溶藻弧菌噬菌体和噬菌体组合物及其应用的制作方法

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及溶藻弧菌噬菌体和噬菌体组合物及其应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

溶藻弧菌是一种养殖渔业常见的条件致病菌，可以感染海水鱼和淡水鱼，表现为鱼类大范围的皮肤损伤和菌血症，严重者可发展为肌肉和多脏器水肿进而导致鱼类死亡。我国是水产养殖大国，每年因溶藻弧菌的感染给水产养殖业造成巨大的经济损失。更严重的是，溶藻弧菌不仅可以感染水产养殖动物，还可以通过水产品的传播导致人类疾病发生。所以，解决水产养殖中的溶藻弧菌的感染问题对于人类健康和经济发展有着重要意义。

传统上，水产养殖业广泛应用抗生素来进行弧菌疾病的预防和治疗。但是，近年来抗生素在养殖业的滥用现象越来越严重。过度使用抗生素不仅污染环境、危害人类健康，还导致越来越多的耐药菌产生，最终使抗生素法对治疗弧菌感染变得“束手无策”。因此，目前我们亟需找到一种安全、高效的可以治疗溶藻弧菌感染的新方法，以替代抗生素，避免传统用药的几多弊端。

噬菌体疗法是近几年重新发展起来的一种抗生素替代疗法，与抗生素相比有诸多优点：噬菌体只裂解其宿主菌，不破坏其他有益菌群，专一性强，应用安全性高；噬菌体为自然界中存在的生物，无化学污染，是环境友好型药物；噬菌体可在宿主菌中自主复制，工业生产成本较低廉。因此，噬菌体疗法是一种很有前景的预防和治疗弧菌疾病方法。

然而噬菌体疗法也存在一定的局限性，例如致病菌很容易对单一噬菌体的感染产生抗性突变，影响其实际治疗效果。为了解决这一问题，噬菌体鸡尾酒的方法被提出。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明提供溶藻弧菌噬菌体和噬菌体组合物及其应用，本发明筛选获得两株新的烈性溶藻弧菌噬菌体，其宿主专一性强，对溶藻弧菌具有强力裂解和杀灭作用，同时，将二者进行混合使用时，还能有效防止溶藻弧菌产生抗性突变，从而达到理想的病菌清除效果，因此在海水产养殖动物的溶藻弧菌感染性疾病防控方面具有重要应用价值。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供一种溶藻弧菌噬菌体，所述溶藻弧菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体valb1md或溶藻弧菌噬菌体valb1hc；

其中，所述溶藻弧菌噬菌体(vibriophage)valb1md已送至中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2019年4月25日,保藏编号为:cctccm2019290。

所述溶藻弧菌噬菌体(vibriophage)valb1hc已送至中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2019年4月25日,保藏编号为:cctccm2019291。

本发明的第二个方面，提供一种溶藻弧菌噬菌体组合物，所述组合物包括上述溶藻弧菌噬菌体(vibriophage)valb1md和溶藻弧菌噬菌体(vibriophage)valb1hc。

本发明的第三个方面，提供上述溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物在制备溶藻弧菌杀菌剂中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种溶藻弧菌杀菌剂，所述溶藻弧菌杀菌剂包括上述溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物。

本发明的第五个方面，提供上述溶藻弧菌噬菌体、噬菌体组合物或溶藻弧菌杀菌剂在控制水产养殖弧菌感染中的应用。

本发明有益效果：

本发明筛选获得两株新的烈性溶藻弧菌噬菌体，这两株噬菌体具有宿主专一性强，对溶藻弧菌具有强力裂解和杀灭作用。同时，通过将两株噬菌体联合应用，发现其不仅可以达到高效、长效的杀菌效果，同时有效避免了噬菌体治疗中病原菌易产生抗噬菌体突变的问题，可广泛应用于水产养殖行业，因此具有良好的实际应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：实施例2中溶藻弧菌噬菌体valb1md的平板培养照片；

图2：实施例4中溶藻弧菌噬菌体valb1hc的平板培养照片；

图3：实施例7中溶藻弧菌噬菌体valb1md的透射电子显微镜照片；

图4：实施例7中溶藻弧菌噬菌体valb1hc的透射电子显微镜照片；

图5：实施例8中溶藻弧菌噬菌体valb1md的氯仿敏感性实验结果图；

图6：实施例8中溶藻弧菌噬菌体valb1hc的氯仿敏感性实验结果图；

图7：实施例12中溶藻弧菌噬菌体valb1md的一步生长曲线图；

图8：实施例13中中溶藻弧菌噬菌体valb1hc的一步生长曲线图；

图9：实施例14中溶藻弧菌噬菌体valb1md单一噬菌体感染溶藻弧菌vibrioalginolyticusvib283t的效果曲线图；

图10：实施例15中溶藻弧菌噬菌体valb1hc单一噬菌体感染溶藻弧菌vibrioalginolyticusvib283t的效果曲线图；

图11：实施例16中溶藻弧菌噬菌体valb1md和valb1hc联合使用感染溶藻弧菌vibrioalginolyticusvib283t的效果曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，噬菌体疗法存在一定的局限性，例如致病菌很容易对单一噬菌体的感染产生抗性突变，影响其实际治疗效果。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种溶藻弧菌噬菌体，所述溶藻弧菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体valb1md或溶藻弧菌噬菌体valb1hc。

其中，所述溶藻弧菌噬菌体valb1md已送至中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2019年4月25日,保藏编号为:cctccm2019290。

本发明所述valb1md的生物学特征为：在电子显微镜下valb1md呈现由一个直径约90nm的正六面体头部和长117nm宽25nm的尾部组成，属于肌尾噬菌体科。

本发明所述valb1md对2％和20％的氯仿都不敏感。

经试验证明，本发明所述valb1md专性感染溶藻弧菌vibrioalginolyticusvib283t，不感染其他检测弧菌。

本发明所述valb1md的感染特征为:valb1md感染溶藻弧菌vibrioalginolyticusvib283t的潜伏期为30min，裂解周期为3.5h，噬菌体释放量为25pfu/cell。

所述溶藻弧菌噬菌体valb1hc已送至中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2019年4月25日,保藏编号为:cctccm2019291。

本发明所述valb1hc的生物学特征为：在电子显微镜下valb1hc呈现由一个长约107nm、宽70nm的多面体头部和长95nm的尾部组成，属于肌尾噬菌体科。

本发明所述valb1hc的感染特征为:valb1hc感染溶藻弧菌vibrioalginolyticusvib283t的潜伏期为30min，裂解周期为3h，噬菌体释放量为30pfu/cell。

本发明所述valb1hc对2％和20％的氯仿都不敏感。

经试验证明，本发明所述valb1hc除感染溶藻弧菌vibrioalginolyticusvib283t外，还可感染vibrioazureusnbrc104587(t)和由单一噬菌体valb1md感染vibrioalginolyticusvib283t产生的突变株vibrioalginolyticusvib283t-s6。

本发明的又一个具体实施方式中，提供一种溶藻弧菌噬菌体组合物，所述组合物包括上述溶藻弧菌噬菌体valb1md和溶藻弧菌噬菌体valb1hc。

本发明所述溶藻弧菌噬菌体valb1md和valb1hc的效价均为不小于10⁸pfu/ml。

本发明所述溶藻弧菌噬菌体valb1md和valb1hc联合使用时，二者效价比为1:1；感染复数moi取值为0.1～10，经研究发现，当moi为10时，能完全抑制溶藻弧菌vibrioalginolyticusvib283t的生长且不产生突变株。

本发明的又一个具体实施方式中，提供上述溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物在制备溶藻弧菌杀菌剂中的应用。

本发明的又一个具体实施方式中，提供一种溶藻弧菌杀菌剂，所述溶藻弧菌杀菌剂包括上述溶藻弧菌噬菌体或噬菌体组合物。

本发明的又一具体实施方式中，所述溶藻弧菌杀菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂或水悬浮剂，优选为水悬浮剂。

本发明的又一具体实施方式中，所述溶藻弧菌杀菌剂中还包括水产养殖业上可接受的辅料，所述水产养殖业上可接受的辅料选自分散剂、稳定剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明水产养殖业上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。

其中，所述分散剂为三聚磷酸钠、或焦磷酸钠中的一种或两种。

所述稳定剂可选自海藻酸钠、明胶、黄原胶或瓜尔胶中的一种或多种。

所述填料可选自壳聚糖、硅藻土、膨润土、凹凸棒土中的一种或多种。

所述溶剂可选自水(优选为去离子水)。

本发明的又一个具体实施方式中，提供上述溶藻弧菌噬菌体、噬菌体组合物或溶藻弧菌杀菌剂在控制水产养殖弧菌感染中的应用。

为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步说明。

以下实施例中，所述ro培养基的配方为：酵母粉1g，蛋白胨1g，乙酸钠1g，微量元素10ml，去离子水1000ml，ph7.8。

所述固体培养基为：酵母粉1g，蛋白胨1g，乙酸钠1g，微量元素10ml，琼脂15g，去离子水1000ml，ph7.8。

所述半固体培养基为：酵母粉1g，蛋白胨1g，乙酸钠1g，微量元素10ml，琼脂5g，去离子水1000ml，ph7.8。

实施例1溶藻弧菌噬菌体valb1md的分离

取近海水样，经0.22μm无菌滤膜过滤后，按照10％的体积比加入指数生长期的溶藻弧菌vibrioalginolyticusvib283t菌液中，28℃摇床振荡培养。分别在第1d、3d、5d、7d取样，样品经0.22μm无菌滤头过滤除菌后，分别用smbuffer稀释不同的浓度梯度，然后1ml稀释滤液与1ml对数期vibrioalginolyticusvib283t菌液混合在28℃摇床振荡孵育30min，然后倒入融化预冷的约48℃ro半固体，混合后倒在ro固体平板上，水平摇晃均匀直至半固体凝固。将半固体平板至于28℃恒温培养箱培养过夜，若有噬菌斑出现则为初步分离得到的噬菌体。

实施例2溶藻弧菌噬菌体valb1md的纯化

将实施例1得到的噬菌斑在smbuffer中浸泡过夜，然后浸泡液经0.22μm无菌滤头过滤后用smbuffer梯度稀释，按照实施例1所述方法制作双层平板，得到在双层平板上均匀分散的噬菌斑。重复上述操作3-5次，直至最后一次得到的双层平板上噬菌斑的大小、形态一致。纯化后的噬菌体双层平板见图1。

实施例3溶藻弧菌噬菌体valb1hc的分离

具体实施方法同实施例1所述。

实施例4溶藻弧菌噬菌体valb1hc的纯化

具体实施方法同实施例2，纯化后的噬菌体双层平板见图2。在平板上形成大小形状均一的噬菌斑。

实施例5溶藻弧菌噬菌体valb1md的效价测定

将经0.22μm无菌滤头过滤的噬菌体溶液用smbuffer稀释不同倍数，与对数期vibrioalginolyticusvib283t菌液混合后制作双层平板，双层平板在28℃恒温培养过夜后长出噬菌斑。对双层平板上噬菌斑进行计数，选平板上噬菌斑数量在30-300个的平板来计算效价。平板上噬菌斑数量与对应的稀释倍数进行换算，即为该噬菌体的效价。如valb1md噬菌体液稀释10^-6后倒的双层平板上有噬菌斑100个，那么valb1md噬菌体液的效价为1*10⁸pfu/ml。

实施例6溶藻弧菌噬菌体valb1hc的效价测定

valb1hc的效价测定的具体实施方法同实施例5。实验测定valb1hc的效价为1*10⁸pfu/ml。

实施例7溶藻弧菌噬菌体valb1md和valb1hc的电镜形态观察

首先将富集的噬菌体液(约1l)用0.22μm无菌滤头过滤，然后向其中加入终浓度为2ng/l的dnase和rnase，轻混后室温静置1h。静置完毕向溶液中加入终浓度为1m的nacl，轻混溶解后静置30min。离心上述溶液(8000rpm，30min)收集上清，向上清溶液中加入终浓度10％的peg8000，4℃避光放置24h。然后10000g离心收集沉淀，沉淀加smbuffer重悬。向超速离心管中加入7ml密度为1.5g/ml的氯化铯溶液，然后加入5ml上述经smbuffer重悬的噬菌体悬液，超高速真空离心(200000g，4℃，8h)，吸取离心得到的淡蓝色噬菌体条带。用30kd的超滤管置换缓冲液为smbuffer，该样品经醋酸双氧铀负染色后用于拍透射电子显微镜观察噬菌体形态。valb1md的电镜形态见图3，valb1hc的电镜形态见图4。valb1md显示为直径为90nm的正六面体头部，尾部长117nm。valb1hc的六面体头部长107nm，宽71nm，尾部长约95nm。二者都属于肌尾病毒科。

实施例8溶藻弧菌噬菌体valb1md的氯仿敏感性检测

将对数期菌液与加热后预冷的半固体培养基(48℃)混合后制作双层平板。用噬菌体溶液配制体积分数分别为2％、20％的氯仿溶液，对照组为未加任何处理的噬菌体溶液。各实验组涡旋后室温静置30min，然后8000rpm离心，取上层水相10μl滴加到上述双层平板上。28℃恒温箱培养过夜，观察实验组噬菌斑大小与对照组有无差异。valb1md的氯仿敏感性检测双层平板见图5，氯仿处理后的噬菌体与对照组噬菌体形成的噬菌斑大小无差异，表明噬菌体对氯仿不敏感，噬菌体无脂质结构。

实施例9溶藻弧菌噬菌体valb1hc的氯仿敏感性检测

具体实施方法同实施例8。valb1hc的氯仿敏感性检测平板见图6，氯仿处理后的噬菌体与对照组噬菌体形成的噬菌斑大小无差异，表明噬菌体对氯仿不敏感，噬菌体无脂质结构。

实施例10溶藻弧菌噬菌体valb1md的宿主范围检测

本实验选取了实验室保存的16株弧菌进行噬菌体宿主范围检测。即，将生长至对数期的不同弧菌与加热预冷(约48℃)的ro半固体混合后制作双层平板，待上层半固体凝固后，滴加10μl经0.22μm无菌滤膜过滤的噬菌体valb1md，平板在28℃培养箱放置过夜后观察是否有噬菌斑出现。若有，则表明该宿主可以被噬菌体valb1md裂解；若无，表明该宿主不能被噬菌体valb1md裂解。valb1md的宿主范围检测结果见表1，在检测的宿主中，valb1md只能裂解vibrioalginolyticusvib283t。

实施例11溶藻弧菌噬菌体valb1hc的宿主范围检测

具体实施方法同实施例9。valb1hc的宿主范围检测结果见表1，在检测的宿主中，valb1hc可以裂解包括vibrioalginolyticusvib283t在内的共四株弧菌。

实施例12溶藻弧菌噬菌体valb1md的一步生长曲线测定

按照实施例5和实施例6测定的valb1md噬菌体效价，在溶藻弧菌vibrioalginolyticusvib283t长至对数期时，按照moi＝0.01的量加入经0.22μm无菌滤膜过滤的噬菌体valb1md，在28℃摇床振荡孵育30min，然后8000rpm离心10min，将菌体沉淀用新鲜的ro培养基重悬洗3次后，加ro培养基在28℃摇床振荡培养。从0h开始，每隔30min取样，取1ml样品直接加戊二醛(终浓度0.5％)固定，为细菌样品；取1ml样品用0.22μm无菌滤头过滤后加戊二醛(终浓度0.5％)固定，为噬菌体样品。每组样品用戊二醛黑暗固定30min后用流式细胞仪测定细菌或噬菌体的量，绘制各参数随时间的变化曲线。valb1md的一步生长曲线见图7。valb1md裂解vibrioalginolyticusvib283t的潜伏期为30min，裂解周期约3.5h。

实施例13溶藻弧菌噬菌体valb1hc的一步生长曲线测定

具体实施方法同实施例11。valb1hc的一步生长曲线见图8。valb1hc裂解vibrioalginolyticusvib283t的潜伏期为30min，裂解周期约3h。

实施例14溶藻弧菌噬菌体valb1md的杀菌效果测定

根据实施例5测定的噬菌体valb1md的效价，设置3组实验组，分别为将噬菌体valb1md和vibrioalginolyticusvib283t菌以moi＝0.1、1、10的比例混合，然后28℃摇床培养细菌。对照组为vibrioalginolyticusvib283t菌单独培养。每组实验组设置三个平行。从0h开始，每隔1h取样测定菌液的od600吸光度值。12h后不等时间间隔取样直到79h。绘制不同moi值条件下vibrioalginolyticusvib283t菌的生长曲线。不同moi值条件下valb1md的杀菌效果见图9。由图可见，在噬菌体valb1md作用的最初约6h杀菌效果比较明显，但是随着时间的延长，出现突变株的爆发生长，在培养79h后各moi值条件下的杀菌效率分别为：moi＝0.1，49.5％；moi＝1，32.7％；moi＝10，32.7％。

实施例15溶藻弧菌噬菌体valb1hc的杀菌效果测定

具体实施方法同实施例12。不同moi值条件下valb1hc的杀菌效果见图10。由图可见，在噬菌体valb1hc作用的最初约6h杀菌效果比较明显，但是随着时间的延长，出现突变株的爆发生长，在培养79h后各moi值条件下的杀菌效率分别为：moi＝0.1，70.5％；moi＝1，66.3％；moi＝10，49.5％。

实施例16溶藻弧菌噬菌体valb1md和valb1hc联用的杀菌效果测定

根据实施例5和实施例6测定的噬菌体valb1md和valb1hc的效价，将valb1md和valb1hc按效价1：1混合，混合液中的噬菌体的总量为两噬菌体量的总和。设置3组实验组，分别为混合噬菌体和vibrioalginolyticusvib283t菌以moi＝0.1、1、10的比例混合后28℃培养细菌。对照组为vibrioalginolyticusvib283t菌单独培养。从0h开始，每隔1h取样测定菌液的od600吸光度值。12h后不等时间间隔取样直到79h。绘制不同moi值条件下vibrioalginolyticusvib283t菌的生长曲线。不同moi值条件下valb1md和valb1hc联用的杀菌效果见图11。由图可见，噬菌体valb1md和valb1hc共同作用在moi＝10条件下，杀菌效率在细菌培养时间延长至79h时仍维持在100％。达到了彻底裂解致病菌的效果。

表1

注：“+”表示宿主菌对噬菌体敏感；“-”表示宿主对噬菌体不敏感。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。