专利名称：具有抗骨质疏松活性的仙茅总酚苷的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种从中草药仙茅中提取的具有抗骨质疏松活性的总酚苷及其制备方法和用途。
背景技术：
仙茅是石蒜科植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn.的干燥根茎。味辛，性热，具有补肾阳、强筋骨、祛寒湿之功效，用于阳痿精冷、筋骨疲软、腰膝冷痹、阳虚冷泻等症状。疗效确切，应用广泛。有报道从仙茅中提取分离到仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C等酚苷类化合物(Kubo M.et.al.Journal of Medicinal Plant Research.1983，4752-55；徐俊平等，药学学报，1992，27(5)353-357；Fu Da-Xu.et al.Acta Botanica Sinica，2004，46(5)621-624)，但未见其有抗骨质疏松活性的报道。
发明内容
本发明提供一种具有抗骨质疏松活性的仙茅总酚苷及其制备方法。
本发明仙茅总酚苷的制备方法为按常规将粉碎的仙茅药材用30-95％乙醇热提或冷浸，得提取液，提取液浓缩，过滤，滤液通过大孔树脂吸附，大孔树脂为以苯乙烯为架桥材料的聚苯乙烯型多孔吸附树脂，如D101、D201、ZTC-1、AB-8、1300-I型大孔树脂等，用水或20％以下的含水乙醇洗脱除去杂质，再用30％-90％的含水乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至干，再将其溶于1％-100％的甲醇或乙醇，经Sephadex LH-20色谱柱，收集洗脱液，浓缩至干，得本发明的仙茅总酚苷，得率为生药量的1％以上。
本发明仙茅总酚苷成分分析经硅胶、Sephadex LH-20等色谱分析和用化学、波谱法测定结构，仙茅总酚苷中主要成分为仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C，还含有一种仙茅素类的新化合物(我们将其命名为仙茅素D)和少量其他酚苷类化合物。仙茅苷、仙茅苷B和仙茅苷C化学结构通式为
其中R1表示-OCH3或-OH；R2表示-H或OH。
当R1为-OCH3，R2为-H时，化合物为仙茅苷；当R1为-OH，R2为-H时，化合物为仙茅苷B；当R1为-OCH3，R2为-OH时，化合物为仙茅苷C。
仙茅素D的化学结构式为 结构鉴定结果如下仙茅苷无色针状结晶，分子式C22H26O11，易溶于甲醇，微溶于水。ESI-MS m/z489[M+Na]+，484[M-H]-。1H-NMR(DMSO-d6)6.977(1H，d，H-3)，6.645(1H，dd，H-4)，9.056(1H，s，OH-5)，6.816(1H，d，H-6)，5.316(2H，s，H-7)，3.773(6H，s，OCH3-2′，6′)，6.717(2H，d，H-3′，5′)，7.367(1H，t，H-4′)，4.615(1H，d，1″)。13C-NMR(DMSO-d6)126.72(C-1)，147.43(C-2)，117.19(C-3)，114.74(C-4)，152.29(C-5)，114.33(C-6)，61.33(C-7)，104.25(C-1′)，156.63(C-2′，6′)，112.58(C-3′，5′)，131.31(C-4′)，165.46(C-7′)，55.86(OCH3-2′，6′)，102.55(C-1″)，73.36(C-2″)，76.99(C-3″)，69.81(C-4″)，76.55(C-5″)，60.84(C-6″)。以上数据与文献(KuboM.et.al.Journal ofMedicinal Plant Research.1983，4752-55；徐俊平等，药学学报，1992，27(5)353-357)报道一致，确定其为仙茅苷。
仙茅苷B无色针状结晶(水)，分子式C21H24O11。易溶于甲醇，微溶于水。ESI-MSm/z475[M+Na]+，451[M-H]-。1H-NMR(DMSO-d6)6.972(1H，d，H-3)，6.635(1H，dd，H-4)，9.043(1H，s，OH-5)，6.839(1H，d，H-6)，5.312(2H，s，H-7)，9.993(1H，s，OH-2′)，6.524(1H，d，H-3′)，7.191(1H，t，H-4′)，6.495(1H，d，H-5′)，3.746(3H，s OCH3-6′)，4.614(1H，d，1″)。13C-NMR(DMSO-d6)127.78(C-1)，147.39(C-2)，117.12(C-3)，114.64(C-4)，152.26(C-5)，114.32(C-6)，61.18(C-7)，102.03(C-1′)，155.52(C-2′)，110.94(C-3′)，131.08(C-4′)，108.51(C-5′)，157.26(C-6′)，166.07(C-7′)，55.66(OCH3-6′)，102.52(C-1″)，73.33(C-2″)，76.97(C-3″)，69.77(C-4″)，76.53(C-5″)，60.81(C-6″)，以上数据与文献(徐俊平等，药学学报，1992，27(5)353-357)报道一致，确定其为仙茅苷B。
仙茅苷C无色针状结晶，分子式C27H34O17，易溶于甲醇，微溶于水。ESI-MSm/z500[M+Na]+；1H NMR(CD3OD，500MHZ)δ7.07(1H，d，J 8.82Hz，H-3)，6.71(1H，dd，J8.79Hz，2.95Hz，H-4)，6.92(1H，d，J2.89Hz，H-6)，6.63(1H，d，J 8.935Hz，H-4)，6.86(1H，d，J8.9135z，H-5′)，5.4(2H，AB体系，J12.98Hz，H-7)，3.50(6H，s，OCH3-2′，6′)，4.76(1H，d，J7.34Hz，H-1″)，3.15(1H，brs，H-2″)，3.31-3.51(3H，m，H-3″-5″)，3.71(1H，dd，J 12.07，5.24，H-6a″)，3.85(1H，t，J 4.13)；13CN MR(CD3OD，500MHZ)δ128.304(C-1)，149.679(C-2)，118.968(C-3)，116.834(C-4)，146.469(C-5)，116.659(C-6)，62.532(C-7)，119.144(C-1′)，151.106(C-2′)，144.987(C-3′)，119.946(C-4′)，108.865(C-5′)，153.689(C-6′)，168.078(C-7′)，57.17(OCH3-6′)，61.872(OCH3-2′)，104.096(C-1″)，74.924(C-2″)，77.905(C-3″)，71.340(C-4″)，77.912(C-5″)，63.384(C-6″)。以上数据与文献(Fu Da-Xu.et al.Acta Botanica Sinica，2004，46(5)621-624)报道一致，确定其为仙茅苷C。
仙茅素D白色针状结晶，分子式C19H26O12Cl2。ESI-MS m/z540[M+Na]+，516[M-H]-。1H-NMR(DMSO-d6)2.381(3H，s，CH3-3)，4.216(1H，d，H-1′)，5.116(1H，d，H-1″)，6.862(1H，s，H-6)，9.056(1H，s，OH-5)。13C-NMR(DMSO-d6)152.15(C-1)，113.85(C-2或C-4)，134.60(C-3)，112.98(C-4或C-2)，151.69(C-5)，100.88(C-6)，102.08(C-1′)，72.99(C-2′)，76.27(C-3′)，69.30(C-4′)，76.16(C-5′)，67.99(C-6′)，103.21(C-1″)，73.66(C-2″)，76.56(C-3″或C-5″)，69.96(C-4″)，76.69(C-5″或C-3″)，60.80(C-6″)。根据以上数据确定其化学结构为2，4-二氯-5-羟基-3-甲基苯酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。
以仙茅苷和仙茅苷B的含量为检测指标，经HPLC检测，仙茅总酚苷中仙茅苷和仙茅苷B的含量之和≥50％。
经动物试验，本发明仙茅总酚苷具有显著的抗骨质疏松活性，所以可用于制备抗骨质疏松药物。
具体实施例方式
现结合实施例对本发明作详细描述。
实施例1.制备仙茅总酚苷仙茅药材10kg，粉碎，按常规用50％乙醇渗滤提取，提取液减压浓缩，浓缩液过滤，滤液通过D101大孔树脂吸附，依次用水及10％乙醇洗脱除去杂质，再用40％的乙醇100L进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，再将其溶于60％的甲醇，经SephadexLH-20色谱柱，收集洗脱液，浓缩至干，得仙茅总酚苷115g，经HPLC检测，其中含仙茅苷23.4％和仙茅苷B 31.5％。
实施例2.制备仙茅总酚苷仙茅药材10kg，粉碎，按常规用30％乙醇进行回流提取，提取液减压浓缩，浓缩液过滤，滤液通过AB-8大孔树脂吸附，依次用水及15％乙醇洗脱除去杂质，再用60％的乙醇120L进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，再将其溶于80％乙醇，经SephadexLH-20色谱柱，收集洗脱液，浓缩至干，得仙茅总酚苷120g，经HPLC检测其中含仙茅苷24.6％和仙茅苷B 29.9％。
实施例3.制备仙茅总酚苷仙茅药材10kg，粉碎，按常规用80％乙醇进行热回流提取，提取液减压浓缩，浓缩液过滤，滤液通过ZTC-1大孔树脂吸附，依次用水及15％乙醇洗脱除去杂质，再用70％的乙醇80L进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，再将其溶于60％乙醇中，经Sephadex LH-20色谱柱，收集洗脱液，浓缩至干，得仙茅总酚苷108g，经HPLC检测其中含仙茅苷25.8％和仙茅苷B 31.2％。
实施例4.制备仙茅总酚苷仙茅药材10kg，粉碎，按常规用60％乙醇冷浸提取，提取液减压浓缩，浓缩液过滤，滤液通过D101大孔树脂吸附，依次用水及18％乙醇洗脱除去杂质，再用50％的乙醇80L进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，再将其溶于60％甲醇中，经Sephadex LH-20色谱柱，收集洗脱液，浓缩至干，得仙茅总酚苷116g，经HPLC检测其中含仙茅苷24.6％和仙茅苷B 30.8％。
药理试验仙茅总酚苷对去卵巢骨质疏松大鼠的作用骨质疏松症是由于妇女绝经后，卵巢功能减退，雌激素分泌减少，骨吸收大于骨形成，而引起的骨质丢失。临床上常用的治疗方法是雌激素替代疗法。大鼠卵巢切除造成骨质疏松模型是一个常用的模型，较好的模拟了成年妇女雌激素缺乏的临床特性及对雌激素替代疗法的反应。因此，本发明以去卵巢大鼠为模型，观察仙茅总酚苷的抗骨质疏松活性。
1.试验材料与方法1.1动物SD清洁级大鼠，雌性，3月龄，购于上海西普尔比凯实验动物有限公司。
1.2药材及试剂尼尔雌醇，上海华联制药有限公司(批号061008)；DPD(脱氧吡啶)ELISA试剂盒为美国RapidBio公司产品，购于上海轩昊科技发展有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶活性测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.3仪器 自动生化分析仪、外周骨定量计算机断层扫描仪(德国Stratec公司)，酶标仪(美国BIOTECK)。
1.4实验方案药液配制将羧甲基纤维素钠(CMC-Na)用蒸馏水配成0.5％CMC-Na溶液，作为溶剂。分别配制0.1mg/ml的尼尔雌醇溶液以及5mg/ml、10mg/ml和20mg/ml的低、中、高剂量仙茅总酚苷溶液，雌激素类药物尼尔雌醇为阳性对照药。
动物分组将大鼠随机分为6组，假手术组、阴性对照组、阳性对照组(尼尔雌醇1mg/kg)和仙茅总酚苷低(50mg/kg)、中(100mg/kg)和高剂量组(200mg/kg)，每组10只大鼠。假手术组保留卵巢，其余各组均摘除卵巢。
动物试验所有动物在24～28℃，通风良好的条件下饲养，每周称体重一次。各组动物口服给药，每鼠每次按体重1ml/100g，阴性对照组口服0.5％CMC-Na，每天1次，每周6次；阳性对照组口服尼尔雌醇，每周1次；仙茅总酚苷低、中、高剂量组各每天1次，每周6次。12周后，将大鼠用10％水合氯醛麻醉，腹部切开皮肤、肌肉，暴露腹腔，腹动脉取血，分离血清，迅速剥离子宫，称取重量。取出右侧胫骨，剔除附着的肌肉及其它组织，保存于70％的乙醇中，以备测定骨密度。
1.5血清生化指标测定 以全自动生化分析仪测定血清钙、磷、肌酐(Cr)含量和碱性磷酸酶活性。血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性和DPD含量按照试剂盒说明书进行测定。
1.6骨密度测定 胫骨以外周骨定量计算机断层扫描仪(pQCT，德国Stratec公司)在距离胫骨骨骺线3.0mm处检测骨密度和骨含量。
1.7统计学处理组间均值比较采用方差检验。
2.试验结果2.1仙茅总酚苷对去卵巢大鼠子宫重量的影响用激素类药物防治骨质疏松具有刺激子宫、引起子宫内膜癌等副作用，本实验指标为仙茅总酚苷对子宫重量的影响，以观察仙茅总酚苷的副作用。结果见表1表1仙茅总酚苷对去卵巢大鼠子宫重量的影响(n＝10，Mean±SD)
▲与假手术组比较，P＜0.05；△与阴性对照组比较，P＜0.05由表1可见，大鼠去卵巢后，子宫发育受到抑制，阴性对照组比假手术组子宫重量减轻67％。阳性对照组大鼠的子宫重量与阴性对照组相比显著增加，而不同剂量的仙茅总酚苷组与阴性对照组相比无显著性差异。说明仙茅总酚苷对去卵巢大鼠的子宫重量无显著的影响，如果作为抗骨质疏松药物，不会对子宫产生刺激等副作用。
2.2仙茅总酚苷对去卵巢大鼠血清中Ca和P含量的影响表2仙茅总酚苷对去卵巢大鼠血清Ca和P含量的影响(n＝10，Mean±SD)
▲与假手术组比较，P＜0.05；△与阴性对照组比较，P＜0.05血清中的钙、磷含量在某种程度上可以间接反映骨代谢的状况。由表2可见，阴性对照组大鼠血清中钙、磷的含量与假手术组相比显著减少。阳性对照组和仙茅总酚苷中、高剂量组大鼠血清中钙、磷的含量与阴性对照组相比显著增加。说明仙茅总酚苷能增加去卵巢骨质疏松大鼠钙、磷的吸收，促进骨的形成。
2.3仙茅总酚苷对去卵巢大鼠血清碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和脱氧吡啶与肌酐的比值(DPD/Cr)的影响表3仙茅总酚苷对去卵巢大鼠血清碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和DPD/Cr的影响(n＝10，Mean±SD)
▲与假手术组比较，P＜0.05；△与阴性对照组比较，P＜0.05碱性磷酸酶为骨形成的主要指标，抗酒石酸酸性磷酸酶和DPD/Cr为骨吸收的主要指标。由表3可见，阴性对照组血清碱性磷酸酶活性、抗酒石酸酸性磷酸酶活性和DPD/Cr比值与假手术组相比显著升高，尼尔雌醇组与阴性对照组相比显著降低。不同剂量的仙茅总酚苷组血清碱性磷酸酶活性与阴性对照组相比没有显著差异，血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性和DPD/Cr比值与阴性对照组相比显著降低。说明仙茅总酚苷通过抑制骨吸收减少去卵巢骨质疏松大鼠的骨丢失。
2.4仙茅总酚苷对去卵巢大鼠骨密度和骨含量的影响表4仙茅总酚苷对去卵巢大鼠骨密度的影响(n＝10，Mean±SD)
▲与假手术组比较，P＜0.05；△与阴性对照组比较，P＜0.05表5仙茅总酚苷对去卵巢大鼠骨含量的影响(n＝10，Mean±SD)
▲与假手术组比较，P＜0.05；△与阴性对照组比较，P＜0.05由表4可见，阴性对照组大鼠的总骨密度和骨小梁骨密度与假手术组相比显著降低。阳性对照组大鼠的总骨密度和骨小梁骨密度与阴性对照组相比显著增加，中、高剂量的仙茅总酚苷组大鼠骨小梁的骨密度与阴性对照组相比也显著增加。
由表5可见，阴性对照组大鼠的总骨含量、骨小梁骨含量和皮质骨骨含量与假手术组比较显著降低，阳性对照组及中、高剂量的仙茅总酚苷组大鼠的总骨含量和骨小梁骨含量与阴性对照组相比显著增加。说明仙茅总酚苷能够显著减少去卵巢骨质疏松大鼠的骨质丢失，具有防治骨质疏松的作用。
上述实验表明，仙茅总酚苷可增加骨质疏松大鼠钙、磷的吸收，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶的活性和DPD/Cr比值，提高总骨含量及骨小梁的骨含量和骨密度，减少骨质丢失。因此，仙茅总酚苷具有抗骨质疏松的活性，可用于制备防治骨质疏松的药物。
权利要求
1.一种仙茅总酚苷的制备方法，步骤如下(1)制备提取液按常规将粉碎的仙茅药材用30-95％乙醇热提或冷浸，得提取液，提取液减压浓缩，浓缩液过滤，收集滤液；(2)制备仙茅总酚苷粗品上述滤液通过大孔树脂吸附，大孔树脂选自D101、D201、ZTC-1、AB-8或1300-I型大孔树脂，用水或20％以下的含水乙醇洗脱除去杂质，再用30％-90％的含水乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至干，得仙茅总酚苷粗品；(3)纯化将仙茅总酚苷粗品溶于含水甲醇或含水乙醇，经Sephadex LH-20色谱柱，收集洗脱液，浓缩至干，得仙茅苷和仙茅苷B的含量之和≥50％的仙茅总酚苷。
2.权利要求1所述方法制备的仙茅总酚苷。
3.权利要求2所述仙茅总酚苷在制备防治骨质疏松药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是仙茅总酚苷及其制备方法和将仙茅总酚苷用于制备抗骨质疏松药物的用途。将仙茅药材用含水乙醇热提或冷浸得到提取液，采用大孔吸附树脂分离，Sephadex LH－20纯化得仙茅总酚苷提取物。仙茅总酚苷的活性成分主要为仙茅苷和仙茅苷B，二者总含量高达50％以上。动物试验证明仙茅总酚苷能有效防治大鼠骨质疏松症，所以仙茅总酚苷可用于制备防治骨质疏松的药物。
文档编号A61P19/10GK101085114SQ20071004378
公开日2007年12月12日 申请日期2007年7月13日 优先权日2007年7月13日
发明者张巧艳, 曹大鹏, 秦路平, 韩婷 申请人:中国人民解放军第二军医大学