1000稀释)，在37℃缓慢摇动2h；

pbst洗3次，每次3min，将稀释好的碱性磷酸酶(ap)标记的山羊抗鼠igg抗体(二抗，购于碧云天公司，以体积比1：800稀释)加入到杂交盒中，37℃缓慢摇动1h；

倒掉二抗，pbst洗3次，每次3min。加入10mlnbt/bcip发色底物，条带在5-10min内显色。免疫印迹结果如图2所示，表明转染后，pdcd6ip得到过表达。

(9)间接免疫荧光(if)

pbs洗细胞2次，每次3min，每孔加入300μl4％多聚甲醛，室温固定30min；

吸除固定液，用pbs洗细胞3次，每孔加入300μl含0.2％tritonx-100的pbs透化15min；

pbs洗3次，加入含4％bsa的封闭液，37℃封闭2h；

吸除封闭液，加入用封闭液稀释的一抗(本实验室制备，兔抗svcvm蛋白抗体，以体积比1:1000稀释)，37℃孵育2h；

吸除一抗，pbs洗3次，每次3min，加入荧光二抗(alexafluor488标记的驴抗兔，购于invitrogen公司，以体积比1:2000稀释)，37℃孵育1h；

吸除二抗，pbs洗3次，每次3min，加入pbs稀释的染核液dapi(1:2000)染色液，室温染色10min，pbs洗3次，每次3min；

每孔加入500μlpbs,置于荧光倒置显微镜下观察并拍照。结果如图4所示，pdcd6ip的表达会抑制svcv的感染。

(10)pdcd6ip的过表达对svcv增殖的影响

所述重组表达质粒pci-pdcd6ip和所述空载体pci-neo转染epc细胞24h后，以moi＝0.5接种鲤春病毒血症病毒(svcv)，于感染后12h、24h和36h分别收取实验组和对照组的上清，进行svcv病毒滴度测定。具体操作步骤如下：

所述重组表达质粒pci-pdcd6ip和所述空载体pci-neo转染epc细胞；

转染24h后，用无血清m199洗两次，以moi＝0.5接种鲤春病毒血症病毒(svcv)，20℃吸附1小时，换成含2％fbs的m199；

感染后12h、24h和36h分别收取实验组和对照组的上清，用病毒rna提取试剂盒(购于qiagen公司)提取病毒的rna；

采用反转录试剂盒(购于invitrogen公司)进行反转录合成cdna；

利用荧光定量pcr方法进行病毒滴度测定。

荧光定量pcr引物序列如下：

正向引物：n-tf1：atcaggccgattatccttcca；

反向引物：n-tr1：agataagcattcacatgctgtat；

在200μl荧光pcr反应管中依次加入10μl2×sybrpremixextaq(takara公司)，浓度10μmol/l正向引物、反向引物各0.4μl，0.4μlroxreferencedyeii和100ng/μl待测样品的cdna2μl，补充双蒸水至20μl，置于7500fast荧光定量pcr仪中进行反应，反应条件为95℃30s；之后95℃5s、60℃30s、72℃30s40个循环，结束后，立即由仪器进行熔解曲线分析，最后通过abi75002.0.6软件计算扩增产物tm值；以转染空载体pci-neo的细胞24小时病毒滴度设为1，如图5所示，pdcd6ip过表达可以显著抑制病毒的增殖，表明pdcd6ip具有明显抗病毒功能。

本实施例通过基因克隆技术从鲤中分离出的抗病毒蛋白pdcd6ip基因，可以结合svcv病毒基质蛋白m中存在的ppxy结构域，通过一系列的试验验证，可以表明本发明克隆的pdcd6ip蛋白基因的表达具有优异的抗病毒特性，降低svcv感染性，抑制svcv病毒复制功能，影响其增殖，在细胞抵御svcv的感染过程中发挥着重要作用。而且pdcd6ip的过表达对普通细胞的细胞活性的影响也是极低的。本发明的pdcd6ip蛋白及其基因为制备抗svcv药物提供了新的靶点。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110>上海市水产研究所

<120>分离的鲤抗病毒蛋白pdcd6ip及抗病毒活性

<130>20190417

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2610

<212>dna

<213>鲤(cyprinuscarpio)

<400>1

atggcgacgtttatttctgtcccgttgaaaaagtcctcagaggtggacttagcgaaaccg60

ttgttgaaatttgtaactgccacgtatcctcccggtgaggagcaggcggagtatgtccgt120

gccgtggaagagctcaacaagctccgcaaaagtgctctggggaggccgctggacaaacac180

gagagctcgctggaaatcctgcttcgatattatgatcagctctgtgcaatcgaacccaaa240

tttccttttccagagttgtgtctgacattcacttggaaagatgcttttgataaaggatca300

ctttttggaggatcagtaaagcttgcattggcaagtgtgggctatgagaagacgtgcgtg360

ttgtttaatgtcggtgcgctggcgggtcagcttgcttctgagcagaatctcgacaatgac420

gaaggacttaagactgccgccaagttctaccagctggcgagtggtgcatttgctcatata480

aaggacactgtgctgtctgcactgaatcgagagcccaccatggacatctcccccgagacg540

gtgggcacgctcagtcagatcatgctcagccaggcacaggaggtcttcgttctcaaggcc600

actgctgataagatgaaggacgccattgtcgctaaactcgccaaccaggcagcagattac660

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gtcctggccgccaagcactgtatgatgcaggccaccgccgagctgcaccagtcagccttg780

gccaatcagaagaaaaagttcggagaggagattgctcggctgcagcacgccacagagctg840

gtgaagactgcggcttccagatacgatgagtacgttaacgtaaaggatctgtcagataag900

atcagtcgtgcgctcacggctgcaaagaaggacaacgatttcatttaccatgatcgtgtg960

cccggagtcaaagacctggagcacattggcaaagcatctctggtcaaagcaactgcagtg1020

cagattccactcagccagaagttcacagatctgtttgagaagatggtgccgatggcagta1080

cagcagtcagtgagcgcagccaattccaggaaggctgacacagtcaacagattgattggc1140

agcatgagagaagcaacaaatctctgcaatggggtgttggcgtctttgaatctgccggct1200

gcactagaagatctgtcaggagacgctgtgcctcagtccatcctggataagagtcgtgca1260

gttattcagcacggaggcctgcagaacatcgaacagctgattcgagatctccctgaactt1320

ctgcagaggaaccgtgagatcctggatgagtccttgaagatattagatgaagaggaaacg1380

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ctgtataaatcactcagagcagagggaaataatttttgcaatatactggacaaggcagtg1500

caggctgatcaggtgatgaaagggcgttacaatgaacattgtgggatgattgctttgctc1560

tgcaagccagagaatgagatcagtgccgccataccgtctgccaaccctgccaagactctg1620

cagggcagtgaggtggtgaacgtgctgagagctcagctggcacagctggatgaggtgaag1680

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ttccttaccgcactcgctcaagatggtgccattaacgaggaggccatgaccaccaatgag1800

ctggacactcgctacggctctcacacacaacgtgttcagcagaacttgcgccgacaggag1860

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tctgaggctaatagcagagaggaggtgttaaagaagcttgctgcggcccatgatagctac1980

atcgagatcagctccaataccaaagagggcactaaattctacaatgatctgacagaaatc2040

ctgctgaagtttcaaaataagtgcagcgacattgtcttcgctcgcaaaactgagagggat2100

gaactgcttaaggagctgcagcagagcatcgctcgtgagccgagcgctccttcattcaat2160

gtcccatcataccagtccaacacccctgctcctgtcccaggaggcccaacccctgcaccc2220

aggactgtgtttaacgcgcagcggcctcaggctaagccccagcccccagcgagaccacca2280

cccccgagcatcactcctcaggctgccagtgcttcagctccagtcagttcttcgatgggt2340

cccggaagcactaatcctccacctgttgcacccactggaccctcacaggctcaaggacca2400

ccctatccctcttatcaaggctacccagggtatccaggttaccagatgccaatggcctat2460

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cagcagcagccctactacccccaacagtag2610

<210>2

<211>869

<212>prt

<213>鲤(cyprinuscarpio)

<400>2

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151015

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100105110

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115120125

glyglnleualasergluglnasnleuaspasnaspgluglyleulys

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275280285

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