草鱼补体C5基因、用于克隆草鱼补体C5基因的引物及克隆方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种草鱼补体c5基因，同时还涉及用于克隆该基因的引物和克隆方法。

背景技术：

补体c5是补体系统中一种重要组分，是含硫酯键的α-2巨球蛋白超家族，其基因序列与补体c3、补体c4具有高度的同源性，但在功能上，补体c5参与所有补体激活途径，活化产生过敏毒素小片段c5a和c5b，c5b随后形成膜攻击复合体c5b-9，穿透细胞膜，c5a则能介导白细胞呼吸暴发，但这种介导功能具有种的特异性。目前有关补体c5基因在人类、小鼠、虹鳟、鲤鱼、牛这几种生物钟都有报道，但没有关于草鱼补体c5基因cdna的克隆和序列分析方面的研究报道。

技术实现要素：

本发明针对上述现有技术的不足，提供一种草鱼补体c5基因、用于克隆草鱼补体c5基因的引物及克隆方法，通过race法，从草鱼肝脏中克隆得到草鱼补体c5基因cdna全长序列，并利用软件对其进行氨基酸理化性质分析、信号肽预测、三级结构预测和同源性分析，为进一步研究该基因的结构和功能奠定基础，同时也为草鱼补体其他基因的研究提供可靠的参考。

本发明所采用的技术方案是：草鱼补体c5基因，该基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明同时提供草鱼补体c5基因编码的氨基酸，序列如seqidno.2所示。

本发明还提供用于克隆草鱼补体c5基因的引物，其中，该引物分别为c5-orf-f/r、c5-5'-外、c5-3'-外，序列分别如下：

c5-orf-f：aattctgcagtcgacggtaccatggcacgtttatttttgttctgt，

c5-orf-r：atggtggcgaccggtggatccgcatcacagcccgataataagaaatct；

c5-5'-外:gattacgccaagcttagcaattccatctccccgactcgtcact，

c5-3'-外：5’-aatgtcaattgacattcatgacagcgt-3’。

本发明还提供一种克隆草鱼补体c5基因的方法，其中，该方法步骤如下：

(1)从草鱼肝脏中提取总rna；

(2)设计扩增草鱼补体c5基因的保守结构域核苷酸片段的引物c5-orf-f和c5-orf-r，将提取的草鱼rna反转录成cdna第一链；并以合成的cdna第一链为模板，pcr扩增得cdna保守结构域核苷酸片段；

(3)利用试剂盒合成草鱼补体c5基因的5′-race-readycdna和3′-race-readycdna；

(4)根据步骤(2)扩增得到的cdna保守结构域片段设计5’-race下游内外巢引物和3’-race上游内外巢引物，并分别以步骤(3)合成的5′-race-readycdna和3′-race-readycdna为模板，扩增得到草鱼补体c5基因的cdna5′端和cdna3′端片段；

(5)将cdna保守结构域核苷酸片段、cdna5′端和cdna3′端片段进行拼接得到草鱼补体c5基因的全长cdna序列。

上述引物c5-orf-f和c5-orf-r是根据ncbi中草鱼补体c5基因序列设计的。

本发明首次用该发明的针对草鱼补体c5基因的克隆race方法获得草鱼补体c5基因的cdna全长序列。该草鱼补体c5基因cdna序列全长5365bp，编码1693个氨基酸，同源性分析表明，草鱼补体c5基因和鲤鱼在进化上亲缘关系最近，同源性为79.33％；并在草鱼补体c5蛋白中发现有a2m-n-2、anato、a2m、a2m–recep和c345c五个共同结构域，从生物信息学方面确定了草鱼补体c5的存在。由于草鱼补体c5序列较长，对于每一步实验条件的要求都比较高，因此本发明通过不断优化实验条件，探索出克隆草鱼补体c5基因的最佳实验体系。其中最大的特点是通过对引物的修饰，将引物tm控制在理想范围之内，设计出了高度有效的5’和3’端的引物。并将最终结果通过ncbiblast比对，确证草鱼补体c5cdna序列的完整性。

附图说明

图1是草鱼补体c5的cdna基因氨基酸序列中的信号肽切割位点图。

其中，c-score：用来区分是否为剪切位点，最高峰值为剪切位点后的第一个氨基酸(即成熟蛋白的第一个氨基酸残基)；s-score：用来区分相应位置是否为信号肽区域；y-score：c-score和s-score的几何平均数，用于避免多个高分c-score值对结果的影响。

图2是草鱼补体c5的蛋白质跨膜结构示意图。

其中，左侧的圈代表第一个跨膜结构，位于4-25aa；右侧的圈代表第二个跨膜结构，位于904-925aa。

图3是草鱼补体c5的系统发育树。

图4是swiss-model预测草鱼补体c5蛋白同源三级结构模型。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以下结合具体的实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1草鱼补体c5蛋白基因cdna全长序列结构与分析

实验动物与样品采集：1龄健康草鱼采自湖南浏阳市乌龙渔场渔场。丁香麻醉后解剖采集草鱼肝脏，剪成100mg左右大小分装样品管中，液氮速冻，-70℃保存备用。

1.草鱼肝脏总rna抽提

将用于研磨组织的研钵于烤箱中180℃烘烤4小时，待研钵冷却至室温后，注入液氮预冷，使研钵的温度与-70℃保存的草鱼肝脏组织样本基本一致。取-70℃保存的肝脏冰冻组织约100mg置于已预冷的研钵中，迅速加入液氮把肝脏组织反复研磨成粉末。在已经研磨成粉末的草鱼肝脏组织中加入总rna提取液，迅速匀浆；把研钵中的匀浆液转移到已经depc处理的一无rnase的离心管中；12000r/min、4℃离心10min，留取上清，室温静置5分钟，加入1ml氯仿，上下颠倒混匀15秒，又室温静置8分钟，12000r/min、4℃离心15分钟；取最上层上清液至另一干燥的无rnase离心管，加与上清液等体积异丙醇，上下颠倒混匀20秒，室温放置10分钟，再12000r/min、4℃离心10分钟；离心，小心吸除上清，在留取的下层液中加入depc水配制的75％乙醇1ml，悬浮沉淀，7500r/min、4℃离心5分钟，后再重复7500r/min、4℃离心5分钟，小心彻底吸除乙醇，留取沉淀，室温干燥30分钟，加30μl无rnase的灭菌去离子水，置于55℃水浴锅中溶解沉淀；检测提取的草鱼肝脏总rna浓度和纯度。样品的浓度计算公式：[rna]＝od260×d×40ng/μl，其中，d为样品的稀释倍数，根据od260/od280比值判断rna的纯度。

2.草鱼补体c5基因的5′-race-readycdna和3′-race-readycdna的合成

使用clontech公司smartracecdnaamplificationkit试剂盒分别合成草鱼补体c5基因的5′-race-readycdna和3′-race-readycdna，用tebuffer稀释10倍-20℃保存备用。

3.草鱼补体c5基因的cdna保守结构域核苷酸片段序列克隆

根据ncbi中草鱼补体c5基因序号auw36852.1序列设计扩增草鱼补体c5基因保守结构域核苷酸片段的引物：

c5-orf-f：aattctgcagtcgacggtaccatggcacgtttatttttgttctgt，seqidno.3，

c5-orf-r：atggtggcgaccggtggatccgcatcacagcccgataataagaaatct，seqidno.4。

并采用fermentasrevertaid^tmfirststrandcdnasynthesiskit反转录试剂盒将提取的rna反转录成草鱼补体c5基因保守结构域cdna第一链。以该cdna第一链为模板，c5-orf-f、c5-orf-r为引物，进行pcr扩增，获得草鱼补体c5基因的cdna保守结构域核苷酸片段。用taqdna聚合酶(takara)进行pcr扩增，扩增条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸1.5min、35个循环,72℃延伸7min。

4.草鱼补体c5基因的cdna5’race的获得

根据上述克隆得到的草鱼补体c5基因的cdna保守结构域核苷酸片段设计5’-race下游内外巢引物，引物序列如下：

c5-5'-外:gattacgccaagcttagcaattccatctccccgactcgtcact，seqidno.5；

c5-5'-内：gattacgccaagcttattcgcgccgttgagcttcagggact，seqidno.6。

采用c5-5'-外引物和试剂盒自带的通用引物10*universalprimeramix(upm)对上述合成的5′-race-readycdna进行扩增。其中，touchdownpcr反应条件为：2×seqampbuffer25μl、5′-race-readycdna或3′-racereadycdna2.5μl、upm5μl、5′或3′引物1μl、seqampdnapolymerase1μl及pcr-gradewater15.5μl，总体积50μl。反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s、72℃延伸1.5min、5个循环；94℃变性30s、70℃退火30s、72℃延伸1.5min、5个循环；94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸1.5min，25个循环；72℃延伸7min。获得草鱼补体c5基因cdna5′端片段。

5.草鱼补体c5基因cdna3’race的获得

根据上述已克隆得到的草鱼补体c5基因cdna保守结构域核苷酸片段序列设计3’-race上游内外巢引物，引物序列如下：

c5-3'-外：5’-aatgtcaattgacattcatgacagcgt-3’，seqidno.7；

c5-3'-内：5’-taatgataaattgcaatgtcaatagaaga-3’，seqidno.8。

采用c5-3'-外引物和试剂盒提供的通用引物10*universalprimeramix(upm)对上述合成的3′-race-readycdna进行pcr扩增，反应体系和反应条件同5’-race的pcr。从而获得基因cdna3′端片段。

6.结果

6.1草鱼补体c5基因序列结构与分析

通过rt-pcr和race法，从草鱼肝脏中克隆获得了草鱼补体c5基因cdna保守结构域核苷酸片段、5’和3’端cdna片段，经克隆测序后，测序所得的这三段片段通过bioedit软件拼接得到完整的cdna全长。比对所得有效序列运用dnastar软件，expasy程序(http://www.expasy.ch/tools/)推算其开放阅读框和编码氨基酸序列情况。结果表明草鱼补体c5基因全长cdna序列全长为5365bp(见seqidno.1)，包括60bp的5'非编码区(5'-utr)，226bp的3'非编码区(3'-utr)与5079bp的开放阅读框(orf)，共编码1693个氨基酸(见seqidno.2)，翻译起始密码子为atg，序列终止密码子为taa，以“aataaa”为特征加尾信号。

6.2草鱼补体c5基因信号肽预测

用smart(http://smart.emblheidelberg.de/)进行蛋白质序列的信号肽分析,信号肽预测草鱼补体c5为分泌信号肽，信号肽区域为1-27aa，结合参见图1，说明草鱼补体c5基因具有信号肽，且信号肽的剪切位点位于第24和25号氨基酸之间。

6.3草鱼补体c5蛋白的理化性质

草鱼补体c5基因cdna共编码1693氨基酸，相对分子质量191342.83，理论pi值7.26，正电荷残基数209，负电荷残基数209，不稳定系数35.56，蛋白稳定。脂肪系数86.18，总平均亲水性-0.274，为亲水性氨基酸。蛋白质疏水作用是蛋白质折叠的主要驱动力，分析蛋白质氨基酸亲疏水性是了解蛋白质折叠的第一步，氨基酸疏水分析为蛋白质二级结构预测提供佐证，是分析蛋白质跨膜区的重要一步。草鱼补体c5蛋白有2个跨膜区，分别在4-25aa、904-925aa，参见图2。

6.4草鱼c5基因氨基酸同源性分析和系统进化树

ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行同源基因搜索比对，mega4.0构建系统发育树，系统进化树的分析结果显示，草鱼的c5序列先与鲤鱼c5聚为一支，再与斑马鱼聚为一支，然后与虹鳟、大马哈鱼等聚合，最后与罗非鱼、黄鳝等鱼类聚合，草鱼c5基因的进化地位和物种的进化地位一致(图3)。氨基酸同源性比对，草鱼c5基因与鲤鱼的同源性为79.33％，与斑马鱼的同源性为73.86％，而与非鲤科鱼类的同源性较低。

6.5草鱼补体c5蛋白的结构域分析

结构域分析是反映基因保守性和基因鉴定的重要方法，ncbi网站structure工具检索cdd数据库分析蛋白质序列的保守结构域，对草鱼c5结构域分析表明，草鱼c5预测蛋白包含26个α螺旋，72个β折叠，包含a2m-n-2、anato、a2m、a2m–recep和c345c五个结构域，都属于α-2巨球蛋白家族。anato是过敏毒素因子的同源结构域，c345c是膜攻击复合体结构域，这些保守结构区和超基因家族都是补体因子所特有的，结合参见图4。

本发明首次用该发明的针对草鱼补体c5基因的克隆race方法获得草鱼补体c5基因的cdna全长序列。结果表明，草鱼补体c5基因cdna序列全长5365bp，编码1693个氨基酸，同源性分析表明，草鱼补体c5基因和鲤鱼在进化上亲缘关系最近，同源性为79.33％。补体c5基因本身有高度保守性，但鱼类的补体存在种群特异性，因此各种类鱼之间补体c5的同源性都不高，模式动物斑马鱼补体c5与鮸鱼补体c5同源性最低为50.9％，与罗非鱼的同源性最高也只有75.4％。补体c3、c4、c5源于同一祖先，拥有共同的结构域a2m-n、a2m-n-2、anato、a2m、a2m–comp、a2m–recep和c345c。本发明也在草鱼补体c5蛋白中发现有a2m-n-2、anato、a2m、a2m–recep和c345c五个共同结构域，因此，从生物信息学方面确定了草鱼补体c5的存在。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖南农业大学

<120>草鱼补体c5基因、用于克隆草鱼补体c5基因的引物及克隆方法

<130>005

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5365

<212>dna

<213>合成()

<400>1

ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagtacatgggaccacacc60

atgagcaaactgtctataatggcacgtttatttttgttctgtatacttcatctcttcgtc120

tgcgytactgtttctgaaaaagtatacttaatcactgcacctaaaaccctgcgtctcgat180

gcttcagaaaatgttgtggtgcagttgttcggttatgaccaggaaactacagtagatctt240

cacctgaagaacacactggcaccagattataaagaatatgcatctcagtccctgaagctc300

aacggcgcgaataactatcaagcttcggctactttacggatcatgcctgtagatttcaca360

aaagaggacaaatatgtcttccttcaggcgatttcttctgctttcactgcatataaaaaa420

atcccagtcactactgtcaatggttttctctttattcagactgacaagccactatataca480

cccgaacaagaggtacaagtgcgtgtttactccctcaacgaggagctgaggaaatctaga540

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gcagacatcaatggagcaaaaccacttcttccaccgttcaaaatacccttgaagccggct660

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gagtttgaagtcaaagaatatgtgcttcccagtatttcaatccacattgagcctgaaacc780

aactatatcagcgaagagaactttgagtctttccagctgaagatttcagccaagtatgtc840

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ataaacttaaacatcaggtcagctctgtcaaccaaacctgatgggcctcaacgcctgagt1020

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gctgaatcatatgtgtctgtcaaccatcgttacctgtacattgatttacatcctgaatcc1500

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ctttctctggagaccttcagctaccagatcatttccagaggaaaaattgtgcagtttgcc1620

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gtgccgtctgctcggctactggtgtactatgtcctgtatggggaggaaaaagcagagctg1740

gtggcagactctgcatggattgatgtgaaggctaaatgtgttcaaaatttaaatatggac1800

atatcaactctcaactcgcagtataaacccaaagataaactcgaattaagagtgtcaact1860

aaaactaaagaagagtcactggtggctttttctgctgtagatacggccctgtacaaccta1920

aaatctaatgacaaagaccctctgaaaaaggtgttacatcatgttgagcgaagtgacttg1980

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ttcattacaaacgccatggcctcaagtgcagaggggacctgctcagacctggttaggttg2100

aagcgttcacctgacctggggcaaaagtttgaatcaaaagccaaaatgtacgggccgtcc2160

aggaattgctgcttatctgggacacgcagtatcccgacgcttgaaacctgtggggatcgt2220

gctaagagactgcctttttctgaaaagactactgattactggaagaaaaggtgccagcgt2280

gccttcttggagtgctgtgaatttgctataaagctccgtaaagacagtgtggataagatc2340

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tacttccctgagagctggttatgggaggaacacaccagcaagtctgggtcagttagcatt2460

accaaaaatcttccagattcactgactacatgggagctaaaagcagttggggtgttcagt2520

gaggggatctgtgtgtcagaagaaaaggttcaggtgtcccaggacattagtgtggatgtt2580

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tttcatggaactcaacaggggaaacatggaaagccaaatgaaatcaaggggcaaatagac2760

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ctcactttcactttaacaactaagtgggggggtgagactgtggtcaagaaattgaaagtg2880

gtgccagagggaattagaaaggaaatacaaagtggtggaagaatagatccaaatggagtc2940

tttggcacttccatgcgaaaacttgagttaaaacatgccattccaccaaacattgcaccc3000

aagtcaactgtggatcgtattctaacaattaatggtgaagtactgggagagcttctgtca3060

ataataaataacccagaaggtttaaaacagttgactaacctgccacggggaaatgcagag3120

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aaatgggacattctgggaaaagagtcagctgcaagtgaaagggaattaaagaggaagatg3240

caagctggcatcaccagcatcatgtcatataagctgaggaatgaatatgctttcagcatg3300

tggtcaaacaaggacaaatcagccagtacctgggtgacggctcttatagccaagacttta3360

gctgacatgcatgaatatgtctctttggagtctgaagtgctgaccaacaccatctattgg3420

ctgattaaaaatcgtcagaatgatgatggctcgttctatgagaaatcacaaaccaatcca3480

attaaactcatgggtgccggagcagatgtcactgaaaagacagtattcctcacatctttt3540

gtcgtgattggaattaaaaatgctctgaaggtcccaaacattaacatacaggcctttaaa3600

gatgctttagatcacgccacgcagtacctctgctctaagtcaaagaagattgaaagttta3660

tatgttagagccatcgcatcctatgctctgacactggtagacacccatagcatgtcagca3720

gttgatctttatgaaaaaatcaaacagcaggctcaagttaaaggaaacccagctacaatt3780

cgtttctgggaagattctaaacctaagaaggattcattaaaacccagtgatgtgacagca3840

aagactgtggaaacaacagtttacatcctgcttaacactttagtcagaggtgattccacc3900

tatgcaaagcccatcctgaactggttaacacaagaccagagatacggagggggctttcat3960

tcaacacaggacagcattcttactttggaggcccttaccaagtacagcatcttagccagt4020

caagccaccttagacatggtggttgacattgaatacaagactaaaggtgatatcagcaga4080

atcaaactaactcagcaaaagcctgtggctaaaccaatagaggtgaccaaaaatgatgat4140

ataataatcaaaactgcaatgagctctggtatttcatttgccaaattgagaacagtctac4200

tatgagatgacagagagcaatgaaaattgccaatttgaaatgtcaattgacattcatgac4260

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tacaagccacatgaaaatacatttgaaacggagtcaggactcactgtgatggaaatttat4380

ttgccaaccggtgtgatcccagtccaggaggatctagatatgtaccaaaatggacttgag4440

tctcagatttccaactatgaaataatgggtgaccaagtcatccttcaaatagattcgata4500

ccatcaaaagatttctactgtgtgggtttccgtattcaagaggaatttgaaactggcctg4560

accagagcctcggtattcagagtttatgaattttatgatcaagaaaataagtgtatgaag4620

ttttaccacaaacaaacccgcaaactattgagactctgtgagggagaccagtgtcagtgc4680

atggcagcggaatgctgcaactttaaatccaccattgataccacaatcactgctgaacag4740

cgcagaaattatttgtgtaaaaaaagcatgaaatatgcatttaaagtgttaattgaatcc4800

tctgaggcagtaggagattttgtgacctacaaagcaaaagttaaaacagtgctcaaaaaa4860

gaacaaacggacgacttaaaaacagattcagagatagattttgtgaagaaggcaacttgc4920

actgaaacaaattttgaagttggcaagcagtatctgatcatgacttctgagagtataaag4980

ataaaagtggatcatgcttataagtataagtttcctttggactcgcatgcttgggtggac5040

tggtggccacttgaatctgactgcaggaatgatgcctgcaaacaatacaccggtgttttg5100

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ttattttataaacttagtcatttattttgtattaaccacaaacatatacaacattaaaca5340

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa5365

<210>2

<211>1693

<212>prt

<213>合成()

<400>2

metserlysleuserilemetalaargleupheleuphecysileleu

151015

hisleuphevalcysxaathrvalserglulysvaltyrleuilethr

202530

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354045

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505560

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859095

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130135140

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180185190

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225230235240

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260265270

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385390395400

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