一种甲醇蛋白发酵液中酶制剂的生产方法与流程

本发明涉及生物工程领域，特别是一种甲醇蛋白发酵液中酶制剂的生产方法。

背景技术：

甲醇蛋白是一类以甲醇和无机盐为主要原料经液态通风发酵生产的单细胞蛋白，以毕赤酵母为菌种经过以上发酵过程制得的蛋白就是甲醇蛋白的一种。将表达产生酶制剂分子的目的基因通过基因工程手段构建成毕赤酵母工程菌，通过微生物发酵，可以在生产甲醇蛋白的同时联产酶制剂（见专利号：zl201510667433.7一株同时生产甲醇蛋白和脂肪酶的毕赤酵母及其应用及zl201510667645.5一株同时生产甲醇蛋白和木聚糖酶的毕赤酵母及其应用），常见的有脂肪酶、木聚糖酶、蛋白酶等。在实际生产中可从发酵醪中分离酵母菌体和清液，将酵母菌体喷雾干燥后制得单细胞蛋白，清液经一系列提取工艺制得某种特定的酶制剂。

甲醇蛋白发酵液中酶制剂的生产工艺水平决定了酶制剂最终产品的有效成分的纯度、含量、卫生程度、产品质量及产品稳定性，最终影响酶制剂产品应用范围、生产效率、生产过程中的环境保护等方面。因此，加强酶制剂生产工艺的研究和开发，对酶制剂产业的发展有着重要的价值。

传统酶制剂生产工艺为：发酵液中加入硅藻土、珍珠岩等助滤剂后经板框压滤，过滤产生的滤饼弃用，过滤出的清液进行超滤浓缩，其中超滤透过液弃用，超滤浓缩液在加入保护剂后喷雾干燥，得到酶制剂成品。但该生产工艺在实际应用中存在许多缺陷：（1）在板框过滤过程中为增加过滤速度会加入大量的助滤剂，过滤时菌体和助滤剂紧密压缩在一起形成滤饼，难以分离，无法对菌体进行进一步利用；大量料液完全通过板框过滤，会产生大量的滤饼，卸滤饼操作会耗费大量的人力、物力。另外，滤饼作为废渣处理不仅加大了环保压力、增加了投入，而且造成了资源的浪费；（2）常规超滤浓缩设备在操作完成后尚有大量酶液残留在设备及相关管道内，常规的顶洗操作难以准确控制顶水量、对最终浓缩酶液的酶活造成偏差；（3）传统工艺除菌效果差、酶液澄清度差、产品含杂质较多。另外在料液处理过程中，相关罐体处于开放状态，易受空气中杂菌污染，难以达到食品级卫生要求。

技术实现要素：

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种甲醇蛋白发酵液中酶制剂的生产方法，可有效解决除菌效果好、资源利用率高、环境友好，生产的产品纯度高、性质稳定和安全卫生的问题。

本发明解决的技术方案是，一种甲醇蛋白发酵液中酶制剂的生产方法，包括以下步骤：

（1）、将重量浓度为350-450g/l的甲醇蛋白发酵液a在20-30℃下用碟片式高速离心机（gea公司生产，型号为hfc15-01-177）进行第一次分离，离心机转速9000-11500rpm、离心力13000-18000×g、进料速度1.5-2m³/h，分别获得重相液b和轻相液c，重相液b和轻相液c体积比为1:1，重相液b的重量浓度为697-899g/l，轻相液c的重量浓度为1-3g/l；

（2）、向步骤（1）得到的重相液b中加入1-2倍体积的脱盐水进行稀释，得到菌液d；将菌液d在20-30℃下输送至碟片式高速离心机进行二次离心分离，离心机转速9000-11500rpm，离心力13000-18000×g，进料速度1.5-2m³/h，经过二次离心分离，将菌体残余酶液被洗脱，分别获得重相液e和轻相液f，重相液e和轻相液f体积比为1:1-1:2，重相液e的重量浓度为694-898g/l，轻相液f的重量浓度为1-3g/l；

（3）、将步骤（1）轻相液c和步骤（2）轻相液f混合成混合液，并加入混合液体积重量的2%-4%的硅藻土、1%-2%的活性炭，输送至隔膜压滤机，进行除杂、脱色，隔膜压滤机进料压力为0.8-1.0mpa，进料温度为20-30℃,进料量为10m³/h，分别得到滤饼g和过滤清液h；其中滤饼g只含有少量的菌渣，便于处理，因此具有较大的重复利用价值；步骤（2）重相液e为纯净的酵母菌液，可进一步处理加工为酵母粉、精蛋白和小分子肽的产品；

（4）、过滤清液h进入超滤系统进行循环过滤，产生透过液i和浓缩酶液j，超滤系统滤膜采用聚醚砜材质，截留分子量为5000道尔顿，进料压力0.5-0.6mpa，浓缩倍数为3-5倍，透过液i含有大量无机盐，经进一步处理回用，采用专利号2013100017455的权利要求1给出的处理方法，作为下一批次发酵的培养基，不仅实现了废水回用同时大大减少了物料的投入，降低了生产成本；

所述的专利号2013100017455权利要求1的处理方法，一种甲醇蛋白发酵滤液再利用的方法，具体是：

1）、摇瓶种子培养：分类命名为巴斯德毕赤酵母hgd-01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno:m2012342；将甘油管保藏的0.5ml巴斯德毕赤酵母hgd-01的菌株用划线法接种至ypd试管斜面培养基上，30℃培养48小时，即得斜面种子；取1支培养好的斜面种子，用10ml无菌水将斜面种子全部冲洗下来，接种到装有250mlypd液体培养基的三角瓶中，瓶口用8层纱布包好，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养约24～30小时后，菌体od600达到3～5，获得摇瓶种子；所述的ypd试管斜面培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂和余量的水混合在一起组成；所述的ypd液体培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成；

2）、一级种子培养：a、一级种子培养在50l的发酵罐中进行，按步骤1）所述方法在50l罐中配制30l的ypd液体培养基，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对ypd液体培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对ypd液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，通高温蒸汽灭菌10min，灭菌结束后，打开冷却水阀门，使冷确水进发酵罐夹套层，对培养基进行降温，当培养基温度降至30℃时，开始接种；b、将摇瓶种子1000ml接种到50l发酵罐内的ypd液体培养基中，温度28～30℃，转速150rpm，溶氧40%～50%，培养20～24h后，得一级种子；

3）、二级种子培养：将3m³的bsm无机盐发酵培养基放入5m³发酵罐中，用2）a步骤中对ypd液体培养基相同的灭菌方法对bsm无机盐发酵培养基进行灭菌，灭菌完成后，用质量浓度为35%的氨水调bsm无机盐发酵培养基ph值至4.8～5.0，然后将30l一级种子通过压力管道接种到5m3发酵罐内ph值为4.8～5.0的bsm无机盐发酵培养基中，接种时罐压为0.05-0.10mpa，培养时，培养温度30～32℃，通风比1：1～1.5vvm，罐压0.05mpa，ph5.0～5.5，培养24～30h，得二级种子；所述的bsm无机盐发酵培养基为：质量浓度为85%磷酸25kg/m³、磷酸氢二钾0.5kg/m³、氯化铵0.3kg/m³、二水硫酸钙0.2kg/m³、氯化钠0.5kg/m³、硫酸钾3kg/m³、七水硫酸镁2kg/m³、甘油25kg/m³和微量元素溶液4l/m³加水制成，也就是说bsm无机盐发酵培养基为：质量浓度为85%磷酸25kg、磷酸氢二钾0.5kg、氯化铵0.3kg、二水硫酸钙0.2kg、氯化钠0.5kg、硫酸钾3kg、七水硫酸镁2kg、甘油25kg和微量元素溶液4l加水至1m³；所述的微量元素溶液为：五水硫酸铜1.5g/l、碘化钾0.02g/l、一水硫酸锰0.5g/l、二水钼酸钠0.2g/l、硼酸0.02g/l、六水合氯化钴0.3g/l、氯化锌20g/l、七水合硫酸亚铁19g/l、质量浓度98%的浓硫酸4ml/l、生物素0.2g/l、对氨基苯甲酸0.05g/l和泛酸钙0.05g/l加水制成，也就是说微量元素溶液为：五水硫酸铜1.5g、碘化钾0.02g、一水硫酸锰0.5g、二水钼酸钠0.2g、硼酸0.02g、六水合氯化钴0.3g、氯化锌20g、七水合硫酸亚铁19g、质量浓度98%的浓硫酸4ml、生物素0.2g、对氨基苯甲酸0.05g和泛酸钙0.05g加水至1l；

4）、高密度发酵：在50m³发酵罐中加入bsm无机盐发酵培养基30m³做为发酵培养基，用160℃以上的蒸汽进行灭菌，同时对与50m³发酵罐相连的管道进行灭菌，灭菌结束后，将发酵培养基温度降至30～35℃，用质量浓度为35%的氨水调发酵培养基ph至4.5～5.0，然后将二级种子3m³接种到50m³发酵罐内ph为4.5～5.0的发酵培养基中进行发酵，发酵温度为30～32℃，通气量1.5～2vv/m，搅拌转速80-200rpm，24小时后，培养基中甘油耗尽，溶氧开始上升，开始流加甲醇，用甲醇检测仪器在线监测甲醇浓度，使甲醇浓度控制在0.8%～1.2%，45-50小时后，菌体湿重达到250-300g/l，od600值达到42～45，此时发酵结束，即得发酵液；

5）、过滤液的收集：发酵液静置，沉降4～8小时，上层发酵液用卧螺离心机进行离心，离心机转速3000转/分钟，进料量5m³/h，离心清液再用板框过滤机过滤，过滤面积20m²，过滤流速1.5m³/h，过滤得第一次过滤液和菌饼，将菌饼投入到5m³发酵储罐中，加入菌饼体积量1/5的清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，调节进风口温度至140～160℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为1吨/小时，喷雾干燥，收集蛋白干粉；

6）、第一次发酵滤液的收集第一次过滤液中添加乙二胺四乙酸，每升第一次过滤液中edta添加量为0.5g/l，得第一混合液，再用质量浓度为85%的磷酸和质量浓度为35%的氨水调第一混合液ph值到5.5～6.0，得第一次发酵滤液；

7）、第二次发酵滤液的收集分别取上述3）步骤中bsm无机盐发酵培养基配方中磷酸、无机盐及微量元素溶液用量10%的磷酸、10%的无机盐、10%的微量元素溶液、甘油25kg/m3和第一次发酵滤液20m3混合，加水至30m³，得第一替代培养基，备用；所述的无机盐为磷酸氢二钾0.5kg/m³、氯化铵0.3kg/m³、二水硫酸钙0.2kg/m³、氯化钠0.5kg/m³、硫酸钾3kg/m³和七水硫酸镁2kg/m³；再按上述1）、2）、3）、4）、5）步骤中的方法和用量再次收集第二次过滤液，其中，在收集第二次过滤液的过程中，将上述第4）步骤中所用的发酵培养基替换成第一替代培养基，收集得第二次过滤液和蛋白干粉，第二次过滤液添加乙二胺四乙酸进行回收利用，即每升第二次过滤液中edta添加量为0.9g/l，得第二混合液，再用质量浓度为85%的磷酸和质量浓度为35%的氨水调第二混合液ph值到5.5～6.0，得第二次发酵滤液；8）、第三次发酵滤液的收集分别取上述3）步骤中bsm无机盐发酵培养基配方中磷酸、无机盐及微量元素溶液用量15%的磷酸、15%的无机盐、15%的微量元素溶液、甘油25kg/m³和第二次发酵滤液20m³混合，加水至30m³，得第二替代培养基，备用，所述的无机盐为磷酸氢二钾0.5kg/m³、氯化铵0.3kg/m³、二水硫酸钙0.2kg/m³、氯化钠0.5kg/m³、硫酸钾3kg/m³、七水硫酸镁2kg/m³；再按上述1）、2）、3）、4）、5）步骤中的方法和用量再次收集第三次过滤液，其中，收集第三次过滤液的过程中，将上述第4）步骤中所用的发酵培养基替换成第二替代培养基，收集得第三次过滤液和蛋白干粉，第三次过滤液中添加乙二胺四乙酸进行回收利用，即每升第三次过滤液中edta添加量为1.3g/l，得第三混合液，再用质量浓度为85%的磷酸和质量浓度为35%的氨水调第三混合液，ph值到5.5～6.0，得第三次发酵滤液；9）、第三次发酵滤液的再利用分别取上述3）步骤中bsm无机盐发酵培养基配方中磷酸、无机盐及微量元素溶液用量20%的磷酸、20%的无机盐、20%的微量元素溶液、甘油25kg/m³和第三次发酵滤液20m³混合，加水至30m³，得第三替代培养基，备用，所述的无机盐为磷酸氢二钾0.5kg/m³、氯化铵0.3kg/m³、二水硫酸钙0.2kg/m³、氯化钠0.5kg/m³、硫酸钾3kg/m³、七水硫酸镁2kg/m³；再按上述1）、2）、3）、4）、5）步骤中的方法和用量再次制备蛋白干粉，其中，此次制备蛋白干粉过程时，将上述第4）步骤中所用的发酵培养基替换成第三替代培养基，制备得第四次过滤液和蛋白干粉，第四次过滤液排放到污水处理车间。

（5）、浓缩酶液j经微滤系统进行除菌过滤，微滤系统采用折叠过滤滤芯，材质为聚醚砜，过滤精度为0.22um，将酶液中所含微量的生产菌及杂菌过滤除掉，得到纯净的无菌酶液k，无菌酶液k加入无菌酶液k重量0.3%的山梨酸钾及0.4%的苯甲酸钠防腐处理，包装成液体酶成品，或添加无菌酶液k重量20-30%的玉米淀粉作为保护剂进行干燥处理，制成固体酶粉成品；

在上述各步骤中所用的相液（料液）均装在储罐中，储罐上均加装0.22μm的除菌呼吸器，以调节罐内压力、阻止外来灰尘及杂菌进入罐内污染料液；在超滤设备进口处连接无菌空气管道，在超滤操作完毕后，通入无菌空气，将超滤设备内部残留料液完全压出。

本发明采用了碟片高速离心分离、隔膜压滤、超滤浓缩、微滤除菌及密闭式罐体，充分利用各设备的优势，酶制剂液体在整个生产过程中均处于密闭状态，在发酵液轻重相分离、酶液浓缩、除菌除杂、浓缩废液综合利用效果显著，有利于提高酶制剂生产效率，提升酶制剂产品的纯度和品质，符合食品卫生要求，有效解决了除菌效果好、资源利用率高、环境友好，生产的产品纯度高、性质稳定和安全卫生的问题，是甲醇蛋白发酵液中酶制剂生产上的创新，有显著的经济和社会效益。

附图说明

图1为本发明的生产设备工艺流程图。

具体实施方式

以下结合附图和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

本发明一种甲醇蛋白发酵液中酶制剂的生产方法，在具体实施中包括以下步骤：

（1）、将重量浓度为400g/l的甲醇蛋白发酵液a300l在30℃下用hfc15-01-177碟片式高速离心机（基伊埃韦斯伐里亚分离机有限公司（gea）的产品）进行第一次分离，离心机转速11500rpm、离心力18000×g、进料速度2m³/h，分别获得145l重相液b和145l轻相液c，甲醇蛋白发酵液a的损耗10l，重相液b的重量浓度为798g/l，轻相液c的重量浓度为2g/l；

（2）、向步骤（1）得到的重相液b中加入290l脱盐水进行稀释，得到435l菌液d，重量浓度为266g/l；将菌液d在20-30℃下输送至碟片式高速离心机进行二次离心分离，离心机转速11000rpm，离心力16000×g，进料速度2m³/h，经过二次离心分离，将菌体残余酶液被洗脱，分别获得140l重相液e和280l轻相液f，菌液d损耗15l，重相液e的重量浓度为796g/l，轻相液f的重量浓度为1g/l；

（3）、将步骤（1）轻相液c和步骤（2）轻相液f混合成混合液425l，并加入混合液体积重量的3%的硅藻土、1%%的活性炭，输送至隔膜压滤机，进行除杂、脱色，隔膜压滤机进料压力为1.0mpa，进料温度为25℃,进料量为10m³/h，分别得到34.57kg滤饼g和400l过滤清液h，混合液损耗25l；其中滤饼g只含有少量的菌渣，便于处理，因此具有较大的重复利用价值；步骤（2）重相液e为纯净的酵母菌液，可进一步处理加工为酵母粉、精蛋白和小分子肽的产品；

（4）、过滤清液h进入超滤系统进行循环过滤，超滤系统滤膜采用聚醚砜材质，截留分子量为5000道尔顿，进料压力0.5mpa，浓缩倍数为5倍，产生320l透过液i和78l浓缩酶液j，透过液i含有大量无机盐，经进一步处理回用，作为下一批次发酵的培养基，不仅实现了废水回用同时大大减少了物料的投入，降低了生产成本；

（5）、浓缩酶液j经微滤系统进行除菌过滤，微滤系统采用折叠过滤滤芯，材质为聚醚砜，过滤精度为0.22um，将酶液中所含微量的生产菌及杂菌过滤除掉，得到纯净的77l无菌酶液k，无菌酶液k加入无菌酶液k重量0.3%的山梨酸钾及0.4%的苯甲酸钠防腐处理，包装成液体酶成品。

实施例2

本发明在具体实施时，一种甲醇蛋白发酵液中酶制剂的生产方法包括以下步骤：

（1）、将重量浓度为360g/l的甲醇蛋白发酵液a300l在25℃下用碟片式高速离心机进行第一次分离，离心机转速10000rpm、离心力15000×g、进料速度1.5m³/h，分别获得重相液b145l和轻相液c145l，重相液b的重量浓度为719g/l，轻相液c的重量浓度为1g/l，甲醇蛋白发酵液a损耗10l；

（2）、向步骤（1）得到的重相液b中加入脱盐水145l进行稀释，得到菌液d，菌液d重量浓度359.5g/l；将菌液d在25℃下输送至碟片式高速离心机进行二次离心分离，离心机转速10000rpm，离心力15000×g，进料速度2m³/h，经过二次离心分离，将菌体残余酶液被洗脱，分别获得重相液e140l和轻相液f140l，重相液e的重量浓度为718g/l，轻相液f的重量浓度为1g/l，菌液d的损耗10l；

（3）、将步骤（1）轻相液c和步骤（2）轻相液f混合成混合液，并加入混合液体积重量的4%的硅藻土、2%的活性炭，输送至隔膜压滤机，进行除杂、脱色，隔膜压滤机进料压力为0.8mpa，进料温度为20℃,进料量为10m³/h，分别得到滤饼g34.485kg和过滤清液h260l，混合液损耗25l；其中滤饼g只含有少量的菌渣，便于处理，因此具有较大的重复利用价值；步骤（2）重相液e为纯净的酵母菌液，可进一步处理加工为酵母粉、精蛋白和小分子肽的产品；

（4）、过滤清液h进入超滤系统进行循环过滤，超滤系统滤膜采用聚醚砜材质，截留分子量为5000道尔顿，进料压力0.6mpa，浓缩倍数为3倍，产生透过液i173.4l和浓缩酶液j85l，浓缩酶液j损耗1.6l，透过液i含有大量无机盐，经进一步处理回用，作为下一批次发酵的培养基，不仅实现了废水回用同时大大减少了物料的投入，降低了生产成本；

（5）、浓缩酶液j经微滤系统进行除菌过滤，微滤系统采用折叠过滤滤芯，材质为聚醚砜，过滤精度为0.22um，将酶液中所含微量的生产菌及杂菌过滤除掉，得到纯净的无菌酶液k，添加无菌酶液k重量20%的玉米淀粉作为保护剂进行干燥处理，制成固体酶粉成品。

实施例3

本发明在具体实施中，一种甲醇蛋白发酵液中酶制剂的生产方法，包括以下步骤：

（1）、将重量浓度为400g/l的甲醇蛋白发酵液a在20℃下用碟片式高速离心机（gea公司生产，型号为hfc15-01-177）进行第一次分离，离心机转速10500rpm、离心力14000×g、进料速度1.8m³/h，分别获得重相液b和轻相液c，重相液b和轻相液c体积比为1:1，重相液b的重量浓度为850g/l，轻相液c的重量浓度为3g/l；

（2）、向步骤（1）得到的重相液b中加入1.5倍体积的脱盐水进行稀释，得到菌液d；将菌液d在20℃下输送至碟片式高速离心机进行二次离心分离，离心机转速10500rpm，离心力14000×g，进料速度1.8m³/h，经过二次离心分离，将菌体残余酶液被洗脱，分别获得重相液e和轻相液f，重相液e和轻相液f体积比为1:1-1:2，重相液e的重量浓度为852g/l，轻相液f的重量浓度为2g/l；

（3）、将步骤（1）轻相液c和步骤（2）轻相液f混合成混合液，并加入混合液体积重量的2%的硅藻土、1.5%的活性炭，输送至隔膜压滤机，进行除杂、脱色，隔膜压滤机进料压力为0.9mpa，进料温度为30℃,进料量为10m³/h，分别得到滤饼g和过滤清液h；其中滤饼g只含有少量的菌渣，便于处理，因此具有较大的重复利用价值；步骤（2）重相液e为纯净的酵母菌液，可进一步处理加工为酵母粉、精蛋白和小分子肽的产品；

（4）、过滤清液h进入超滤系统进行循环过滤，产生透过液i和浓缩酶液j，超滤系统滤膜采用聚醚砜材质，截留分子量为5000道尔顿，进料压力0.5mpa，浓缩倍数为4倍，透过液i含有大量无机盐，经进一步处理回用，作为下一批次发酵的培养基，不仅实现了废水回用同时大大减少了物料的投入，降低了生产成本；

（5）、浓缩酶液j经微滤系统进行除菌过滤，微滤系统采用折叠过滤滤芯，材质为聚醚砜，过滤精度为0.22um，将酶液中所含微量的生产菌及杂菌过滤除掉，得到纯净的无菌酶液k，无菌酶液k加入无菌酶液k重量0.3%的山梨酸钾及0.4%的苯甲酸钠防腐处理，包装成液体酶成品，或添加无菌酶液k重量25%的玉米淀粉作为保护剂进行干燥处理，制成固体酶粉成品。

本发明采用了碟片高速离心分离、隔膜压滤、超滤浓缩、微滤除菌及密闭式罐体设计，充分利用各设备的优势，酶制剂液体在整个生产过程中均处于密闭状态，在发酵液轻重相分离、酶液浓缩、除菌除杂、浓缩废液综合利用等方面取得了显著的效果，有利于提高酶制剂生产效率，提升酶制剂产品的纯度和品质，符合食品卫生要求。经实验和测试，采用本发明专利所述方法生产的酶制剂产品菌落数小于100cfu/g，酶制剂纯度达到98%以上，生产效率提高10%，发酵无机盐成本降低70%，应用效果显著。