一种原噬菌体染色体上的新型转座子的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及一种原噬菌体染色体上的新型转座子。

背景技术：

原噬菌体(prophage)指的是某些温和噬菌体侵染细菌后，其核酸整合到宿主细菌染色体中；噬菌体所整合的核酸称为原噬菌体；它是繁殖和传递噬菌体本身遗传信息的一重要方式。此时的宿主称作“溶原性细菌”，这种噬菌体称作温和性噬菌体，以“原噬菌体”的方式嵌存于宿主的dna中，可随寄主繁殖，延续后代，“和平共处”，一般不引起细胞裂解。

温和噬菌体侵染溶原性细菌后，原噬菌体染色体上如果携带抗生素耐药性基因，便可实现抗生素耐药性基因的转移和扩散。

因此，对于原噬菌体上抗生素耐药性基因转移元件的研究对于耐药细菌监测和抗生素耐药性扩散的靶向控制具有重要意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种原噬菌体染色体上的新型转座子，其转化的重组菌对多种抗生素耐药。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种原噬菌体染色体上的新型转座子，其特征在于，转座子包含完整的整合子in127或缩短的整合子in127；完整的整合子in127或缩短的整合子in127上游连接有is26，下游连接有is26或依次连接有is6100及is26；完整的整合子in127核苷酸序列如seqidno.1；is26核苷酸序列如seqidno.2；is6100核苷酸序列如seqidno.3。

本发明转座子可通过商业合成。

优选地，缩短的整合子in127核苷酸序列如seqidno.4所示。

一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1-3中任意一项的一种原噬菌体染色体上的新型转座子。

一种重组菌，包含上述原噬菌体染色体上的新型转座子或上述重组载体。

上述原噬菌体染色体上的新型转座子在制备耐药菌检测试剂盒中的应用。

上述原噬菌体染色体上的新型转座子在制备阻断抗生素耐药性基因转移的产品中的应用。

由上述技术方案可知，本发明发现的新型转座子一方面对从基因水平上探讨整合了原噬菌体dna序列的细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论和实践意义；另一方面为临床用药提供了一定的指导作用，有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药转座子和整合子水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。

附图说明

图1所示为原噬菌体染色体上的新型转座子tn6556结构示意图；

图2所示为原噬菌体染色体上的新型转座子△tn6556结构示意图；

图3所示为实验各菌株经dral酶切后转入感受态细胞e.colitop10的结合子电泳图(1％琼脂糖凝胶)；

m，dl10000marker(takara公司，日本)；

1，转化子675920–e.colitop10条带；

2，转化子911021–e.colitop10条带；

3，转化子20079–e.colitop10条带；

4，转化子34618–e.colitop10条带。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所描述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1转座子的鉴定

1.菌株的分离和药敏试验

细菌药敏卡：法国biomerieux的ast-gn13。ast-gn13药敏种类有：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、环丙沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、磺胺甲恶唑。

补充药敏试验(microscan公司，美国)：哌拉西林、哌拉西林/舒巴坦、卡拉霉素、奈替米星、妥布霉素和美罗培南。

以台州市立医院及兄弟医院重症监护室病人痰液、血液、脓液作为样本培养对妥布霉素和阿米卡星耐药的阳性菌株，将阳性菌株转种到血平板上分离培养(在35℃含5％co2孵育箱中培养16-18h)，然后将分离的纯细菌按操作程序在vitek2上机和作细菌鉴定与药敏试验，以及在microscan微量稀释板上按操作说明书作手工药敏试验。

从阳性菌株中筛选4株对多种抗生素耐药性较为显著的耐药菌株，经vitek2微生物分析仪鉴定均为肺炎克雷伯菌，鉴定概率为99％；分别命名为菌株675920、911021、20079和34618。

药敏实验结果表明，菌株675920、911021、20079和34618主要对于以下药物耐药：阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素、磺胺甲恶唑。

2.转座子的获取和鉴定

采用takara染色体dna提取试剂盒，按照说明书操作步骤提取细菌染色体dna，作为研究模板，-20℃冰箱保存备用。

以上述提取的染色体dna为模板，利用三代高通量测序dna操作测序。

菌株34618、911021、20079用基因组测序：在pacbiorsii测序仪(pacificbiosciences，美国)上剪切的dna文库，平均大小为15kb(范围为10到20kb)，以及平均插入大小为在hiseq测序仪(illumina，美国)上400bp(范围从150到600bp)。配对末端短illumina读数用于利用proovread校正长pacbio读数，然后使用smartdenovo重新组装校正的pacbio读数而获得相关序列。

菌株675920的测序方法:使用nexteramatepair样品制备试剂盒(illumina，美国)从配偶对文库中对菌株675920进行测序，其在miseq测序仪(illumina，美国)上的平均插入物大小为5kb(范围为2至10kb)。首先将基因组dna随机打断到特定大小(2–10kb范围可选)；然后经末端修复，生物素标记和环化等实验步骤后，再把环化后的dna分子打断成400–600bp的片段并通过带有链亲和霉素的磁珠把那些带有生物素标记的片段捕获。这些捕获的片段再经末端修饰和加上特定接头后建成mate-pair文库，然后上机测序。

将上述扩增出的dna片段使用smartdenovo或newbler2.6重新组装校正的pacbio读数而获得相关序列，分析结构，鉴定出的转座子如图1、2所示。其中，菌株34618转座子命名为tn6556，包含完整的整合子in127，完整的整合子in127结构包括：缩短的inti1(5’-cs，δinti1)，atti1，aada2基因盒(gcaada2，包含attc_aada2)，δqace1+sul1(或δsul1)+orf5+orf6(3’-cs)；完整的整合子in127上游连接有is26，下游依次连接有is6100及is26；完整的整合子in127核苷酸序列如seqidno.1；is26核苷酸序列如seqidno.2；is6100核苷酸序列如seqidno.3，转座子tn6556全序列如seqidno.5所示。菌株675920、911021、20079转座子命名为△tn6556，均包含缩短的整合子in127，缩短的整合子in127结构：缩短的inti1(5’-cs，δinti1)，atti1，aada2基因盒(gcaada2，包含attc_aada2)，δqace1+sul1(或δsul1)(3’-cs)；δ表示缩短；缩短的整合子in127上游连接有is26，下游连接有is26；缩短的整合子in127核苷酸序列如seqidno.4所示；菌株675920、911021、20079转座子全序列分别如seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8所示。

实施例2转导实验研究转座子的功能

对肺炎克雷伯菌675920、911021、20079和34618菌株，使用dral(takara公司，日本)酶切dna序列，按试剂说明书进行操作，琼脂糖凝胶电泳分离后得到一段长度分别为约3,600bp、3,600bp、3,600bp和5,900bp长的dna片段(见图3)，将该dna片段以常规方法与pmd19-t载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞e.colitop10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，高通量测序。使用smartdenovo重新组装校正的pacbio读数而获得相关序列，分析结构。测序结果显示，已转入肺炎克雷伯菌675920、911021、20079和34618菌株dna的感受态细胞e.colitop10鉴定出缩短的tn6556或△tn6556。

另外，将已转入肺炎克雷伯菌675920、911021、20079和34618菌株dna的感受态细胞e.colitop10做药敏试验。各菌株染色体酶切后dna片段与感受态细胞e.colitop10结合后的药敏结果见表1。

表1

表中r为耐药。

药敏结果表明：转化子对阿米卡星、妥布霉素、卡拉霉素、庆大霉素和磺胺甲恶唑等抗生素耐药。结果表明转座子转移实验成功，且转移后的转座子导致该转化子对常见的氨基糖苷类和磺胺类抗生素耐药。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>王冬国

<120>一种原噬菌体染色体上的新型转座子

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

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