一种用于检测HIV新发感染的重组抗原及其应用的制作方法

本发明涉及抗原制备
技术领域：
，具体而言，涉及一种用于检测hiv新发感染的重组抗原及其应用。
背景技术：
：艾滋病(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)严重威胁人类健康，是全世界共同面临的重大公共卫生问题。联合国艾滋病规划署发布的《艾滋病疫情报告》显示，全球存活的艾滋病病毒感染者和病人已达3400万人，每年新发感染250万人，死亡170万人，艾滋病防治形势依然严峻。目前，艾滋病的感染人群呈多样化，性传播已经成为艾滋病传播的主要途径，同时静脉吸毒共用注射器，暗娼人群安全套使用率较低以及男同性行为等危险因素广泛存在，使得艾滋病防控工作仍面临巨大挑战。艾滋病病毒新发感染检测是艾滋病监测工作的重要内容，对于及时了解hiv传播动态，发现高危人群，评估防控效果具有重要意义。近年来，随着生物技术的发展，使得利用实验室方法判断新近感染，进而估算发病率成为研究热点。但目前用于艾滋病病毒新发感染检测的抗原研究的很少，假阳率高。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种用于检测hiv新发感染的重组抗原，该重组抗原的可溶性高，易于纯化，能够避免或减少hiv新发感染检测时出现的假阳性反应，提高检测的灵敏度和准确性。本发明的第二目的在于提供一种用于编码检测hiv新发感染的重组抗原的核酸分子，其能够编码一种适用于检测艾滋病病毒新发感染检测的重组抗原，且该重组抗原具有检测准确率高的优点。本发明的第三目的在于提供一种表达载体，其包括上述编码用于检测艾滋病病毒新发感染检测的重组抗原的核酸分子。本发明的第四目的在于提供一种表达菌株，其包括有上述用于检测艾滋病病毒新发感染检测的重组抗原的表达载体。本发明的第五目的在于提供一种用于检测hiv新发感染的检测试剂盒，该检测试剂盒能够精确检测艾滋病病毒新发感染。本发明是这样实现的：本发明实施例提供了一种用于检测hiv新发感染的重组抗原，其包括b氨基酸序列、e氨基酸序列、d氨基酸序列、bc变异序列、ae变异序列以及亲水性氨基酸核心序列，所述亲水性氨基酸核心序列设置于b、e、d氨基酸序列、bc以及ae变异序列之间；所述b氨基酸序列如seqidno.1所示，所述e氨基酸序列如seqidno.2所示，所述d氨基酸序列如seqidno.3所示，所述亲水性氨基酸核心序列如seqidno.4所示，所述bc变异序列如seqidno.5所示，所述ae变异序列如seqidno.6所示。本发明实施例还提供了一种用于编码上述用于检测hiv新发感染的重组抗原的核酸分子，该核酸分子包括有b核酸分子、e核酸分子、d核酸分子、bc核酸分子、ae核酸分子以及亲水核苷酸序列；所述b核酸分子的核苷酸序列如seqidno.8所示，e核酸分子的核苷酸序列如seqidno.9所示，d核酸分子的核苷酸序列如seqidno.10所示，亲水核苷酸序列如seqidno.11所示，所述bc核酸分子的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述ae核酸分子的核苷酸序列如seqidno.13所示。本发明实施例还提供了一种表达载体，其包括有上述核酸分子；优选地，所述表达载体为pet28a。本发明实施例还提供了一种表达菌株，其包括有上述表达载体；优选地，所述表达菌株为大肠杆菌表达菌株；优选地，所述表达菌株为大肠杆菌bl21(de3)。一种用于检测hiv新发感染的检测试剂盒，其包括上述的重组抗原或上述核酸分子。本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供了一种用于检测hiv新发感染的重组抗原，该重组抗原b氨基酸序列、e氨基酸序列、d氨基酸序列、bc变异序列、ae变异序列以及亲水性氨基酸核心序列，亲水性氨基酸核心序列设置于b、e、d氨基酸序列、bc以及ae变异序列之间；b氨基酸序列如seqidno.1所示，e氨基酸序列如seqidno.2所示，d氨基酸序列如seqidno.3所示，亲水性氨基酸核心序列如seqidno.4所示，bc变异序列如seqidno.5所示，所述ae变异序列如seqidno.6所示。该重组抗原的可溶性高，易于提纯，能够避免或减少hiv新发感染检测时的假阳性反应，提高检测的灵敏度和准确性。本发明实施例还包括有一种包括有上述用于检测hiv新发感染的重组抗原的核酸分子、包括该核酸分子的表达载体、包括该表达载体的表达菌株以及包括上述重组抗原或核酸分子的用于检测hiv新发感染的检测试剂盒，该检测试剂盒具有检测准确性高的优点。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实施例2中的hiv-ag11表达菌株超声破碎后sds-page电泳图；图2为本发明实施例3中hiv-ag11纯化后sds-page电泳图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例中的用于检测hiv新发感染的重组抗原及其应用进行具体说明。新发感染的实验室检测方法，根据检测的标志物不同可以分为多种方法。血清学阳转前的方法主要有病毒核酸(ribonucleicacid,rna)检测和p24抗原检测；血清学阳转后，根据检测原理不同，大致分为6类：抗体滴度检测、抗体亲和力检测、特异性抗体占总抗体的比例检测、p24抗原免疫球蛋白3抗体(immunoglobuling3，igg3)抗体检测、线性免疫印迹检测、抗特异性免疫抗原性反应检测。其中，按hivgp41特异性抗体占总抗体比例的原理开发的hiv-1bed捕获eia法(bed-ceia)，简称bed法。现有用于bed法的成熟抗原为人工化学合成的多肽，具体为人工化学分别合成的b、e、d多肽，再用化学偶联法将3个多肽连接在一起，该多肽的制备工艺复杂、抗原得率低、成本高，且工艺不稳定、重复相差、批间差大，为抗原的应用推广带来了极大的困难。基因工程重组的bed抗原则溶解性差、标记困难、假阳率高，无法用于bed法试剂盒的开发。本发明实施例提供了一种用于检测hiv新发感染的重组抗原，其包括有b氨基酸序列、e氨基酸序列、d氨基酸序列、bc变异序列、ae变异序列以及亲水性氨基酸核心序列，所述亲水性氨基酸核心序列设置于b、e、d氨基酸序列、bc以及ae变异序列之间。b氨基酸序列如seqidno.1所示，所述e氨基酸序列如seqidno.2所示，所述d氨基酸序列如seqidno.3所示，所述亲水性氨基酸核心序列如seqidno.4所示，所述bc变异序列如seqidno.5所示，所述ae变异序列如seqidno.6所示。该重组抗原具有可溶性高，检测hiv新发感染假阳率低，易于提纯，加入了ae变异序列和bc变异序列的重组抗原适用于我国hiv新发感染的检测，具有检测准确性高的优点。进一步地，用于检测hiv新发感染的重组抗原序列的n端和c端均添加有用于提高抗原可标记性的赖氨酸序列。进一步地，在所述重组抗原的序列中，所述b氨基酸序列、e氨基酸序列、d氨基酸序列、所述bc变异序列和ae变异序列依次从重组抗原的n端到c端依次排列。更进一步优选地，用于检测hiv新发感染的重组抗原的序列如seqidno.7所示。本发明实施例还提供了一种用于编码上述用于检测hiv新发感染的重组抗原的核酸分子，该核酸分子包括有b核酸分子、e核酸分子、d核酸分子、bc核酸分子和ae核酸分子以及亲水核苷酸序列。b核酸分子的核苷酸序列如seqidno.8所示，e核酸分子的核苷酸序列如seqidno.9所示，d核酸分子的核苷酸序列如seqidno.10所示，亲水核苷酸序列如seqidno.11所示，bc核酸分子的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述ae核酸分子的核苷酸序列如seqidno.13所示。进一步地，核酸分子的核苷酸序列如seqidno.14所示。本发明实施例还提供了一种表达载体，其包括有上述核酸分子。优选地，所述表达载体为pet28a。进一步地，本发明实施例还提供了一种表达菌株，其包括有上述表达载体。优选地，所述表达菌株为大肠杆菌表达菌株；优选地，所述表达菌株为大肠杆菌bl21(de3)。本发明实施例还提供了一种用于检测hiv新发感染的检测试剂盒，其包括上述用于检测hiv新发感染的重组抗原或上述的用于检测hiv新发感染的重组抗原的核酸分子。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供的一种用于检测hiv新发感染的重组抗原，其包括b氨基酸序列、e氨基酸序列、d氨基酸序列、bc变异序列和ae变异序列、亲水性氨基酸核心序列以及重组抗原n端和c端添加的赖氨酸序列。b氨基酸序列、e氨基酸序列、d氨基酸序列、所述bc变异序列和ae变异序列依次从重组抗原的n端到c端依次排列。所述亲水性氨基酸核心序列设置于b、e、d氨基酸序列以及bc变异序列和ae变异序列之间。具体地，b氨基酸序列如seqidno.1所示，所述e氨基酸序列如seqidno.2所示，所述d氨基酸序列如seqidno.3所示，所述亲水性氨基酸核心序列如seqidno.4所示；bc变异序列如seqidno.5所示，所述ae变异序列如seqidno.6所示。进一步地，重组抗原的氨基酸序列的n端和c端均添加有用于提高抗原可标记性的赖氨酸序列。在本实施例中，重组抗原命名为hiv-ag11，重组抗原的氨基酸序列如seqidno.7所示。实施例2用于检测hiv新发感染的重组抗原的构建1.目的基因片段连接转化克隆菌基因合成的b/e/d-puc质粒(b/e/d核酸分子)和bc/ae-puc质粒(bc/ae核酸分子)包含重组抗原序列全长序列，采用pet28a作为表达载体，其起始密码含有his标签，融合表达的蛋白，可利用ni柱进行纯化。具体地，b/e/d-puc质粒用ndeⅰ和ecorⅰ进行双酶切，bc/ae-puc质粒用ecorⅰ和xhoⅰ酶切，pet28a用ndeⅰ和xhoⅰ酶切作为骨架，酶切体系依照表1进行，30℃酶切30min。本实验所用限制性酶切酶购自北京全式金生物技术有限公司，为其flycut系列快切酶。表1双酶切体系酶11μl酶21μl10×buffer2μl底物16μltotal20μl三个酶切体系全部做琼脂糖凝胶电泳和dna纯化回收，所用试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，胶回收产物按表2所示的连接体系连接16小时，dna连接酶solutionⅰ购自takara，转化大肠杆菌dh5a，得到连接转化克隆菌，大肠杆菌dh5a感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。表2连接体系基因片段b/e/d2μl基因片段ae/bc2μlpet28a1μlsoutionⅰ5μl总体积10μl2.阳性斑筛选及质粒提取步骤1中的连接转化克隆菌的平板生长有白色大肠杆菌单斑，挑取平板单斑进行菌落pcr，pcr引物为：pet-fw:cactataggggaattgtgagcggataac(seqidno.15)。pet-rv:ctcagcttcctttcgggctttgttag(seqidno.16)。菌落pcr反应体系组分见表3，pcr反应程序为：预变性：94℃5min；循环：94℃30s，60℃30s，72℃90s，共30次循环；延伸：72℃5min。阳性斑菌落pcr产物片段大小理论为1034bp。表3菌落pcr反应体系模板dna0.5μlpet-fw(20μm)1μlpet-rv(20μm)1μl2×taqmix10μlddh2o7.5μl总体积20μl将筛选到的阳性单斑，摇菌过夜，次日提取质粒，质粒提取试剂盒为omega质粒小提试剂盒。获得的hiv-ag11质粒，质粒双酶切(ncoⅰ+xhoⅰ)鉴定为阳性，送生工生物工程有限公司北京测序部测序，序列与设计完全一致，即可用于转化大肠杆菌表达菌。3.hiv-ag11质粒转化大肠杆菌表达菌bl21(de3)取hiv-ag11质粒1μl，加入50μl大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，冰上放置30min，42℃热激90s，冰上放置2min，加入500μllb培养基(不含抗生素)，37℃，200rpm培养1小时，取60ul培养液涂布平板(含有硫酸卡那霉素50μg/ml)，得到包括有重组抗原hiv-ag11的大肠杆菌表达菌bl21(de3)。实验所用大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。4.大肠杆菌诱导表达表达菌的甘油菌接入300ml培养基(含有硫酸卡那霉素50μg/ml)，37℃，200rpm摇瓶培养至od600＝0.8，加入iptg诱导表达(iptg终浓度为0.7mm)，继续培养4h。将菌液6500rpm离心10min，弃上清，收集菌泥。5.大肠杆菌超声破碎表达的大肠杆菌菌泥按1g菌泥40ml缓冲液的比例加入10mmtris-hcl(ph8.0)，重悬菌体，在超声机上超声破碎，20ml菌液，200w，超声2s停2s超声20min。超声完全的菌液较为清亮，取50μl超声液，经11000rpm离心10min分离沉淀和上清，沉淀作为包涵体样品。取上清30μl作为上清样品，进行sds-page检测沉淀和上清中是否有目的蛋白表达，请参照附图1，hiv-ag11蛋白表达形式为包涵体表达，取包涵体进行后续试验。实施例3用于检测hiv新发感染的重组抗原的纯化。将实施例2步骤5得到的破碎后的菌体用j-e贝克曼离心机进行离心，离心力：22000g，温度：4-8℃，时间：15分钟。弃上清，保留包涵体沉淀。将包涵体用将沉淀用包涵体裂解液(10mmtris-hcl+500mmnaclph8.0+8mmurea)溶解，包涵体完全裂解后，22000g，离心15min去除杂质，保留上清，即nisepharosefastflow柱层析样品。选择合适的层析柱及填充的nisepharosefastflow凝胶量进行装柱。将装填好后的nisepharosefastflow层析柱纯化水冲洗4个柱体积。用4倍柱体积的平衡液(10mmtris-hcl+500mmnaclph8.0+8mmurea)平衡纯化柱，平衡完成后上样。上样结束后，以平衡液冲洗管路及层析柱中残余样品。用4倍柱体积的除杂液(10mmtris-hclph8.0+500mmnacl+30mmimz+8mmurea)洗脱除去杂质。用4倍柱体积的洗脱液(10mmtris-hclph8.0+500mmnacl+200mmimz+8mmurea)洗脱结合的抗原蛋白，用50mmph9.6的cb透析去除变性剂和咪唑后，即为纯化后的重组抗原。本试验还同时构建了将bed多肽串联表达的抗原hiv-bed，表达载体pet28a，表达菌为bl21(de3)，蛋白表达形式也是包涵体表达。使用包涵体裂解液(10mmtris-hcl+500mmnaclph8.0+8mmurea)溶解，包涵体裂解不完全，采取42℃处理、水波超声等助溶措施后仍无法完全裂解。将其裂解液离心去除沉淀后，上清中存在hiv-bed蛋白，采用与hiv-ag11相同的方法(ni柱)进行纯化。纯化后进行sds-page检测，检测结果请参照附图2和表4。表4hiv-ag11和hiv-bed包涵体裂解情况对比由表4和图2可知，实施例1提供的重组抗原相对于现有技术的hiv-bed抗原而言，更容易裂解提纯。实施例4实施例3提供的用于检测hiv新发感染的重组抗原的特异性和稳定性检测。羊抗人igg包被96孔板、酶结合物稀释液、a液、b液、终止液均购自英科新创(厦门)科技有限公司。融合抗原标记辣根过氧化物酶(过碘酸钠法)：称取10mghrp溶于1ml超纯水中，室温下搅拌使其充分溶解，于上液中加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，避光搅拌25分钟；氧化完成后于上液中加入0.2ml稀释后的乙二醇溶液，继续避光搅拌30分钟；将上述反应液加至透析后的hiv-ag11蛋白溶液中，混匀后用50mmph9.5碳酸盐缓冲液进行透析4.5h，中间换液一次；加入0.4ml新配的10mg/mlnabh4溶液，混匀，再置4℃2h；将上述液装入透析袋中，用20mmtbsph8.0缓冲液透析，室温下过夜，中间换液两次；次日向得到的成品酶中加等量的甘油，混匀，-20℃保存。酶标抗原活性检测：取所需数量的包被好羊抗人igg的微孔条，置于板架上，并做好标识。按顺序分别在相应孔中加入100μl关键质控品及阴、阳性对照。置37℃恒温箱中温育60min，用洗涤液充分洗涤5次，然后扣干(洗涤液浸泡时间30-60秒)。分别在每孔中加入100μl酶标抗原(1：5000稀释)，置于37℃恒温箱中温育30min(如有需要可在板上覆盖封板膜)，用洗涤液充分洗涤5次，然后扣干。每孔加入底物a、b液各50μl，轻拍混匀后，置于37℃恒温箱中温育30min。每孔加入终止液50μl，混匀。用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔的a值(用单波长测定时，需用空白对照空调零，一般采用双波长测定法)，并记录结果。utoffvalue(cov)计算：cov＝阴性对照平均od值×2.0(阴性对照od值低于0.075作0.075计算，高于0.075按实际od值计算)，待测样品od值≥cov为阳性，待测样品od值＜cov为阴性。特异性检测：确证的hiv阳性血清112例，阴性血清1000例按酶标抗原检测方法进行检测。实施例3提供的hiv-ag11也采用相同的方法进行辣根过氧化物酶标记，并检测活性和特异性。检测结果请参照表5和表6。表5酶标抗原活性检测结果表6特异性检测结果由表5和表6可知，实施例3提供的重组抗原hiv-ag11的抗原活性和特异性均优于现有技术的hiv-bed。准确性检测：选择经cdc确证的艾滋新发感染血清12例，既往感染血清10例按试剂盒检测方法进行检测，选择hrp标记的hiv-bed和hrp标记的hiv-ag11进行平行检测。准确性检测结果请参照表7。表7两种抗原的准确性检测结果由表7可知，hiv-ag11新发感染准确率要比hiv-bed的准确率要高，hiv-ag11检测既往感染符合率要比hiv-bed要高。稳定性检测：将纯化好的待检原料hiv-ag11平均分成2份，1份置于4℃冰箱中，另1份置于37℃恒温箱中6天后取出放入4℃冰箱中平衡过夜，包被成检测板，与4℃放置的酶标板用阳性关键质控品进行稳定性检测。稳定性检测结果请参照表8。备注：包被反应板对阳性关键质控品的检测a值与4℃酶标板对阳性关键质控品的检测a值的比值进行判断，比值越高稳定性越好。表8稳定性检测结果由表8可知，实施例3提供的重组抗原hiv-ag11的稳定性较好。综上，本发明实施例提供了一种用于检测hiv新发感染的重组抗原，该重组抗原b氨基酸序列、e氨基酸序列、d氨基酸序列、bc变异序列、ae变异序列、亲水性氨基酸核心序列以及重组抗原两端添加的赖氨酸序列，亲水性氨基酸核心序列设置于b、e、d氨基酸序列、bc以及ae变异序列之间；b氨基酸序列如seqidno.1所示，e氨基酸序列如seqidno.2所示，d氨基酸序列如seqidno.3所示，亲水性氨基酸核心序列如seqidno.4所示，bc变异序列如seqidno.5所示，所述ae变异序列如seqidno.6所示。该重组抗原的可溶性高，易于提纯，易于标记，能够避免或减少hiv新发感染检测时的假阳性反应，提高检测的灵敏度和准确性。本发明实施例还包括有一种包括有上述用于检测hiv新发感染的重组抗原的核酸分子、包括该核酸分子的表达载体、包括该表达载体的表达菌株以及包括上述重组抗原或核酸分子的用于检测hiv新发感染的检测试剂盒，该检测试剂盒具有检测准确性高的优点。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>北京新创生物工程有限公司<120>一种用于检测hiv新发感染的重组抗原及其应用<130>250<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>34<212>prt<213>人工序列<400>1leuglnalaargileleualavalgluargtyrleulysaspglngln151015leuleuglyiletrpglycysserglylysleuilecysthrthrthr202530alapro<210>2<211>34<212>prt<213>人工序列<400>2leuglnalaargvalleualavalgluargtyrleulysaspglnlys151015pheleuglyleutrpglycysserglylysileilecysthrthrala202530alapro<210>3<211>32<212>prt<213>人工序列<400>3leuglnalaargileleualailegluargtyrleuglnaspglngln151015leuleuglyiletrpglycysserglylyshisilecysthrthrthr202530<210>4<211>19<212>prt<213>人工序列<400>4asplysaspserthrglnglnasnthrglyglyproglnthrthrser151015lysglygly<210>5<211>34<212>prt<213>人工序列<400>5leuglnthrargvalleualailegluargtyrleulysaspglngln151015leuleuglyiletrpglycysserglylysleuilecysthrthrala202530valpro<210>6<211>34<212>prt<213>人工序列<400>6leuglnalaargvalleualavalgluargtyrleuglnaspglnlys151015pheleuglyleutrpglycysserglylysileilecysthrthrala202530alapro<210>7<211>297<212>prt<213>人工序列<400>7metglyserserhishishishishishisserserglyleuvalpro151015argglyserhismetglylyslysglylysglyserleuglnalaarg202530ileleualavalgluargtyrleulysaspglnglnleuleuglyile354045trpglycysserglylysleuilecysthrthrthralaproarggly505560asplysaspserthrglnglnasnthrglyglyproglnthrthrser65707580lysglyglylysglupheleuglnalaargvalleualavalgluarg859095tyrleulysaspglnlyspheleuglyleutrpglycysserglylys100105110ileilecysthrthralaalaproargglyasplysaspserthrgln115120125glnasnthrglyglyproglnthrthrserlysglyglyvalaspleu130135140glnalaargileleualailegluargtyrleuglnaspglnglnleu145150155160leuglyiletrpglycysserglylyshisilecysthrthrthrarg165170175glyasplysaspserthrglnglnasnthrglyglyproglnthrthr180185190serlysglyglyglupheleuglnthrargvalleualailegluarg195200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