蜡梅CpSNAC1基因启动子及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体涉及蜡梅cpsnac1基因启动子及其应用。
背景技术：
：蜡梅(chimonanthuspraecoxl.)，落叶丛生灌木，暖地常表现半常绿状，高度达3～4m，花期12月到第2年的3月，远在展叶前开放，果约8月成熟。蜡梅是蜡梅科蜡梅属的一种观赏性极强的树种，素以在寒冬腊月傲雪盛放而名，花朵颜色淡雅，花香扑鼻，沁人心脾，是我国的传统名贵花木，除了具有较高的观赏价值外，还有珍贵的文化价值、药用价值和经济价值。随着现代分子生物技术的发展，对蜡梅的研究已经从传统分类学研究和一些应用价值研究转向了分子水平的研究。nac(nam、ataf1、ataf2和cuc2)转录因子家族是植物基因组中最大的转录因子家族之一，也是植物特有的转录因子。nac家族转录因子的名字取自最早发表的3个具有nac结构域基因的首字母缩写，分别是从矮牵牛上发现的nam基因和从拟南芥上发现的ataf1/2和cuc2基因。植物nac转录因子具有多种功能，对植物的生长发育调控、植物的逆境胁迫应答、调控植物的抗病性、参与植物次生生长调控以及激素信号转导等生理过程中具有重要作用。目前，有关nac基因转录因子的研究已经比较广泛与透彻，但是对其启动子的相关研究并不多。相关研究发现nac家族基因启动子序列中除了含有启动子tata-box、caat-box等基本的组成元件之外，还含有一些特有的与激素、抗逆境、组织器官发育等相关的顺式作用元件，推测对nac转录因子的激活和诱导起到调控作用。技术实现要素：本发明的目的在于为提高蜡梅抗性提供一种新选择。本发明提供了蜡梅cpsnac1基因启动子，其核苷酸序列如seqidno.15第974～1437位所示。进一步的，所述的蜡梅cpsnac1基因启动子，其核苷酸序列如seqidno.15第727～1437位所示。进一步的，所述的蜡梅cpsnac1基因启动子，其核苷酸序列如seqidno.15第215～1437位所示。进一步的，所述的蜡梅cpsnac1基因启动子，其核苷酸序列如seqidno.15所示。本发明还提供了所述的蜡梅cpsnac1基因启动子在调控植物逆境抗性中的用途。具体的，所述的植物为拟南芥或蜡梅。具体的，所述的逆境为激素、高盐、干旱、高温或低温。具体的，所述的激素处理为浓度50μm·l-1脱落酸处理。具体的，所述的高盐为浓度150mm·l-1的nacl处理。具体的，所述的干旱为浓度10％质量分数的peg处理。具体的，所述的高温为42℃。具体的，所述的低温为4℃。本发明的有益效果：本发明首次克隆获得蜡梅cpsnac1基因的启动子，并克隆得到3个cpsnac1启动子缺失片段，通过转基因技术、gus组织化学染色、gus酶活性定量检测等方法初步验证了cpsnac1基因启动子的表达调控特点。通过研究发现，本申请中的启动子与调控植物应对逆境(激素、干旱、高盐、高温、低温)的能力密切相关，该结果可为研究蜡梅逆境胁迫相关调控提供参考。附图说明图1cpsnac1基因启动子序列。图2为cpsnac1pro的序列分析。5utrpy-richstretch：提高转录水平顺式作用元件；aagaa-motif：涉及脱落酸反应的顺式作用元件；abre：涉及脱落酸反应的顺式作用元件；ace：顺式作用元素涉及光响应性；are：厌氧诱导的必须顺式调控元件；atct-motif：涉及光响应性的保守的dna模块的一部分；auxrr-core：参与生长素反应的顺式作用调控元件；box4：涉及光响应性的保守的dna模块的一部分；boxi：光响应元件；box-w1：真菌诱发剂反应元件；caat-box：启动子和增强子区域中常见的顺式作用元件；cat-box：与分生组织表达相关的顺式作用调节元件；catt-motif：部分光应答元件；ce3：参与aba和vp1反应的顺式作用元件；cgtca-motif：顺式作用的调节元素涉及meja反应；g-box：涉及光反应性的顺式作用调节元件；g-box：涉及光反应性的顺式作用调节元件；ga-motif：部分光应答元件；gare-motif：赤霉素反应元件；gcn4_motif：涉及胚乳表达的顺式调节元件；i-box：部分光应答元件；mbs：myb结合位点涉及干旱诱导性；o2-site：参与玉米醇溶蛋白代谢调控的顺式作用调控元件；p-box：赤霉素应答元件；skn-1_motif：胚乳表达所需的顺式作用调节元件；sp1：光响应元件；tata-box：核心启动子元件在-30左右的转录起始点；tc-richrepeats：涉及防御和应激反应的顺式作用元件；tca-element：涉及水杨酸反应性的顺式作用元素；tga-element：生长素反应元件；tgacg-motif：顺式作用的调节元素涉及meja反应；circadian：参与昼夜节律控制的顺式作用调控元件。图3为cpsnac1基因启动子结构示意图，红色箭头表示缺失分段位置。tca:涉及水杨酸反应性的顺式作用元素；abre：涉及脱落酸反应的顺式作用元件；circadian：参与昼夜节律控制的顺式作用调控元件；p-box：赤霉素应答元件；tc-rich：涉及防御和应激反应的顺式作用元件；auxrr-core：参与生长素反应的顺式作用调控元件；mbs：myb结合位点；cgtca：顺式作用的调节元素涉及meja反应；gare：赤霉素反应元件；tgacg：顺式作用的调节元素涉及meja反应；cat-box：与分生组织表达相关的顺式作用调节元件；ce3：参与aba和vp1反应的顺式作用元件。图4为cpsnac1基因启动子各缺失分段示意图。图5为cpsnac1pro/cpsnac1pro-d1/d2/d3的瞬时活性检测。agrobactertumgv3101blank：农杆菌gv3101空菌株；35spromotercontrolpcambial1305：含camv35s启动子的pcambial载体；cpsnac1promotercpsnac1pro：cpsnac1启动子全长；cpsnac1-d1promotercpsnac1pro-d1：cpsnac1启动子缺失片段d1；cpsnac1-d2promotercpsnac1pro-d2：cpsnac1启动子缺失片段d2；cpsnac1-d3promotercpsnac1pro-d3：cpsnac1启动子缺失片段d3。图6为cpsnac1pro/cpsnac1pro-d1/d2/d3转基因拟南芥1-10d萌发化学染色。wt：野生型拟南芥；1305：转pcambia空载体的拟南芥。图7为转cpsnac1基因启动子及其各缺失分段拟南芥组织化学染色。图a～d分别为cpsnac1pro、cpsnac1pro-d1、cpsnac1pro-d2和cpsnac1pro-d3转基因拟南芥各组织化学染色；a～l分别是花簇、花朵、花瓣、花萼、花蕊、花柱、茎、果荚、莲座叶和茎生叶。图8为cpsnac1pro转基因拟南芥非生物胁迫处理后gus基因的表达分析。图9为bsa标准曲线。图10为4-mug标准曲线。图11为不同诱导好胁迫处理后的cpsnac1pro、cpsnac1pro-d1、cpsnac1pro-d2和cpsnac1pro-d3转基因拟南芥gus酶活性测定。a:50μm·l-1aba；b:150mm·l-1nac；c:10％peg；d:4℃低温；e:42℃高温。图12为cpsnac1pro、cpsnac1pro-d1、cpsnac1pro-d2和cpsnac1pro-d3转基因拟南芥个组织gus酶活测定。图13为cpsnac1编码的蛋白与其他物种的nac蛋白的多序列比对结果。序列来源于ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)：zmnac1(genbankid:pwz31933)、gmnac1(genbankid:np_001240958)、anac072(genbankid:oao97067)、ataf1(genbankid:caa52771)、ataf2(genbankid:aam65967)、gmnac4(genbankid:np_001238424)、nnnac2(genbankid:xp_010268987)图14为cpsnac1编码蛋白的蛋白聚类分析。具体实施方式实施例1蜡梅cpsnac1基因的分离用trizol法提取蜡梅叶片总rna，通过反转录合成cdna。根据蜡梅花转录组数据库库中已知的序列片段，用软件primerprimer5.0设计特异引物进行pcr扩增，引物序列如下：nac1-orf-f：5'-gttgtgaggcgcatttcttgcgt-3'(seqidno.3)nac1-orf-r：3'-gcttctgctctacatgctcttcctc-5'(seqidno.4)以蜡梅cdna为模板，扩增蜡梅cpsnac1基因，pcr反应体系及反应条件如下：ddh2o17.8μl，10×hifitaqpcrbufferⅱ2.5μl，dntp(10mm)1.5μl，snac1-orf-f(10μm)1μl，snac1-orf-r(10μm)1μl，蜡梅cdna1μl，takaraextaqtm0.2μl。94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。将pcr产物回收后连接到pmd19-t载体，转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑取重组子进行测序，蜡梅cpsnac1基因cdna序列如seqidno.1所示。注：本步所用的trizol试剂，rt-pcrkit反转录试剂盒、extaq酶、hifitaq酶、pmd19-t载体均购自日本takara公司(大连)；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、dna分子量标准dl2000购自天根生化科技(北京)有限公司；大肠杆菌感受态top10由西南大学园林花卉研究所自制。cpsnac1基因的cdna全长为1008bp，包含891bp的最大开放阅读框，编码297个氨基酸。在ncbi数据库进行blastp对比(图13)，结果显示蜡梅cpsnac1基因编码蛋白(seqidno.2)与拟南芥ataf1、ataf2，大豆gmnac2，玉米zmnac1蛋白序列具有较高的同源性。构建进化树分析发现(图14)，cpsnac1属于snac亚家族，在遗传性距离上，cpsnac1与大豆gmnac2、拟南芥ataf1的进化距离较近，ataf1、gmnac2及zmnac1等基因已经被证明具有胁迫响应功能。实施例2蜡梅cpsnac1启动子的克隆1蜡梅基因组dna的提取利用ctab法提取蜡梅基因组总dna。(1)取0.1g蜡梅幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉末，移入1.5ml离心管；(2)加入750μl、65℃预热的ctab提取液，迅速涡旋混匀；(3)65℃水浴，裂解45min，每隔15min轻轻摇动一次。(4)取出，冷却后在通风橱中加入等体积氯仿异戊醇(24:1)，轻柔颠倒混匀，静止10min；(5)12,000rpm、4℃离心10min；(6)取上清，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，置于冰上30min，出现白色絮状沉淀；(7)12,000rpm、4℃离心10min；(8)去上清，用75％乙醇漂洗2～3次，再用1ml无水乙醇漂洗一次；(9)将沉淀置于超净工作台上或者64℃以下恒温箱干燥，直至半透明状；(10)用50μlte或者灭菌的超纯水溶解，取1μldna用德国公司生产的核酸蛋白测定仪测定的浓度，-20℃放置备用。2染色体步移法扩增cpsnac1基因上游序列(1)引物设计利用研究室构建的蜡梅花转录组数据库(sra,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/traces/sra.登录号sra106143)获得cpsnac1unigene片段，根据所获得的unigene序列通过racepcr分别获得5’-utr和3’-utr，经过序列拼接后，得到完整cdna序列。cpsnac1基因的cdna全长为1008bp，该基因cdna含有一个871bp编码297个氨基酸的开放阅读框。以该基因871bp的开放阅读框为基础，利用基因步移法扩增未知片段原则，运用软件primerpremier5.0，设计2条下游特异引物进行pcr扩增，引物序列如下：nac1-sp1：5'-gctcttcctccatctcattctccctgc-3'(seqidno.5)nac1-sp2：5'-gaacagcaatcggttgtgaggcg-3'(seqidno.6)(2)基因组步移酶切模板的构建基因组dna步移文库参照genomewalkertmuniversalkit中的说明书进行。取蜡梅基因组dna各1μg，分别采用draⅰ、ecorⅴ、pvuⅱ和stuⅰ4种平末端酶消化，然后将酶切产物进行纯化处理，然后用t4-dna连接酶(takara，大连)将产物与试剂盒的上、下游基因组步移衔接头在16℃水浴中进行过夜连接，构建了4个基因组步移文库，蜡梅基因组dna的draⅰ、ecorⅴ、pvuⅱ和stuⅰ酶切模板。(3)pcr反应采用两轮巢式touch-downpcr，反应体系(25μl)。以nac1-sp1和针对衔接头序列的引物ap1(universalgenomewalkertm2.0usermanual试剂盒)进行第一轮pcr扩增：10×buffer2.5μl，2.5mmdntp0.5μl，引物ap1(10μmol/l)0.5μl，引物sp1(10μmol/l)0.5μl，taqdna聚合酶0.5μl，模板1.0μl，ddh2o19.5μl。将第一轮产物稀释50倍，作为第二轮反应的模板。以nac1-sp2和针对衔接头序列的引物ap2(universalgenomewalkertm2.0usermanual试剂盒)进行第二轮pcr扩增：10×buffer2.5μl，2.5mmdntp0.5μl，引物ap2(10μmol/l)0.5μl，引物sp2(10μmol/l)0.5μl，taqdna聚合酶0.5μl，模板1.0μl，ddh2o19.5μl。pcr扩增条件：94℃25sec，72℃3min，第一轮7个循环；94℃25sec，67℃3min，第一轮32循环；67℃10min。94℃25sec，72℃3min，第一轮5个循环；94℃25sec，67℃3min，第一轮20循环；67℃10min。将pcr产物回收后连接到t载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取重组子进行测序，测序结果运用dnastar软件进行分析。将所得的蜡梅cpsnac1基因上游启动子序列用在线启动子序列分析软件plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)和place(http://www.dna.affrc.go.jp/place)进行分析，寻找该启动子保守区域中潜在的转录调控元件。结果显示，通过染色体步移法，从蜡梅基因组中扩增到cpsnac1基因上游1437bp的启动子序列(seqidno.15)。该启动子序列含有大量的tata-box、caat-box等启动子基本元件和植物基因相关的光答应元件，以及提高转录水平的5’utrpy-richstretch，脱落酸响应元件abre、水杨酸响应元件tca-element、生长素响应元件auxrr-core、赤霉素响应元件gare-motif、涉及干旱的myb结合位点mbs以及防御和应激的响应元件tc-richrepeats等(图2)。3cpsnac1基因启动子缺失片段的克隆根据已知的cpsnac1基因启动子序列的顺式作用元件分析，对其进行缺失分段(图3)。于cpsnac1编码区起始密码子上游约1228bp，742bp，471bp处设计正向引物，反向引物与上节cpsnac1基因启动子全长序列反向引物相同，命名为cpsnac1-d1-f，cpsnac1-d2-f，cpsnac1-d3-f，cpsnac1-nco1-r。所获得的缺失序列与全长序列的对比示意见图4，cpsnac1基因启动子特异引物设计如下：cpsnac1-d1-f:aactgcagcaagtagggctaaataacccatttacc(pstι酶切位点)(seqidno.7)cpsnac1-d2-f:aactgcagatgttgttgcacgagcgatcaat(pstι酶切位点)(seqidno.8)cpsnac1-d3-f:aactgcaggttttccaacacgagccctctct(pstι酶切位点)(seqidno.9)cpsnac1-nco1-r：catgccatgggaacagcaatcggttgtgaggc(ncoι酶切位点)(seqidno.10)以pmd19-t-cpsnac1质粒为模板，用taq酶进行pcr扩增。pcr反应体系反应体系如下：ddh2o18.6μl，10×toqtaqbuffer2.5μl，2.5mmdntp1.5μl，cpnac1-nco1-r(10μmol/l)1.0μl，cpnac1-d1/d2/d3-f(10μmol/l)1.0μl，toqtaqdna聚合酶0.2μl，质粒0.2μl。pcr扩增条件：cpnac1-d1：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min20s，28个循环；72℃延伸10min。cpnac1-d2：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。cpnac1-d3：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，28个循环；72℃延伸10min。注：本步使用的dna提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；基因步移法试剂盒(universalgenomewalkertm2.0usermanual)、draⅰ、ecorⅴ、pvuⅱ和stuⅰ酶购自日本takara公司(大连)。将pcr产物回收后连接到t载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取重组子进行测序。测序后最终获得cpsnac1基因启动子各分段序列序列1223bp、711bp、464bp，命名为cpsnac1pro-d1/d2/d3。实施例3蜡梅cpsnac1启动子植物表达载体的构建1表达载体的构建和验证根据cpsnac1启动子序列和植物表达载体特性，选用植物表达载体1305，它是一个双元载体，含有gus基因系统和camv35s启动子。为了研究cpsnac1基因启动子的功能，用其替换植物表达载体1305中的35s启动子，与gus报告基因融合，构建植物表达载体。用psti和ncoi分别双酶切通过pcr扩增所得的cpsnac1基因启动子及各缺失片段和1305载体，分别回收酶切产物后进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌top10，pcr和酶切鉴定阳性克隆，送测序，并命名为pcambial1305-cpsnac1、pcambial1305-cpsnac1-d1/d2/d3。将阳性质粒用电转法转入农杆菌gv3101，经pcr初步鉴定阳性菌落后提取其质粒进行酶切鉴定。双酶切及连接：用psti和ncoi限制性内切酶分别对cpsnac1，cpsnac1-d1，cpsnac1-d2，cpsnac1-d3中间载体和植物载体1305质粒进行双酶切。双酶切体系：10×greenbuffer2.5μl，psti0.5μl，ncoi0.5μl，cpsnac1/13055μl，ddh2o11.5μl。37℃酶切4h后，80℃灭活5min。进行琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，用胶回收试剂盒回收目的片段。然后将回收得到的1305表达载体和cpsnac1，cpsnac1-d1，cpsnac1-d2，cpsnac1-d3片段，以1:8左右的比例，按照t4dna连接酶说明书进行连接反应，4℃过夜连接。连接反应体系：1305表达载体片段7.5μl，cpsnac1启动子片段1.2μl，10×t4dnaligasebuffer1.0μl，t4dnaligase0.3μl。将连接产物转化大肠杆菌top10感受态细胞，涂布在含50mg/lkan的lb平板上37℃倒置过夜培养，挑取单菌落摇菌培养后进行pcr鉴定，将电泳检测为阳性的菌液活化后提取质粒进行双酶切验证。最后再将pcr鉴定和双酶切验证均正确的阳性质粒送测序，确定无碱基突变后，命名为1305-cpsnac1，1305-cpsnac1-d1，1305-cpsnac1-d2，1305-cpsnac1-d3，即为cpsnac1基因植物表达重组载体。2表达载体转化农杆菌运用电转法将表达载体转入农杆菌gv3101中。(1)先将电击杯置于75％的酒精中浸泡2h，然后用无菌水冲洗3次，再用无水乙醇浸泡冲洗3次，再将电击杯置于超净工作台上吹干后置于冰上预冷。(2)从-80℃冰箱取出农杆菌感受态细胞gv3101，置于冰上解冻。(3)取1μl质粒加入到100μl解冻的感受态细胞中，用枪头轻柔抽打混匀后冰上静置30min。(4)组装电转化仪，并将其置于超净工作台上，打开仪器电源开关，将电压调至2240v。(5)用移液枪将感受态细胞与重组质粒的混合物全部转移至电击杯凹槽中，擦干外壁。(6)将电击杯放入电转化仪中，电击，听到一声蜂鸣声后，取出电击杯中，加入800μl预冷的无抗yeb液体培养基，轻轻抽打混匀。用移液枪将其转移到1.5ml的无菌离心管中。(7)置于28℃摇床中，180rpm遮光振荡培养3～4h。(8)吸取10μl菌液，用无菌涂棒将其均匀涂抹于yeb(含50mg/lkan和50mg/lgen)平板培养基上，于28℃恒温、黑暗条件下倒置培养36～48h。(9)挑取单菌落，置于28℃摇床黑暗培养24～36h，进行pcr鉴定。阳性克隆可用于转化烟草或者拟南芥，或者加入终浓度20％的甘油，置于-80℃超低温冰箱保存。注：本步使用的农杆菌感受态gv3101、表达载体pcambia1305.1由西南大学园林花卉研究所保存；t4dna连接酶、extaq酶、top聚合酶均购自日本takara公司(大连)。实施例4蜡梅cpsnac1启动子及其缺失序列发育时空表达特性和诱导表达特性分析1花序侵染法转化拟南芥(1)拟南芥的播种及培养取适量拟南芥种子于1.5ml离心管中，并向离心管中加入16.7％浓度的次氯酸钠(naclo)消毒8～10min(期间充分振荡)，用枪头将上层的naclo溶液洗掉，然后无菌水将种子冲洗4～6次，再用移液枪将拟南芥的种子播种在ms培养基上，4℃春化3d后将平板置于16h光照，8h黑暗，2000lux照明条件，以及22℃、70％湿度的环境下培养，约12d左右将拟南芥移栽至培养基质中(蚯蚓土：蛭石：草炭＝1:1:1)，待拟南芥生长到花葶长度约5cm左右时进行侵染。(2)花序侵染法转化拟南芥①在yeb+kan50mg/l+gen50mg/l培养基平板上活化含有植物超表达载体质粒的农杆菌，28℃暗培养36～48h。②挑取单菌落接种到650μlyeb(kan：50mg/l，gen：50mg/l)液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h。③对培养的农杆菌菌液用特异引物进行pcr鉴定，确定正确后取500μl上述菌液接种于25ml无抗的yeb液体培养基上，28℃，200rpm振荡培养至od600为0.8～1.0之间备用。④吸取10ml上述菌液于无菌离心管，28℃，5000rpm离心15min，倒掉上清，收集沉淀，然后用现配侵染液(无菌水+5％蔗糖+0.5‰l-77)重悬，稀释至od600约为0.8。⑤初次侵染要剪去拟南芥植株上面已开放的花朵，只留下刚刚露白的花蕾，此外可以在处理前一天浇水以保持基质的湿度，侵染前也需要用喷壶将纸箱四壁喷湿。将花葶头大约0.5cm长度放入到浸入侵染液中10秒左右，取出放入纸箱中，避光，于22℃培养20h后取出，然后转移到正常的生长环境中。⑥侵染1周后可进行二次侵染以提高转化效率。2转基因拟南芥的潮霉素抗性筛选及鉴定2.1转基因潮霉素hyg筛选和pcr检测(1)在转化拟南芥1个月后，收取成熟的t0代种子，放在37℃恒温烘箱中约15d后，放于4度冰箱存储，用于后续实验。(2)将t0代转基因种子进行消毒后，播种于含25mg/lhyg的ms平板上，密封后于4℃冰箱春化3d，然后转移到正常环境下培养，转基因拟南芥可以在含hyg的培养基上正常生长。(3)得到若干不同株系，并对各株系的t1、t2代种子继续筛选，直至所有株系收获的种子播种后都为绿色抗性苗即可进行后续处理实验。以阳性植株的dna作为模板,进行pcr检查，确认转基因植株中是否有插入的目的片段。2.2转基因拟南芥gus化学染色检测对经潮霉素抗性筛选获得的转基因拟南芥植株进行gus组织化学染色鉴定以野生型拟南芥植株为阴性对照，转1305空载体的转基因拟南芥植株为阳性对照。(1)染色：取播种12d大小的拟南芥幼苗于1.5ml离心管中，加入配制好的gus染液，使之完全淹没材料，置于37℃恒温箱中避光过夜染色。(2)脱色：取出样品，吸除染液，加入75％的乙醇进行脱色，脱色2～3次，至阴性对照为白色。(3)观察鉴定：用实体显微镜观察转化材料的gus染色结果，并照相记录结果。3cpsnac1基因启动子及各缺失片段在烟草叶片中瞬时表达以gv3101空菌株为阴性对照，含camv35s启动子1305菌株为阳性对照，利用农杆菌介导法分别转化烟草，进行gus瞬时表达鉴定。(1)农杆菌侵染液的准备①从-80℃超低温冰箱取出成功转化的阳性农杆菌菌液、gv3101空菌株以及含1305载体的菌株，待解冻后，用灼烧灭菌冷却后的接种环沾取少量菌液，分别接种于含有50mg/lkan和50mg/lgen的yeb固体培养基平板上，置于28℃、黑暗条件下倒置培养36～48h。②挑取大小合适的单菌落接种于25ml含有50mg/lkan和50mg/lgen的yeb液体培养基中，置于28℃恒温黑暗条件下振荡培养24～36h。③取上述培养好的菌液按1:50接种于yeb无抗液体培养液中，28℃，200rpm避光振荡培养，进行二次活化。④当菌液od600＝0.6～0.8时，停止振荡培养，分别取8ml培养好的菌液和30mlms1液体培养基于无菌培养瓶中，混匀备用，该混合液即为用于侵染烟草所用的侵染液。(2)植物材料准备：选取生长健壮的烟草无菌组培苗叶片，用锋利的无菌手术刀片切成1cm左右的叶块，并弃去中脉。(3)侵染：将新制备的叶块分别置于已准备好的上述三种农杆菌侵染液中，遮光浸泡10min，该过程中轻轻晃动组培瓶使叶块与侵染液充分接触。(4)共培养：取出叶块,置于无菌滤纸上吸去多余的菌液。并将侵染过的叶块转移到ms2培养基上，叶块的背面朝下放置，25℃倒置暗培养2～3d。(5)脱菌：将共培养后的烟草叶片转移到ms3液体脱菌培养基中，避光脱菌30min，期间轻轻晃动培养瓶，使叶块与脱菌液完全充分接触，之后将叶片置于无菌滤纸上吸除多余的液体。(6)重复步骤(5)。(7)将叶块置于无菌水中冲洗3次，每次10min，再用无菌滤纸吸干多余液体。(8)gus瞬时染色检测：随机抽取处理好的叶块进行gus染色分析，将待测植物组织置于1.5ml离心管中，加入gus染色液，置于37℃烘箱过夜后，用75％的乙醇进行脱色处理，脱色处理2～3次，每次10min，至阴性对照为白色时用实体显微镜进行观察，并照相记录结果。4转基因拟南芥的gus组织化学染色分析(1)取播种后1～10d发芽过程的拟南芥于1.5ml离心管中，加入配制好的组织化学gus染液，置于37℃恒温箱中过夜染色。用75％乙醇脱色2～3次，然后在体式显微镜下观察拍照，同时以野生型拟南芥作为阴性对照，转1305载体作为阳性对照。(2)为了研究cpsnac1启动子驱动gus基因在拟南芥植株中的各组织表达特异性，采集成年转基因拟南芥植株的根、茎、叶、花级果进行gus组织化学染色分析。(方法同上)。5cpsnac1pro转基因拟南芥非生物胁迫gus基因荧光定量分析为了研究启动子在翻译水平上对不同诱导的响应情况，在ms培养基播种需要处理的各个株系，10d时选择长势大致一致的健壮转基因拟南芥，分别移入含有50μm·l-1的aba、150mm·l-1nacl、10％peg的ms培养基培养24h，在选取长势大致一致的健壮转基因拟南芥放入42℃高温和4℃低温人工气候箱处理6h和24h，各组实验设置3个重复。处理后取样提取rna，反转为cdna进行荧光定量pcr检测，分析cpsnac1启动子是否受激素诱导。选用拟南芥actin基因作为内参基因，设计内参基因和gus基因，引物序列见表2。表2引物序列采用trizol试剂提取总rna，反转录得到cdna第一链。以cdna为模板，采用evagreen染料法进行荧光定量pcr，3次技术重复。实验按照ssofasttmsupermix试剂盒(bio-rad)说明书进行，对转基因植株不同非生物胁迫下幼苗叶片中的表达情况进行实时荧光定量pcr分析。试验所得的数据用bio-radmanagertmsoftware(version1.1)分析，用法计算cpsnac1启动子启动下游gus基因在不同材料中的相对表达量。反应体系如下：2×ssofastevagreensupermix5μl，primer-f(10μm)0.5μl，primer-r(10μm)0.5μl，cdna模板0.5μl，rnasefreedh2o3.5μl。6转基因拟南芥各组织及非生物胁迫下gus蛋白定量检测采集成年转基因拟南芥植株的根、茎、叶、花及果荚进行gus酶活性检测，同时为了研究启动子对不同诱导的响应情况，在ms培养基播种需要处理的各个株系，10d时选择长势大致一致的健壮转基因拟南芥，分别移入含有50μm·l-1的脱落酸(aba)、150mm·l-1nacl、10％peg(模拟干旱)的ms培养基培养48h，在选取长势大致一致的健壮转基因拟南芥放入42℃高温和4℃低温人工气候箱处理6h和24h，处理后分别对其进行gus蛋白的定量检测。利用varioskanflash全波长扫描式多功能读数仪(多功能酶标仪)，根据bradford(1976)法进行总蛋白含量的测定，li等(2009)的方法进行gus酶活性的测定。(1)蛋白标准曲线的制备利用改良型bradford法蛋白质浓度测定试剂盒取7支1.5ml离心管，按表3制作bsa蛋白浓度梯度：表3反应体系去离子水(μl)1000995990985980975970bsa蛋白标准液(μl)051015202530蛋白质终浓度(μg/ml)051015202530混匀后，在多功能酶标仪上测定595nm处的光吸收值，制作标准曲线。(2)4-mu标准曲线的制作用4-mu和反应终止液根据表4配制4-mu梯度浓度液：表4反应体系1μm4-mu(μl)062.51252505001000反应终止液(μl)1000937.58757505000终浓度(nm)062.51252505001000混匀后，运用多功能酶标仪在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下，测定各样品的荧光值，绘制标准曲线。(3)gus蛋白提取取100mg新鲜植物样品，采用液氮研磨的方式将其磨成粉末，立即收集到1.5ml离心管中，加入600μlgus提取缓冲液，充分混匀后于12,000rpm，4℃离心10min，取上清于4℃冰箱保存备用。(4)样品蛋白含量的测定具体操作步骤参照改良型bradford法蛋白质浓度测定试剂盒说明书：①分别取各样品蛋白上清10μl于1.5ml离心管中，加水至500μl后混匀。②取按表3-3配制的0～30μg/ml的蛋白质溶液及①中样品稀释液各150μl，按顺序依次加入酶标板孔中。③再向各孔中加入150μlbradford试剂，立即振荡混匀。④混匀后，于室温静置10min，期间需振荡混匀2次。⑤10min后，在酶标仪上测定各样品的a595值。⑥重复步骤②～⑤2次，并计算出各样品的a595平均值。⑦以0～30μg/ml的蛋白质溶液的a595平均值为纵坐标，对应蛋白质浓度为横坐标，利用microsoftexcel软件绘制标准曲线。⑧根据样品稀释液a595平均值，在标准曲线上确定出各样品稀释液的蛋白质浓度。⑨根据公式：样品蛋白质浓度(μg/ml)＝样品稀释液蛋白质浓度×50(样品稀释倍数)来计算各样品的蛋白质浓度。(5)gus酶活性的测定取100μl含gus的上清，加入到500μl在37℃预热的mug(2mmol/l)溶液中，迅速充分混匀后立即取出50μl混合液加入到950ul反应终止液(0.2mol/lna2co3)中，作为酶促反应的0点。此后在15min、30min、45min和60min时分别取出50μl反应液，加入到950ul的终止液中终止反应。用多功能酶标仪在365nm处的激发波长和455nm处的发射波长下，测定各样品不同时间点的荧光值。以野生型拟南芥作为阴性对照，转化1305载体的转基因拟南芥为阳性对照，各样品均设置3个重复，在4-mu标准曲线上查出各样品的4-mu含量，最终各样品的荧光值取其平均值。(6)酶活力计算根据各样品的光吸收值及对应荧光值求出单位时间内的gus酶活性，gus酶活力以每分钟每毫克蛋白酶活力表示(pmol·mg-1·min-1)。注：实验所用改良型bradford法蛋白质浓度测定试剂盒、x-gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronicacid)购自上海生物工程有限公司；4-mu、4-mug来自sigma公司产品；varioskanflash全波长扫描式多功能读数仪(多功能酶标仪)来自thermoscientific公司。用于瞬时表达转化的烟草(nicotianatabacuml)组培苗、转化所用拟南芥的基因型为哥伦比亚系(columbia，co1)由西南大学园林花卉研究所提供。在烟草叶片中的瞬时表达结果显示，转camv35s启动子和转化pcambia1305-cpsnac1，pcambia1305-cpsnac1-d1，pcambia1305-cpsnac1-d2，pcambia1305-cpsnac1-d3的烟草叶片gus化学组织染色后均有蓝色斑点呈现，而阴性对照没有蓝色斑点(图5)，表明cpsnac1基因启动子及其缺失序列cpsnac1pro-d1、cpsnac1pro-d2和cpsnac1pro-d3都可驱动报告基因gus表达。对cpsnac1基因启动子及其缺失序列转基因拟南芥种子萌发时期及成熟植株各组织进行gus化学染色分析，结果如图，种子萌发时期各组织均能染上色(图6)，成熟植株的根，茎，叶和花均能染上色，种子不能染上色(图7)。结果表明，cpsnac1启动子及其缺失序列均具有驱动拟南芥从种子萌发至生长的整个进程中gus基因表达的能力，无组织特异性。对cpsnac1pro序列各处理前后的幼苗进行实时荧光定量pcr检测序列gus基因表达。结果显示在aba、nacl和peg处理后gus基因表达量上调，4℃低温和42℃高温处理后gus基因表达量降低(图8)。根据上述表3中配制的bsa蛋白标准液浓度梯度，运用改良型bradford法蛋白质浓度测定试剂盒，在多功能酶标仪上测定595nm处的光吸收值。以bsa蛋白标准液浓度为横坐标，以a595吸光值为纵坐标，绘制蛋白质浓度标准曲线(图9)。蛋白浓度标准曲线的方差r2＝0.9859，接近于1，说明样品蛋白质浓度与595nm处的光吸收值具有相关性，可以根据该标准曲线上的公式计算出某光吸收值的溶液中的蛋白浓度。根据表4狭缝10nm下的荧光强度。以吸光值为纵坐标，4-mu浓度(μm)为横坐标，绘制标准曲线(图10)。荧光标准曲线的r2＝0.9924，接近于1，说明可以根据这个标准曲线的公式计算出相对荧光强度所对应的4-mu的浓度。对cpsnac1基因启动子及其各缺失序列aba、nacl、peg、4℃低温和42℃高温处理后的幼苗提取gus蛋白进行酶活检测，结果显示cpsnac1pro、cpsnac1pro-d1片段在aba、nacl和peg处理后gus酶活性升高，在高温和低温处理后gus酶活性降低；cpsnac1pro-d2片段在5个不同胁迫处理后gus酶活性均升高；cpsnac1pro-d3片段在aba处理后gus酶活性升高，在nacl处理后酶活几乎没变化，在peg、高温和低温处理后酶活性均降低(图11)。对cpsnac1基因启动子及其各缺失序列成年植株的、根、茎、叶、花、果进行gus酶活性检测，结果显示不同片段的各个组织的gus酶活性不一样，但在各个组织均有gus酶活性，且在根中的活性是最高的。cpsnac1pro-d2片段在所有片段中gus酶活性是最高的(图12)。cpsnac1pro-d3片段在peg胁迫下受到抑制很有可能与该片段内不含与myb干旱结合位点相关的顺式作用元件有关，在cpsnac1pro-d3片段中顺式作用元件较少与胁迫相关的元件只含有aba响应元件不含有防御和应激响应元件tc-richrepeats，所以只在aba处理下gus酶活性升高而nacl处理下gus酶活性没有变化。高低温下只有cpsnac1pro-d2片段gus酶活性是升高的，且该片段gus染色颜色最深，是所有片段gus酶活性最高的一个片段，推测cpsnac1pro-d2片段对cpsnac1基因启动子的活性具有重要影响。由此，可推测cpsnac1基因启动子受逆境胁迫诱导能影响下游基因的表达水平，且cpsnac1pro-d2片段对cpsnac1基因启动子的活性具有重要影响。序列表<110>西南大学<120>蜡梅cpsnac1基因启动子及其应用<160>15<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1007<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gcagtggcagactcacatagcagattatagaagaaagaagaagaagaagaagaagaagat60gagttgtaatttgcagctgcctcctggttttagatttcacccaacagatgaggaattggt120actgcactatttatgcaagaaatgcgcctcacaaccgattgctgttcctataattgcaga180gattgatctttataaatatgatccttggcaacttcctggaaaggctctttatggagaaaa240ggaatggtacttcttctctccgagggaccggaagtatccgaacgggtcaaggcccaatcg300ggctgcagcgaccggatattggaaggccaccggagccgataagccaattaggcccagtgg360aagtctaaagcctgttggaatcaagaaggccctggtcttttatgctggaaaggccccaaa420gggtgaaaagtccaactggatcatgcacgaatacaggcttgcagatgttgatcgctctgc480taggaagaaaaatagtctaaggctggacgattgggtgttgtgtaggatctacaacaaaaa540atggggtttggaaggaaagcaaccaaaatccagcatcaaatgcagggagaatgagatgga600ggaagagcatgtagagcagaagcctgaacttcttacaaatgcccatcaacccatgactcc660cattctcaacgatttcacctacttcgactcggccgattccatacccaggctacaactcac720cgattccagctgctcggagcacgtggtttcccccgagttcacctgcgaaagggaggtcca780gagccagccaaagtggaagagagactggaacaacaccctccacatccctcccattaacaa840catggatgccaccaatccctttagtcagatggacggtgtggagctttctccacttttccg900aattccgtcattacaggacatatccatgtacttgcagaagccattctgattgattctatg960ggccatcctatttctattctttcatatgagccaaccacacatatcac1007<210>2<211>296<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2metsercysasnleuglnleuproproglypheargphehisprothr151015aspglugluleuvalleuhistyrleucyslyslyscysalasergln202530proilealavalproileilealagluileaspleutyrlystyrasp354045protrpglnleuproglylysalaleutyrglyglulysglutrptyr505560phepheserproargasparglystyrproasnglyserargproasn65707580argalaalaalathrglytyrtrplysalathrglyalaasplyspro859095ileargproserglyserleulysprovalglyilelyslysalaleu100105110valphetyralaglylysalaprolysglyglulysserasntrpile115120125methisglutyrargleualaaspvalaspargseralaarglyslys130135140asnserleuargleuaspasptrpvalleucysargiletyrasnlys145150155160lystrpglyleugluglylysglnprolysserserilelyscysarg165170175gluasnglumetgluglugluhisvalgluglnlysprogluleuleu180185190thrasnalahisglnprometthrproileleuasnaspphethrtyr195200205pheaspseralaaspserileproargleuglnleuthraspserser210215220cyssergluhisvalvalserprogluphethrcysgluarggluval225230235240glnserglnprolystrplysargasptrpasnasnthrleuhisile245250255proproileasnasnmetaspalathrasnpropheserglnmetasp260265270glyvalgluleuserproleupheargileproserleuglnaspile275280285sermettyrleuglnlysprophe290295<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gttgtgaggcgcatttcttgcgt23<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcttctgctctacatgctcttcctc25<210>5<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gctcttcctccatctcattctccctgc27<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gaacagcaatcggttgtgaggcg23<210>7<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7aactgcagcaagtagggctaaataacccatttacc35<210>8<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aactgcagatgttgttgcacgagcgatcaat31<210>9<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9aactgcaggttttccaacacgagccctctct31<210>10<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10catgccatgggaacagcaatcggttgtgaggc32<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11catcctctgggaaccactgaac22<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12catcacattgctcgcttcgtt21<210>13<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gttatggttgggatgggacagaaag25<210>14<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gggcttcagtaaggaaacagga22<210>15<211>1437<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15gagagttggatgatgagaagaagatatttcatctattggggtccacattggccattgtta60tttgtcgggcgttaatgtaatctatgtgggcccacgtatgatgtcgttgaattgaaagat120ctaaattcatgcatttgaaaggagaaaaaaaccaatgttggccaaaaggataccttttct180tcaaagagtaaaagctctttcttcttttctttgacaagtagggctaaataacccatttac240ccaattaaataataacattcaaatccaacgatcaaatcatcctccacgtaggacatggcc300attaataaattataattaccaattgatacgacctcagccccaattcggtctcatgacaat360catattttacactttgcatttcgtgattaactcttttttatctatattatggatctaaaa420aaatacaaaatgtcaaataaaataaagattttatcatttaattcttttaattatatttcc480aaatggacccatagtctaaaaaatatagaattaaaatgagattaatttttattttaataa540aataaaaactgatgttcaaatcaatttctccaaatactcatgataagtcaaattgaatag600ttagatagatggatgtatagaaataacactaatcttaatatatgaataataattaattta660ttaaagaataaaatttaaaagaaactatctactataaagattagtgtgaatatcatgaaa720tggcaaatgttgttgcacgagcgatcaatgattatctagattaattatataaaataaaaa780atataattattaaaataaatcaaagaaataaaagtggagcccaccacaacgtacagacgt840ccagttggtatgcaaggggcggttctgaggatcaagtcaccgtcgggcgtcaacagacta900tcctgacacatacgagcctacgtggaaatctaatccgacgcccgcaatttcctagaaaaa960acaccggtccaacgttttccaaca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