专利名称：褐牙鲆精子快速冷冻保存方法
技术领域：
本发明涉及海水鱼类精子保存方法。
背景技术：
褐牙鲆(尸^^/^/^/^0//^^^)俗称比目鱼，属鲽形目，鲆科、牙 鲆属，是近海暖温性底层鱼类。其自然分布区主要是中国沿海、朝鲜、 日本和俄罗斯的亚洲海区。其适应性强，生长快、个体大、肉质细嫩 鲜美，并有消炎解毒、健脾益气等功效，是名贵的重要海水养殖品种 之一。由于国际市场大量需求，从上世纪80年代末至90年代初，褐 牙鲆遭到大量的捕捞，资源受到严重的破坏。为了弥补资源的不足和 满足市场的需求，在上世纪90年代初，我国引进的欧洲一些品种如 大菱鲆，已成为工厂化海水养殖的主要品种之一。而褐牙鲆是我国土 族种，由于受到过渡捕捞和环境等因素的影响，种质资源越来越少。
现有大菱鲆、牙鲆精子的冷冻保存方法，该方法为精子的稀释 液为MPRS、 TS-19、 TS-2等完全人工配制；抗冻剂为10%浓度的二 甲亚砜(DMSO);降温方法液氮面上6cm处10分钟，液氮面上5 分钟，进入液氮保存。精子活率最高70%。
褐牙鲆精子的冷冻保存关系到我国这种物种保护，但是目前还缺 乏适合褐牙鲆精子快速冷冻保存的方法。现有技术用冰点渗透压仪首 先测出精浆渗透压(mOsm/kg)，根据渗透压进行精子稀释液的配制， 精子稀释液主要采用NaCl、 KC1、葡萄糖等配制，要配制出适合于精 子保存的稀释液需经过反复多次的实验才能获得；抗冻剂用二甲亚砜，二甲亚砜对精子的毒性作用较大，影响精子的保存效果；降温过
程一般应用程序降温仪降温，需配备程序降温仪；保存容器为液氮罐。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种操作简便，适合快速保存 褐牙鲆精子，同时能获得较高精子活率的冷冻保存方法。
本发明的技术方案包括稀释液、抗冻剂、冷冻保护液配制，精子 与保护液混合放入离心管中投入液氮中保存，其特征是将天然海水稀 释，用稀释的海水激活精子，以不能激活精子的稀释海水作为保存精 子的稀释液；采用浓度为14g/100ml乙二醇，或浓度为3g/100ml乙二 醇+浓度为3g/100ml二甲亚砜作为抗冻剂；上述稀释液+抗冻剂作为 冷冻保护液，将冷冻保护液在4t:的恒温箱预冷；精子与冷冻保护液 按1:1或1:1. 5或1:2或1:2. 5或1:3比例均匀混合放入离心管中， 将离心管置于液氮罐口下-2(TC平衡lmin，然后快速投入液氮中保存。
本发明用褐牙鲆生存环境的天然海水稀释作为褐牙鲆精子的稀 释液，避免人工配制精子稀释液要经过多次反复实验才能确定各种离 子成分和离子浓度的烦琐操作，同时人工配制的稀释液由于缺乏一些 天然的微量元素，所以人工配制的稀释液不能完全满足保存精子的需 要，对精子的保存效果不好，影响精子的成活率。现有技术精子保存 采用的抗冻剂是二甲亚砜，而本发明用乙二醇(EG)作为抗冻剂添 加到稀释液中作为抗冻保护液，保存褐牙鲆精子，使褐牙鲆精子冷冻 保存后获得的成活率达到90%以上，成活时间达255s土13.45s。采 用EG (3ml/100ml) +DMSO (3ml/100ml)两种抗冻剂作为组合抗 冻剂，除可以获得较好的冷冻保存效果外(冷冻后精子的成活率达到 90%以上)，两种组合抗冻剂还可以延长冷冻后精子的成活时间，成
活时间长达540s土60s，比单用乙二醇保存的成活时间长285s。本发 明通过液氮罐口下-2(TC平衡1分钟，快速投入液氮保存，步骤简单, 不需要昂贵的程序降温仪，同样达到较好的保存效果。野外操作时只 需配带5-10升的液氮罐和一个保温瓶，就可以进行精子的冷冻保存， 避免了目前野外采集到的精子必须带回实验室才能进行冷冻保存，精 子采集时间过长或长途运输对精子的冷冻保存会造成很大的影响，直 接影响到冷冻精子的成活率。
具体实施例方式
本发明采用褐牙鲆生存环境的天然海水(其盐度为31)稀释， 例如将盐度为31的海水稀释0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 3倍，用稀释的 海水激活精子，以不能激活精子的稀释海水作为保存精子的稀释液， 经低温冷冻保存后，检测精子的成活率来确定最适合冷冻保存的稀释 液，经实验选择稀释1倍海水最适合作为褐牙鲆精子的稀释液；通过 不同抗冻剂、不同浓度对精子冷冻保存效果的比较，确定乙二醇(EG) 作为抗冻剂，浓度为14g/100ml，或EG(3g/100ml)加DMSO(3g/100ml) 作为抗冻剂添加到稀释液中作为褐牙鲆的低温冷冻保护液，将冷冻保 护液置于4'C下预冷，将预冷过的保护液取出，精子与保护液可按 1:1、 1.5、 2、 2.5、 3的比例稀释，按1:15比例稀释的效果最好， 将稀释好的精子装入200W的塑料离心管中，置于液氮罐口下-2(TC 平衡1分钟，然后将其快速投入液氮保存；解冻时离心管快速从液氮 中提出，置于38'C水浴中解冻。采用本方法冷冻保存褐牙鲆精子， 冷冻后精子的活率达90%以上。该方法与保存大菱軤、牙鲆的方法 比较，冷冻后精子的活率提高20%以上，是目前淡水和海水鱼类精子 冷冻保存后获得精子活率最高的方法。
权利要求
1.褐牙鲆精子快速冷冻保存方法，包括稀释液、抗冻剂、冷冻保护液配制，精子与保护液混合放入离心管中投入液氮中保存，其特征是将天然海水稀释，用稀释的海水激活精子，以不能激活精子的稀释海水作为保存精子的稀释液；采用浓度为14g/100ml乙二醇作为抗冻剂；上述稀释液+抗冻剂作为冷冻保护液，将冷冻保护液在4℃的恒温箱预冷；精子与冷冻保护液按1∶1或1∶1.5或1∶2或1∶2.5或1∶3比例均匀混合放入离心管中，将离心管置于液氮罐口下-20℃平衡1min，然后快速投入液氮中保存。
2. 根据权利要求1所述的褐牙鲆精子快速冷冻保存方法，其特征是 采用浓度为3g/100ml乙二醇+浓度为3g/100ml 二甲亚砜替代浓度为 14g/100ml乙二醇抗冻剂。
3. 根据权利要求1或2所述的褐牙鲆精子快速冷冻保存方法，其特 征是采用稀释1倍海水作为褐牙鲆精子的稀释液。
全文摘要
褐牙鲆精子快速冷冻保存方法，涉及海水鱼类精子保存方法，需要提供一种操作简便，快速保存褐牙鲆精子，能获得较高精子活率的冷冻保存方法。本发明包括稀释液、抗冻剂、冷冻保护液配制，液氮中保存，其特征是将天然海水稀释，以不能激活精子的稀释海水作为保存精子的稀释液；采用浓度为14g/100ml乙二醇作为抗冻剂；将稀释液+抗冻剂作为褐牙鲆精子的低温冷冻保护液，将冷冻保护液在4℃的恒温箱预冷；精子与保护液按1∶1至1∶3比例均匀混合放入离心管中，将离心管置于液氮罐口下-20℃平衡1min，然后快速投入液氮中保存。本发明用于冷冻保存褐牙鲆精子。
文档编号A61K35/48GK101342192SQ20071004361
公开日2009年1月14日 申请日期2007年7月9日 优先权日2007年7月9日
发明者冯广朋, 平 庄, 涛 张, 章龙珍, 峰 赵, 闫文罡, 黄晓荣 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所