专利名称：：木犀草素在制备抗补体药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明属中药领域，涉及一种抗补体的药物，具体涉及木犀草素在制备抗补体药物中的新用途。
背景技术：
：在正常的生理条件下，补体的功能主要是攻击外来病原和清除免疫复合物，并维持机体的平衡。然而补体系统的非正常激活会引起人体免疫系统的过度反应，导致人体自身正常组织的损伤和炎症反应。研究表明，与补体过度激活相关的疾病有类风湿性关节炎、老年性痴呆、系统性红斑狼疮(SLE)、器官移植后的排斥反应、多器官功能衰竭综合症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)等。据报道，重症非典型性肺炎(SARS)和由H5N1型病毒感染引起的禽流感，临床上可发现免疫系统的过度反应症状，如ARDS，败血症休克及Reyes综合征等，有研究认为上述反应症状与细胞免疫、体液免疫过度激活有关。己有的研究证实SARS和补体系统的过度激活有关，虽然目前尚未有证据证明高致病性的H5N1型禽流感病毒感染人后会引起补体系统的过度激活，然而已有的研究表明流感病毒感染激活补体旁路途径，在病毒性呼吸系统疾病的发生中起着重要作用。鉴于补体过度激活在引发人类许多危重疾病中的重要作用，因此急需寻找高效低毒的新型补体抑制剂。木犀草素(luteolin)是一种具有代表性的天然黄酮，属弱酸性四羟基黄酮类化合物，化学名为3'，4'，5,7-四羟基黄酮(3',4'，5，7-Tetralydroxyflavone)，化学式为<:15111()06，分子量为286。因最初从木犀草科(Resedaceae)木犀草属(ie"c/a)的草本植物木犀草(i.oAratoL.)的叶、茎、枝中所分离出而得名。木犀草素在植物界分布较广，多分布于唇形科(Labiatae)和菊科(Compositae)植物中。在临床上具有止咳、祛痰、消炎、抗菌、抗病毒及降低血脂和胆固醇等作用，还具有较强的抗氧化活性，可用于抑制油脂食品的劣变。药理实验表明，木犀草素在体外能抑制大鼠肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)增殖，并通过清除自由基从而抑制胶原基因表达,在动物体内具有预防或治疗肝纤维化的作用以及对抗四氯化碳所致的肝细胞损伤。木犀草素对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化模型具有较好的治疗效果，与其抑制肺组织中转化生长因子P(TGF-pi)mRNA表达有关。木犀草素还能扩张冠脉血流量及降低冠脉血管阻力，而对心肌耗氧量无明显影响。近年来的研究证实木犀草素对多种实体瘤、腹水癌和白血病细胞都有显著抑制作用，具有多靶点抗肿瘤作用，既可直接作用于肿瘤细胞干扰细胞代谢，抑制细胞生长，诱导或增敏细胞凋亡；还可通过增强机体免疫功能，发挥抗肿瘤作用，是一种非常有前途的潜在抗肿瘤药物。值得重视的是木犀草素的抗炎活性十分显著。一项数百名支气管炎患者参加的临床研究表明，木犀草素对慢性支气管炎症状，如咳嗽、咳痰、哮喘等都能有效缓解，而且未见有肝脏、心脏或肾脏毒性报道。另有研究认为木犀草素是中药紫苏抗炎抗过敏的主要成分，表现出体内抑制TNFa产生，抑制耳肿胀和变态反应性水肿，其作用机制是通过抑制5-脂氧酶(5-LO)和12-脂氧酶(12-LO),而抑制白三烯B4，C4，D4，E4的产生；能显著减少干燥性皮炎引起的小鼠的自主瘙痒行为，降低病变皮肤中的PGE2含量，其作用机制可能是通过对肥大细胞脱颗粒及组胺释放等抗过敏作用来实现的。综观国内外的报道，均未见木犀草素的抗补体药效及用其制备的补体抑制药物。
发明内容本发明的目的是提供木犀草素新的药用用途，具体涉及木犀草素在制备补体抑制药物中的用途。本发明所述的木犀草素具有如下所示的化学结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>本发明从用于防治重症非典型性肺炎(SARS)的中药复方(国家中医药管理局推荐)中分离提取得到木犀草素单体化合物。所述的中药复方由鱼腥草、野菊花、茵陈、佩兰、草果组成，其比例为15:6:15:10:3。本发明的目的通过下述技术方案实现1.提取和分离纯化木犀草素鱼腥草、野菊花、茵陈、佩兰、草果五味中药按其组成比例为15:6:15:10:3配伍，共计19.8Kg。以95%乙醇冷浸提取，过滤，减压回收乙醇至无醇味，得乙醇提取物。乙醇提取物加水混悬，分别以等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。乙酸乙酯部位经硅胶柱层析，以石油醚一丙酮梯度洗脱。其中石油醚一丙酮(8:2)洗脱流份进行反复硅胶柱层析(石油醚一丙酮7:3)，再经SephadexLH-20(氯仿一甲醇l:l)纯化，得木犀草素。2.木犀草素用于抗补体试验。经体外试验证实木犀草素对经典和旁路途径激活所引发的细胞溶血均有抑制。1)抗补体激活经典途径细胞溶血试验豚鼠血清l:80稀释液作为补体，抗原激活补体经典途径导致羊红细胞溶血，参照文献方法(Kabat，E.A.,Mayer，M.M..Complementandcomplementfixationinexperimentalimmunology.CharlesC.ThomasPublisher,Ilinois,U.S.A.1964.pp.133-240.)观!j得木犀草素能抑制细胞溶血。CH5Q=54pg/mL，n=3。2)抗补体激活旁路途径细胞溶血试验人血清1:IO稀释液作为补体，激活补体旁路途径导致兔红细胞溶血，参照文献方法(Klerx,J.P.，Beukelman,C丄,Van,D.H.,Willers,J.M..Microassayforcolorimetricestimationofcomplementactivityinguineapig，humanandmouseserum.JournalofImmunologicalMethods.1983.63,215-220)测得木犀草素能抑制细胞溶血。AP5()=48pg/mL，n=3。所述木犀草素经体外实验证实有较强抗补体活性。可用于制备补体抑制药物。具体实施例方式实施例1制备木犀草素鱼腥草、野菊花、茵陈、佩兰、草果五味中药按其组成比例为15:6:15:10:3配伍，共计19.8Kg。以95%乙醇冷浸提取，过滤，减压回收乙醇至无醇味，得乙醇提取物lKg。乙醇提取物加水混悬，分别以等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位(405g)、乙酸乙酯部位(200g)和正丁醇部位(100g)。乙酸乙酯部位(l卯g)经硅胶柱层析，以石油醚一丙酮梯度洗脱。其中石油醚一丙酮(8:2)洗脱流份进行反复硅胶柱层析(石油醚一丙酮7:3)，再经SephadexLH-20(氯仿-甲醇l:l)纯化，得木犀草素。木犀草素(Luteolin):黄色针晶。ESI-MS(w/z):287[M+H]+.C15H10O6.!H-NMR(DMSO-d6，400MHz)S12.96(1H,brs,5-OH),10.80(1H，s,7國OH),9.63,9.62(each1H，s,3,,4，-OH),7.37(2H，m,H-2,,6，)，6.82(1H,d，^8.0Hz,H-5'),6.55(1H，s,H-3),6.33(1H,d,7=1.8Hz，H画8)，6.08(1H,d，《/=1.8Hz,H-6).13C-NMR(DMSO-d6，100MHz)S181.0(C-4),167.4(C-7),163.5(C-5)，161.3(C-9),157.4(C-3')，151.3(C-2),146.2(C-4')，120.2(C-l,),118.7(C-6'),115.8(C-2'),112.5(C-5'),102.3(C-3),101.9(C-10),99.5(C-6)，94.2(C-8).实施例2经典途径补体抑制试验取豚鼠血清，以VBSS+缓冲液(巴比妥缓冲液，p1^7.4，含0.5mMMg"+和0.15mMCa2+)稀释为h80，作为经典途径的补体来源。将兔抗羊红细胞的抗体以VBS^缓冲液稀释为1:1000作为溶血素；保存于Alsever液中的羊红细胞(SRBC)配置成2n/。SRBC。精密称量木犀草素lmg，加入VBS^缓冲液溶解(加入P/。的DMSO助溶)，稀释成8个浓度。不同浓度的木犀草素溶液200nL与l:80的补体200pL在37。C预孵育10min后，依次加入IOOiiL溶血素(1:1000)和100^2%SRBC，在37。C水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4。C条件下离心10min。分别取每管上清200pL于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置木犀草素对照组(200^L相应浓度的木犀草素溶液加400pLVBS"缓冲液)、补体对照组(以200pLVBS"缓冲液代替木犀草素溶液)和全溶血组(100^iL2。/。SRBC溶于500nL三蒸水中)。将各浓度的木犀草素组吸光度值扣除相应木犀草素对照组吸光度值后计算溶血抑制率。以木犀草素浓度的对数作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，得到的拟合直线计算CH5o值。以肝素钠作为阳性对照药，结果显示木犀草素可抑制补体经典途径激活所导致的细胞溶血(表l)。实施例3旁路途径补体抑制试验取健康成年男性志愿者血清，以VBS-Mg-EGTA缓冲液(巴比妥缓冲液，pH=7.4，含5mMMg2+和8mMEGTA)稀释为l:10，作为旁路途径的补体来源。保存于3.8%枸橼酸钠溶液的兔红细胞以VBS-Mg-EGTA缓冲液配置成2n/。兔红细胞。精密称量木犀草素lmg，加入VBS-Mg-EGTA缓冲液(加入in/。的DMSO助溶)，稀释成8个浓度。不同浓度的木犀草素溶液150pL与l:10的补体150pL在37t:预孵育10min后，加入200)iL2。/。兔红细胞，在37。C水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4。C条件下离心10min。分别取每管上清200nL于96孔板，在405nm测定吸光度。实验同时设置木犀草素对照组(150^L相应浓度的木犀草素溶液加350pLVBS-Mg-EGTA缓冲液)、补体对照组(以150^iLVBS-Mg-EGTA缓冲液代替木犀草素溶液)和全溶血组(200pL2%兔红细胞溶于300^iL三蒸水中)。将各浓度的木犀草素组吸光度值扣除相应木犀草素对照组吸光度值后计算溶血抑制率。以木犀草素浓度的对数作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，得到的拟合直线计算AP50值。以肝素钠作为阳性对照药，结果显示木犀草素可抑制补体旁路途径激活所导致的细胞溶血(表l)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1.木犀草素在制备抗补体药物中的用途。2.按权利要求1所述的用途，其中所述的木犀草素具有如下的化学结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>全文摘要本发明属中药领域，涉及木犀草素在制备抗补体药物中的新用途。本发明从用于防治重症非典型性肺炎(SARS)的中药复方中分离提取得到木犀草素，所述的中药复方由鱼腥草、野菊花、茵陈、佩兰、草果组成，其比例为15∶6∶15∶10∶3，并经实验证实其经典途径和旁路途径的抗补体活性。本发明所述的化合物木犀草素，可进一步作为活性成分，制备新型抗补体药物。文档编号A61P37/02GK101347424SQ200710044100公开日2009年1月21日申请日期2007年7月20日优先权日2007年7月20日发明者婷张,章蕴毅,陈道峰申请人:复旦大学