一种鸭粪便污染检测试剂盒及其制备与应用的制作方法

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种鸭粪便污染检测试剂盒及其制备与应用。
背景技术：
：随着畜禽食品需求的快速增长，畜禽养殖业也得到了高速发展，然而大规模养殖造成的动物粪便污染问题不容小觑。我国是肉鸭生产和消费大国，养鸭业是我国家禽产业的重要组成部分，有研究报道一个年产10万只肉鸭的养殖场，年产鸭粪量高达546吨，环保压力极大。鸭粪便中存在过量矿物元素，如cu、zn、n、p等；抗生素也有可能在粪便中残留；经过发酵分解的粪便会生成有毒有害的物质，如nh4、h2s、吲哚、苯酚等。另外，粪便中还含有大量致病菌，如沙门氏菌、毛首线虫卵、禽流感病毒等，如果排放进江河湖泊中，潜在危害极大。目前，对水体粪便污染的检测主要是通过对水体中粪便指示菌(fecalindicatorbacteria，fib)的定量来进行评估，但仅使用fib只能检测出水体是否受粪便污染及其受污染的程度，无法得知污染的来源、被污染的时间等信息，且检测花费时间较长。现代检测技术中，广泛的将faecalibacterium菌应用到人类粪便对水体污染的检测中，研究结果显示从60.2％的人类粪便样本和100％的人类粪便污水样本中检测到了此菌。因此，本发明提出一种鸭粪便污染检测试剂盒，通过其中包含的特异性引物对可以检测鸭粪便中faecalibacterium菌16srdna，实现快速、精准地检测出水环境中是否含有鸭粪便污染物以及污染程度，具有重要的商业价值。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的之一，在于提供一种检测鸭粪便污染物的引物对，具体方案如下：一种鸭粪便污染物检测引物对，所述引物对包括一组正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如seqidno.2所示。本研究组前期根据高通量测序结果，对物种间16srdna基因序列进行纵向对比分析，首次确定鸭粪便faecalibacterium菌16srdna基因标记物，设计了上述鸭粪便特异性引物对两组。本发明的目的之二，在于提供上述鸭粪便污染物检测引物对的应用。上述鸭粪便污染物检测引物对在制备鸭粪便污染物检测试剂或检测试剂盒中的应用。本发明的目的之三，在于提供一种检测鸭粪便污染物的试剂盒，具体方案如下：一种鸭粪便污染物检测试剂盒，所述鸭粪便污染物检测试剂盒包含上述鸭粪便污染物检测引物对。进一步，所述鸭粪便污染物检测试剂盒还包含一组对照引物对，所述对照引物对包含正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述反向引物的核苷酸序列如seqidno.4。本发明的试剂盒采用高灵敏性pcr技术来对鸭粪便中的faecalibacterium菌进行检测，采用所述的鸭粪便污染物检测引物对来进行pcr扩增，以所述对照引物对来进行阳性对照，根据扩增情况可以分析判断鸭粪便中faecalibacterium菌感染情况。因此，引物对的设计是本发明试剂盒的关键。进一步，所述鸭粪便污染物检测试剂盒还包含2×powertaqpcrmastermix。基于本发明的试剂盒采用的是pcr技术来进行检测，所以试剂盒中还包含其他一些pcr所需的常规试剂，如：taq酶、pcr反应缓冲液、mgcl2、dntps等常用pcr反应试剂中的一种或多种。由于此类pcr常用试剂均可经市场途径单独购得或自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。pcr扩增反应液中，引物、taq酶、pcr反应缓冲液、mgcl2、dntps等均为常见组分，其含量亦为常规。如前所述，pcr扩增反应液可以自行配置，也可以直接以市售的不含引物的通用pcr扩增反应液加入特异性引物对获得。例如，本发明的试剂盒中还可以含有2×powertaqpcrmastermix，加入本发明的鸭粪便污染物检测引物对及对照引物对即可获得pcr扩增反应体系。进一步，所述鸭粪便污染物检测试剂盒还包含阳性对照，所述阳性对照为faecalibacterium菌保守序列，可以是含有faecalibacterium菌保守序列的质粒，还可以是灭活的faecalibacterium菌培养液，还可以采用现有faecalibacterium菌检测试剂盒中的阳性对照，也可以单独购买或根据现有技术自行构建。进一步，所述鸭粪便污染物检测试剂盒还包含阴性对照，所述阴性对照为不含faecalibacterium菌的溶液。例如，可以是无菌水(depc-h2o)、生理盐水等。本发明的目的之四，在于提供一种利用上述试剂盒检测鸭粪便污染物的方法，具体方案如下：一种根据权利上述的鸭粪便污染物检测试剂盒检测鸭粪便污染物的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取样品dna；2)加样：将样品dna与所述鸭粪便污染物检测引物对进行混合，加入其他pcr扩增反应液，并设置空白对照，反应体系为15μl；3)pcr扩增：反应管置于pcr仪上，设置循环参数，进行pcr扩增；4)分析扩增产物。进一步，步骤3)中循环参数为：96℃预变性5min，96℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，72℃总延伸10min，4℃保温10min；一共35个循环。本发明的目的之五，在于提供上述检测试剂盒的应用。上述鸭粪便污染物检测试剂盒在制备鸭粪便污染物检测产品中的应用。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种鸭粪便污染检测试剂盒及其检测方法与应用，该试剂盒中包含一组特异性鸭粪便污染物检测引物对，还包含一组对照引物对以及适用于pcr扩增的其他反应溶液。本发明提供的试剂盒能够特异性地检测鸭粪便中faecalibacterium菌16srdna，具有快速、精确的特点，其引物的特异性为100％，阳性率为93.75％，灵敏度为7.95×107拷贝/100ml。附图说明图1凝胶电泳图。图2标准曲线图。具体实施方式以下将参照附图，对本发明的实施例进行详细描述。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例1引物对合成1)粪便样品采集：本实验采集人、鸭、鸡、猪、狗、牛六个物种粪便样品共246份。所有采集对象必须无肠道相关的疾病且近期未使用过抗生素类药物。2)粪便样品基因组dna提取：将样品按照powerdnaisolationkit的操作说明提取各物种粪便样品的总基因组dna。3)高通量测序：把所提取的基因组dna样品按物种(人、鸭、鸡、猪、狗、牛)分类混合成总样品，并做好标记。将标注序号的dna混合样品进行测序，选择16srdna基因的v3-v4区与v5-v6区进行测序。4)引物设计：先将高通量测序序列初步去除低质量序列，再将相似度≥97％的faecalibacterium菌16srdna序列根据物种进行分类，分析比对六个物种faecalibacterium菌16srdna序列，设计多对鸭特异faecalibacterium菌16srdna基因引物，最后经pcr检测筛选出一组特异性最强的基因标记物对；此外还有一组通用引物对。如下表所示：表1seqidno.1fdu-1f(正向引物)ctggttttcttgagtgaagtagagseqidno.2fdu-1r(反向引物)tttcgagcatgaacgseqidno.3fup-f(正向引物)ctaactacgtgccagcagccseqidno.4fup-r(反向引物)gccttcgccactggtgttcc实施例2试剂盒检测样品1)采集人、鸭、鸡、猪、狗、牛六个物种待测样品。将待测样品按照powerdnaisolationkit的操作说明提取各物种粪便样品的总基因组dna。2)pcr扩增。以引物fdu-1来进行梯度pcr扩增，实验组采用人、鸭、鸡、猪、狗、牛各自的dna混合样品作模板，实验设置空白对照，对照组用无菌水作为模板，反应体系为15μl，加样做好标记，置于pcr仪上进行扩增。表2本实验中采用的pcr扩增体系体系溶液体积(μl)dna模板2taqmastermix(2×)7.5pcrforwardprimer0.5pcrreverseprimer0.5dh2oupto15表3本实验pcr最佳反应参数3)选用2％琼脂糖凝胶检验引物的特异性，引物仅能扩增鸭混合dna样品，无法扩增其他物种混合dna样品及空白对照，pcr扩增成功的表现为目的条带明显而明亮，扩增失败则是无条带。4)实验结果：见图1。凝胶电泳检测发现两对引物都仅在鸭粪便dna样品中显示为阳性(出现目的条带)，且与其他物种无交叉反应，则证明fdu-1的特异性高达100％。实施例3测定基因标记物阳性率阳性率是评判基因标记物优良与否的重要指标之一，具体指用特定引物检测dna样品时，经pcr扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测结果为阳性的数量占总样品数量的比值。本研究设计的鸭特异性基因标记物的适用性取决于阳性率，阳性率越高，就代表其在实际应用中的适用性越高。1)采用faecalibacterium菌通用引物fup、鸭粪便faecalibacterium菌特异性引物fdu-1分别对128份不同鸭粪便dna样品进行pcr检测，pcr反应体系为15μl。2)为避免因实验样品失效等原因造成数据错误，以fup作为阳性对照，验证dna样品中是否含有faecalibacterium菌。操作时，每个样品需重复三次，实验设置阴性对照(蒸馏水为模板)。3)结果采用电泳检测，记录fdu-1的阳性率。4)实验结果：在128份鸭粪便dna样品中，作为阳性对照的faecalibacterium菌通用引物fup检测结果全部为阳性，fdu-1的阳性率为：93.75％。实施例4基因标记物灵敏度检测最低检测限(limiteofdetection，lod)通常被用作灵敏度的衡量指标，即指特异性基因标记物经过pcr扩增后，凝胶电泳能够扩增出微亮条带时样品的浓度。若检测限值越小，则表明此基因标记物越灵敏。本实验采用普通pcr和定量pcr测定fdu-1的灵敏度，具体操作如下：1)普通pcr扩增：将dna样品稀释成浓度梯度的样品(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9)。以fdu-1为引物，扩增各个浓度梯度的dna样品，初步确定lod的所在浓度区间。2)定量pcr扩增：以普通pcr确定的临界点稀释样为扩增模板，利用定量pcr来确定拷贝数，随后根据已知拷贝数的样品(梯度稀释后的各样品)绘制标准曲线，将待测样品的ct值代入标准曲线方程中换算出待测样品的拷贝数。i)pcr扩增目的片段。ii)纯化pcr扩增产物。iii)与克隆载体pmd19-t连接与转化。iv)重组克隆质粒的筛选。将重组克隆质粒接种于含有amp溶液的lb液体培养基，摇床培养。v)提取重组质粒。经克隆携带目的片段的重组质粒采用质粒抽提试剂盒进行提取。vi)稀释重组质粒，并进行定量pcr。把稀释后的重组质粒作为模板，以fdu-1作为引物进行实时荧光定量pcr扩增。定量pcr扩增体系与普通pcr反应体系基本一致，为15μl，每个稀释浓度标准样品做3个平行样。vii)绘制标准曲线。依据已获取和测得的重组质粒浓度、pmd19-t序列、目的基因序列，计算重组质粒的拷贝数，计算公式如下：以达到基线时所需要的循环数(ct值)作为横坐标，用其相对应的lg(拷贝数)为纵坐标绘制标准曲线。见图2。viii)最低检测限的测定。将稀释临界点样品作为模板，分别用fdu-1为引物进行定量pcr扩增，扩增程序及体系参见上文。将扩增数据代入标准质粒曲线方程里计算出拷贝数，即为最低检测限。每次实验设置三个平行样，重复三次，在实验数据无太大偏差的情况下取平均值为最终最低检测限。ix)实验结果：见表4。表4引物拟合曲线方程扩增效率拟合度(r2)检测限(copies/100ml)fdu-1y＝-0.2476x+11.4250.76850.99897.95×107最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。序列表<110>重庆大学<120>一种鸭粪便污染检测试剂盒及其制备与应用<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<400>1ctggttttcttgagtgaagtagag24<210>2<211>15<212>dna<213>人工序列<400>2tttcgagcatgaacg15<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ctaactacgtgccagcagcc20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4gccttcgccactggtgttcc20当前第1页12