重组传染性法氏囊病病毒毒株及其制备方法与流程

文档序号：18460846发布日期：2019-08-17 02:00阅读：1175来源：国知局

本发明涉及一种重组传染性法氏囊病病毒毒株及其制备方法。

背景技术：

传染性法氏囊病(infectiousbursaldisease,ibd)是由传染性法氏囊病病毒(infectiousbursaldiseasevirus,ibdv)引起的一种危害青年鸡的急性、高度接触性传染病。ibdv主要侵害鸡的淋巴组织，特别是中枢免疫器官法氏囊，病毒在其中的增殖会造成b淋巴细胞的衰竭，从而引起鸡的免疫抑制。特别是雏鸡的早期感染会引发十分严重的，而且是长期的免疫抑制。ibd造成的免疫抑制能引起鸡的坏死性皮炎、包涵体肝炎——贫血综合症、大肠杆菌感染和免疫失败。ibdv有两个血清型，分为血清ⅰ型和血清ⅱ型。其中只有血清ⅰ型的ibdv对鸡致病。ibd发生初期的流行毒株主要是经典毒株，因为ibdv变异特性极强，自上个世纪八十年代以来，世界各地先后出现了ibdv的超强毒株及变异毒株的流行。ibdv的变异造成了其抗原特性和毒力特性的变化，尽管大量使用传统的弱毒活疫苗和灭活疫苗，ibd依旧在不断流行。

ibdv属于双rna病毒科(birnaviridae)的禽双rna病毒属(avianbirnavirus)，其基因组由a、b两个节段的双链rna(dsrna)组成。a节段含有两个开放阅读框(openreadingframe,orf)，其中orf1编码vp2、vp3和vp4三种病毒蛋白；orf2编码病毒蛋白vp5。b节段仅含有一个orf，编码病毒蛋白vp1。vp2蛋白是ibdv的主要结构蛋白和保护性抗原，能够诱导产生中和抗体。vp1蛋白有两种存在形式，一种在病毒复制过程中以rdrp形式存在；另一种在成熟的病毒粒子中与基因组结合，将基因组a节段和b节段连接起来，以结构蛋白的形式存在，与病毒基因组共价连接的vp1称为vpg。研究表明vp1蛋白也能影响ibdv的毒力。

常规的对病毒以及其他生命物质的研究往往从“性状”——“基因”入手，研究遗传物质的特性以及生命物质的发生发展规律。这即是经典的(正向)遗传学。经典遗传学起源于“现代遗传学之父”孟德尔的豌豆试验。而反过来的研究从“基因”——“性状”入手，直接研究生命物质的遗传物质，即为反向遗传学(reversegeneticmanipulation)。1996年，mundte等对ibdv进行了成功拯救，这是首次关于血清ⅰ型ibdv拯救的报道。自1996年mundte等首次运用反向遗传操作技术对ibdv进行研究以来，通过构建ibdv基因组全长cdna，对ibdv基因组进行突变、删减或替换，研究涉及ibdv的基因功能、致病机理、免疫抑制机理等诸多方面。通过反向遗传操作技术对ibdv进行研究，已经成为越来越多研究人员的选择和关注点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种重组传染性法氏囊病病毒毒株及其制备方法。

本发明首先提供了一种重组传染性法氏囊病病毒，是将鸡传染性法氏囊病病毒中能够翻译得到vp1蛋白n端结构域的rna替换为序列表的序列7自5’端第112至612位所示的rna得到的重组病毒。

所述鸡传染性法氏囊病病毒具体可为传染性法氏囊病病毒nn1172株。

所述重组传染性法氏囊病病毒基因组a节段的rna序列如序列表的序列6所示。

所述重组传染性法氏囊病病毒基因组b节段的rna序列如序列表的序列7所示。

本发明还保护一种重组传染性法氏囊病病毒，是将含有特异片段a的载体a和含有特异片段b的载体b共转染鸡胚成纤维细胞，利用反向遗传学技术拯救获得的重组病毒；

所述特异片段a包括鸡传染性法氏囊病病毒基因组a节段对应的cdna；

所述特异片段b包括鸡传染性法氏囊病病毒基因组b节段对应的cdna；

所述病毒基因组b节段中包括编码传染性法氏囊病病毒vp1蛋白n端结构域的cdna区段，该区段如序列的序列5自5’端第170至670位所示。

所述鸡传染性法氏囊病病毒基因组b节段对应的cdna如序列表的序列5自5’端第59-2885位所示。

所述鸡传染性法氏囊病病毒基因组a节段对应的cdna如序列表的序列3自5’端第59-3318位所示。

所述特异片段a自5’端至3’端依次具有锤头核酸酶hamrz的编码序列、所述鸡传染性法氏囊病病毒基因组a节段对应的cdna和丁型肝炎病毒核酶hdvrz的编码序列。

所述特异片段b自5’端至3’端依次具有锤头核酸酶hamrz的编码序列、所述鸡传染性法氏囊病病毒基因组b节段对应的cdna和丁型肝炎病毒核酶hdvrz的编码序列。

所述锤头核酸酶hamrz的编码序列如序列表的序列3自5’端第1至58位所示或如序列表的序列5自5’端第1至58位所示。

所述丁型肝炎病毒核酶hdvrz的编码序列如序列表的序列3自5’端第3319至3406位所示或如序列表的序列5自5’端第2886至2973位所示。

所述特异片段a如序列表的序列3所示。

所述特异片段b如序列表的序列5所示。

所述载体a是将真核表达载体pvax1的ecorⅴ酶切位点间插入序列表的序列3所示的dna分子得到的重组表达载体。

所述载体b是将真核表达载体pvax1的ecorⅴ酶切位点间插入序列表的序列5所示的dna分子得到的重组表达载体。

所述方法中，在进行共转染时，所述载体a和所述载体b的质量比为1：1。

所述方法中，共转染后24h收获细胞，反复冻融3次后获得重组病毒液。

可将所述重组病毒液接种鸡胚进行传代，得到能够稳定传代的重组病毒。

所述重组病毒可通过鸡胚绒毛尿囊膜途径接种鸡胚进行传代。

所述传代方法如下：选9日龄spf鸡胚，用照蛋灯照蛋，用铅笔在鸡胚气室侧面无血管处画一圆作为打孔处标记，气孔标记处和鸡胚气室处先用碘酒消毒，后用75％酒精进行消毒。把鸡胚置于超净工作台，用眼科镊在标记的打孔处和鸡胚气室上部各打一小孔，用吸耳球吸气室上部小孔，在鸡胚侧面出现人工气室。在鸡胚的侧面人工气室内接种病毒液0.2ml。将鸡胚置于37℃培养箱培养96h，收获鸡胚绒毛尿囊膜，研磨获得病毒液并连续传代3次，得到病毒液。

本发明还保护以上任一所述重组传染性法氏囊病病毒在制备传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。

本发明还保护以上任一所述重组传染性法氏囊病病毒在制备用于预防和/或治疗传染性法氏囊病病毒的产品。

本发明还保护传染性法氏囊病病毒疫苗，其活性成分为以上任一所述的重组传染性法氏囊病病毒。

本发明还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述的重组传染性法氏囊病病毒；所述产品的用途为预防和/或治疗传染性法氏囊病病毒。

本发明利用利用反向遗传学操作技术，对国内分离获得的传染性法氏囊病病毒株进行基因重组，提供了一种重组传染性法氏囊病病毒毒株。本发明提供的重组传染性法氏囊病病毒毒株基因组主要来源于国内鸡群分离的传染性法氏囊病病毒毒株，部分基因来源于传染性法氏囊病病毒疫苗株(b87)，其作为疫苗候选株将更适用于预防国内传染性法氏囊病流行鸡群。本发明的重组传染性法氏囊病病毒毒株不含有任何外源基因，与现有技术报道的传染性法氏囊病病毒基因组大小一致，具有生物安全性。本发明提供的重组传染性法氏囊病病毒毒株可以作为疫苗候选株进行疫苗研发。

附图说明

图1为扩增nn1172株基因组a节段和b节段的方法示意图。

图2为实施例1中各步骤的电泳鉴定结果。

图3为表达nn1172株基因组a节段和b节段的载体构建方法示意图。

图4为nn1172基因组b节段部分基因序列的替换方法示意图。

图5为病毒的体内复制动力学曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

传染性法氏囊病病毒nn1172株：参考文献：姬忠华,蒋维维,焦鹏涛,陈果,赵增志,张誉文,何秀苗,韦平.不同ibd疫苗对ibdv超强毒株nn1172感染的免疫保护试验[j].黑龙江畜牧兽医,2017(18):157-159+298.；公众可以从广西大学获得。

真核表达载体pvax1：赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：v26020。

传染性法氏囊病活疫苗(b87株)：中国兽医微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号cvccav140。

9日龄spf鸡胚：北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

21日龄三黄鸡：广西祝氏农牧有限责任公司。

实施例1、传染性法氏囊病病毒nn1172株基因组a节段和b节段的获得

扩增nn1172株基因组a节段和b节段的方法示意图见图1。

本实施例中使用的引物见表1。

表1

1、提取传染性法氏囊病病毒nn1172株的总rna，并反转录为cdna。

2、以步骤1得到的cdna为模板，采用引物a1-f和引物a1-r组成的引物对进行pcr扩增，得到大小为1441bp的基因组片段a1(图2的泳道1)。

3、以步骤1得到的cdna为模板，采用引物a2-f和引物a2-r组成的引物对进行pcr扩增，得到大小为1840bp的基因组片段a2(图2的泳道2)。

4、以步骤1得到的cdna为模板，采用引物b1-f和引物b1-r组成的引物对进行pcr扩增，得到大小为1364bp的基因组片段b1(图2的泳道4)。

5、以步骤1得到的cdna为模板，采用引物b2-f和引物b2-r组成的引物对进行pcr扩增，得到大小为1484bp的基因组片段b2(图2的泳道5)。

6、将步骤2得到的基因组片段a1和步骤3得到的基因组片段a2采用引物a1-f和引物a2-r组成的引物对进行融合pcr，得到大小为3260bp的基因组a节段(图2的泳道3)。

7、将步骤4得到的基因组片段b1和步骤5得到的基因组片段b2采用引物b1-f和引物b2-r组成的引物对进行融合pcr，得到大小为2827bp的基因组b节段(图2的泳道6)。

经测序，基因组a节段如序列表的序列1所示(其中，自5’端第1至1441位为基因组片段a1，第1421至3260位为基因组片段a2，第1421至1441位为a1和a2的共有片段)。

经测序，基因组b节段如序列表的序列2所示(其中，自5’端第1至1364位为基因组片段b1，第1344至2827位为基因组片段b2，第1344至1364位为b1和b2的共有片段)。

实施例2、表达nn1172株基因组a节段和b节段的载体构建

表达nn1172株基因组a节段和b节段的载体构建方法示意图见图3。

将真核表达载体pvax1的ecorⅴ酶切位点间插入序列表的序列3所示的dna分子，得到重组表达载体pvax1-nn1172a。

序列表的序列3中，自5’端第1至58位为锤头核酸酶hamrz的编码序列，第59至3318位为nn1172株基因组a节段，第3319至3406位为丁型肝炎病毒核酶hdvrz的编码序列。

将真核表达载体pvax1的ecorⅴ酶切位点间插入序列表的序列4所示的dna分子，得到重组表达载体pvax1-nn1172b。

序列表的序列4中，自5’端第1至58位为锤头核酸酶hamrz的编码序列，第59至2885位为nn1172株基因组b节段，第2886至2973位为丁型肝炎病毒核酶hdvrz的编码序列。

实施例3、nn1172基因组b节段部分基因序列的替换

nn1172基因组b节段部分基因序列的替换方法示意图见图4。

1、从传染性法氏囊病活疫苗(b87株)中扩增b87基因组b节段bⅰ基因片段，如序列表的序列5自5’端第170至670位所示。

2、采用步骤1得到的b87基因组b节段bⅰ基因片段替代实施例2得到的重组表达载体pvax1-nn1172b中nn1172株基因组b节段的部分序列，得到重组表达载体pvax1-nn1172b-δbⅰ。

经过测序验证，重组表达载体pvax1-nn1172b-δbⅰ是将真核表达载体pvax1的ecorⅴ酶切位点间插入序列表的序列5所示的dna分子得到的重组表达载体。

序列表的序列5中，自5’端第1至58位为锤头核酸酶hamrz的编码序列，第59至2885位为替换后的传染性法氏囊病病毒基因组b节段(其中，第170至670位为bⅰ基因片段)，第2886至2973位为丁型肝炎病毒核酶hdvrz的编码序列。

bⅰ基因片段编码vp1蛋白n端结构域。

实施例4、重组病毒株rnn1172-δbⅰ的拯救

一、鸡胚成纤维细胞的制备

1、选取9日龄spf鸡胚，用碘酊、酒精消毒。

2、完成步骤1后，用镊子打开鸡胚气室，轻轻夹起鸡胚至无菌的平皿中，加几滴磷酸盐缓冲液(pbs)保持胚体湿润。

3、完成步骤2后，去除鸡胚的内脏、四肢及头部，用pbs洗2遍，再用尖头剪刀充分剪碎胚体至碎泥样，然后用pbs冲洗2～3遍以去除红细胞。

4、完成步骤3后，将洗净的组织碎块吸入细胞瓶中，加入2ml含0.25％的胰酶的pbs于37℃恒温箱消化5min，之后小心地吸弃上清液。

5、完成步骤4后，加入5ml含5％新生牛血清的dmem培养基，轻轻吹打消化后的组织块，使细胞充分释放，吸取其细胞上清用6层的医用纱布进行过滤，将过滤后的细胞与培养基的混合液以800r/min离心5min。

6、完成步骤5后，将离心后的上清弃掉，加入适量的5％新生牛血清dmem培养基进行重悬细胞，以1×10⁶/ml的细胞数铺6孔细胞培养板，每孔2ml细胞悬液。

7、将上述细胞置于37℃、5％co2的细胞培养箱进行培养，培养后24h长成单层即可使用。

二、重组病毒的拯救

1、采用2000转染试剂将500μg实施例2制备的重组表达载体pvax1-nn1172a和500μg实施例3制备的重组表达载体pvax1-nn1172b-δbⅰ共转染至步骤一制备的原代鸡胚成纤维细胞，转染后24h收获细胞，反复冻融3次后获得病毒液。

2、取0.2ml步骤1制备的病毒液，通过鸡胚绒毛尿囊膜途径接种9日龄spf鸡胚，具体方法如下：选9日龄spf鸡胚，用照蛋灯照蛋，用铅笔在鸡胚气室侧面无血管处画一圆作为打孔处标记，气孔标记处和鸡胚气室处先用碘酒消毒，后用75％酒精进行消毒。把鸡胚置于超净工作台，用眼科镊在标记的打孔处和鸡胚气室上部各打一小孔，用吸耳球吸气室上部小孔，在鸡胚侧面出现人工气室。在鸡胚的侧面人工气室内接种病毒液0.2ml。

3、完成步骤2后，将鸡胚置于37℃培养箱培养96h，收获鸡胚绒毛尿囊膜，研磨获得病毒液并连续传代3次，获得重组病毒rnn1172-δbⅰ。

4、提取重组病毒rnn1172-δbⅰ的总rna，并反转录为cdna。

5、对步骤4获得的cdna中基因组a节段和b节段进行测序，测序结果显示，基因组a节段如序列表的序列3自5’端第59至3318位所示，b节段如序列表的序列5自5’端第59至2885位所示。

重组病毒中，基因组b节段相应片段已经替换为bⅰ基因片段。

重组病毒基因组a节段的rna序列如序列表的序列6所示。

重组病毒基因组b节段的rna序列如序列表的序列7所示。

实施例4、重组病毒rnn1172-δbⅰ的生物学特性

一、重组病毒rnn1172-δbⅰ和野毒株nn1172的eld50测定

待测病毒：重组病毒rnn1172-δbⅰ和野毒株nn1172。

1、用pbs将将待测病毒病毒液10倍倍比稀释，选取10^-2～10^-76个稀释度，经绒毛尿囊膜途径接种9日龄spf鸡胚(参照实施例3中记载的方法)，每个稀释度接种5枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.2ml病毒液。同时，分别用0.2mlpbs接种2枚9日龄spf鸡胚，作为对照组。

2、完成步骤1后，将接种后的鸡胚置于37℃培养箱培养，每天观察鸡胚2次，连续观察至7天，去掉24h内死亡的鸡胚，按照reed-muench法进行鸡胚半数致死量(eld50)的测定，logeld50＝高于50％的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数。

结果显示，重组病毒rnn1172-δbⅰ的eld50为10^-5.16eld50/0.2ml，野毒株nn1172的eld50为10^-6.25/0.2ml。

重组毒株rnn1172-δbⅰ接种spf鸡胚表现出感染传染性法氏囊病病毒的典型症状，胚体出血严重，eld50为10^-5.16eld50/0.2ml，低于野毒株nn1172eld50。

二、重组病毒rnn1172-δbⅰ在鸡体内的复制能力

1、将21日龄的三黄鸡随机分成3组，每组15只鸡，每组进行隔离饲养。

2、分为如下三组进行实验：

实验组(重组病毒rnn1172-δbⅰ)：采用滴口途径进行攻毒，每只鸡的攻毒剂量为0.2ml重组病毒rnn1172-δbⅰ病毒液(10⁴eld50)。

实验组(野毒株nn1172)：采用滴口途径进行攻毒，每只鸡的攻毒剂量为0.2ml野毒株nn1172病毒液(10⁴eld50)。

对照组：每只鸡滴口0.2ml的无菌pbs。

攻毒后每天观察并记录鸡群的精神状态，观察至攻毒后7天。分别在感染后3、5、7天，每组剖杀5只鸡，分别收集法氏囊组织。将上述在攻毒后3、5、7天采集的法氏囊组织于2mlep管中，每个ep管加入2个无菌钢珠，在电动振荡器中震荡至法氏囊成匀浆，12000r/min离心5min，将上清取出，提取总rna。

3、取步骤2得到的总rna，采用实时荧光定量pcr方法检测病毒载量。

(1)使用primescript1ststrandcdnasynthesis试剂盒(takara,日本)以ibdv-r(5'-ccctgcctgaccaccactt-3')为引物将rna反转录为cdna，具体操作依据说明书进行。

(2)以步骤(1)得到的cdna为模板，进行qrt-pcr。

反应体系为20μl，包括10μl2×sybrpremixextaq(takara,日本)，2μl模版cdna(20-100ng)，上游引物(ibdv-f:5'-accggcaccgacaacctta-3')和下游引物(ibdv-r)各0.4μl(10μm)以及7.2μl水(无核酸酶)。

qrt-pcr反应的进行是在iq^tm5multicolorreal-timepcrdetectionsystem(bio-rad,hercules,ca,usa)上进行的，具体程序为：1.95℃30s；2.94℃30s，56℃15s，72℃30s，共39个循环，每个循环结束时检测荧光；3.溶解曲线分析从55℃-95℃，0.2℃/s。

将获得的结果取平均值，计算病毒载量，绘制病毒的体内复制动力学曲线。

结果如图5和表2所示。

结果表明，重组毒株rnn1172-δbⅰ在鸡体内的复制能力低于野毒株nn1172。

表2

三、重组病毒rnn1172-δbⅰ对鸡的致病性

1、将21日龄的三黄鸡随机分成3组，每组10只鸡，每组进行隔离饲养。

2、分为如下三组进行实验：

实验组(重组病毒rnn1172-δbⅰ)：采用滴口途径进行攻毒，每只鸡的攻毒剂量为0.2ml重组病毒rnn1172-δbⅰ病毒液(10⁴eld50)。

实验组(野毒株nn1172)：采用滴口途径进行攻毒，每只鸡的攻毒剂量为0.2ml野毒株nn1172病毒液(10⁴eld50)。

对照组：每只鸡滴口0.2ml的无菌pbs。

攻毒后每天观察并记录鸡群的精神状态，观察至攻毒后7天，统计死亡率。

结果如表3所示。

结果表明重组毒株rnn1172-δbⅰ不引起实验鸡的死亡，而野毒株nn1172引起30％实验鸡的死亡。重组毒株rnn1172-δbⅰ对鸡的毒力显著低于野毒株nn1172。

表3

序列表

<110>广西大学

<120>重组传染性法氏囊病病毒毒株及其制备方法

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3260

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggatacgatcggtctgaccccgggggagtcactcggggacaggccgacaaggccctgttc60

caggttggaactcctccttctacagtactatcattgatggttagtagagatcagacaaac120

gatcgcagcgatgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggag180

ccttctgatgccaacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctagagaagcacac240

tctcaggtcagagacctcgacctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaat300

tgtctttttccctggtttccctggctcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaa360

tgggaactacaagttcgatcagatgctcctgactgcccagaacctaccggccagctacaa420

ctactgcaggctagtgagtcggagtctcacagtgaggtcaagcacactccctggtggcgt480

ttatgcattaaacggaaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgagtgaactgac540

agatgttagctacaatgggttgatgtctgcaacggccaacatcaacgacaaaattgggaa600

cgtcctagtaggggaaggggtaactgtcctaagcttgcccacatcatatgatctggggta660

tgtgagactcggtgaccccattcccgctatagggcttgacccaaagatggtagcaacatg720

tgacagcagtgacaggcccagagtctacaccataactgcagccaatgattaccaattctc780

atcacagtaccaagcaggtggagtgacaattacactgttctcagcaaacatcgatgccat840

tacaagcctcagcatcgggggggaactcgtgtttcaaacaagcgtccaaggccttatact900

gggcgctaccatctaccttataggcttcgatgggactgcggtaatcaccagagctgtggc960

cgcaaacaatgggctaacggccggcactgacaaccttatgccattcaatattgtgatacc1020

gaccagcgagataacccagccaatcacatccatcaaactggagatagttacctccaaaag1080

tggtggtcaggcgggggatcagatgtcatggtcagcaagtgggagcctagcggtgacgat1140

ccacggcggcaactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagt1200

ggctacaggatctgtcgttacggtcgctggggtgagcaacttcgagctgatcccaaatcc1260

tgaactagcaaagaacctgatcacagaatacggccgatttgacccaggagccatgaacta1320

cacaaaattgatactgagtgagagggaccgtcttggcatcaagaccgtatggccaacaag1380

ggagtacactgactttcgcgagtacttcatggaggtggccgacctcaactctcccctgaa1440

gattgcaggagcatttggcttcaaagacataattcgggccttaaggaggatagctgtgcc1500

ggtggtctccacactgttcccacccgccgctcctctggcccatgcaattggggaaggtgt1560

agactatcttctgggcgacgaggcacaggctgcttcaggaactgctcgagccgcgtcagg1620

aaaagcaagagctgcctcaggccgcataaggcagctaaccctcgccgccgacaaggggta1680

cgaggtagtcgcgaatctgtttcaggtgccccagaatcctgtagtcgacgggattctcgc1740

ttcacctgggatactccgcggcgcacacaacctcgactgcgtgctgagagagggtgccac1800

gctattccctgtggtcatcaccacagtggaagatgccatgacacccaaagcactgaacag1860

caaaatgtttgctgtcattgaaggcgtgcgagaagacctccaacctccatctcaaagagg1920

atccttcatacgaactctctccggacatagagtctatggatatgctccagatggggtact1980

tccactggagactgggagagattacaccgtggtcccaatagatgatgtctgggacgacag2040

cattatgctgtccaaagaccccatacctcctattgtgggaaacagcgggaacctcgccat2100

agcttacatggatgtgtttcgacccaaagtccccatccatgtagccatgacgggagccct2160

caacgcctatggcgagattgagaatgtgagctttagaagcaccaagctcgccactgcaca2220

ccgacttggcctcaagttggctggtcccggcgcatttgacgtgaacaccgggtccaactg2280

ggcgacgttcatcaaacgttttcctcacaatccacgcgactgggacaggctcccctacct2340

aaaccttccataccttccgcccactgcaggacgccagtacgacctggctatggccgcctc2400

agagttcaaggagacccccgaactcgagagcgctgtcagagccatggaagcagcagccaa2460

cgtggacccactgttccaatccgcgctcagcgtgttcatgtggctggaagagaatgggat2520

tgtgaccgacatggccaacttcgcactcagcgacccgaacgcccatcggatgcgcaactt2580

tctcgcaaacgcaccacaagcaggcagcaagtcgcaaagagccaagtacgggacggcagg2640

ctacggagtagaggcccggggccccactccagaggaagcacagagggaaaaagacacacg2700

gatctcaaagaagatggagaccatgggcatctactttgcaacaccagaatgggtagcact2760

caatgggcaccgggggccaagccccggccagctaaagtactggcagaacacacgagaaat2820

acctgatccaaacgaggactacctagactacgtgcatgcagagaagagccggttggcatc2880

agaagaacaaatcctaagggcagctacgtcgatctacggggctccaggacaggctgagcc2940

accccaggccttcatagacgaagtcgccaaagtctatgaaatcaaccatgggcgtggccc3000

caaccaagagcagatgaaagatctgctcctgactgcgatggagatgaagcatcgcaatcc3060

caggcgggctccaccaaagcccaagccaaaacccaatgttccaacgcagagaccccctgg3120

tcggctgggccgctggatcagggccgtctctgatgaggaccttgagtgaggctcctggga3180

gtctcccgacaccacccgcgcaggcgtggacaccaattcggccatacaacatcccaaatt3240

ggatccgttcgcgggtcccc3260

<210>2

<211>2827

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggatacgatgggtctgaccctctgggagtcacgaattaacgtggctactaggggtgacac60

ccaccgctagctgccacgttagtggctcctcttcttgatgattctgccaccatgagtgac120

gtattcaacagtccacaggcgcgaagcaaaatatcagcagcgtttggcataaagcccaca180

gctggacaggatgtggaagaactcttgatccccaaggtctgggttccacctgaggaccca240

ctggcaagccccagtcgacttgccaaattcctcagagaaaacggctacaagattttgcag300

ccgcggtctctacccgagaatgaggagtatgagaccgaccagatacttccagacctagca360

tggatgcgacagatagagggggcagttctgaagcccaccttgtctctccccattggtgac420

caagagtacttcccaaagtattacccaactcatcgcccgagcaaggagaagcccaatgcg480

tacccaccagacattgcattactcaagcagatgatctacctatttctccagcttccggaa540

gccacagagggcctgaaggatgaagtgaccctcctaactcaaaatatacgagacaaggcc600

tacggaagtgggacctacatggggcaagcgaccagacttgttgccatgaaagaggttgcc660

actgggagaaatccaaacaaggatcctctaaaacttgggtacacttttgagagcatcgcg720

cagttgcttgacatcaccctaccagttggcccacctggtgaggatgacaagccctgggtg780

ccactcacaagagtgccgtcaaggatgctagtgctgacgggagacgtagatggggacttt840

gaggttgaggattacctcccgaaaatcaacctcaagtcatcaagtggactaccatatgta900

ggtcgcactaagggggaaacaattggcgagatgatagccatctcaaaccaattcctccgg960

gagctatcagcgctgctgaagcaaggtgcagggaccaaagggtcaaacaagaagaagcta1020

ctcagcatgctcagtgactattggtacttatcatgcgggcttttgtttccgaaggctgaa1080

cggtatgacaaaagcacatggcttaccaagacccggaacatatggtcagctccatccccg1140

actcacctcatgatctccatgatcacctggcccgtgatgtccaacagccctaacaacgtg1200

ttgaatattgaagggtgcccgtcactctacaagtttaacccgtttaggggaggactaaat1260

aggatcgttgagtggatacttgctccggaagaacccaaggcccttgtatatgcagataac1320

atatacatcgtccactctaacacgtggtactcaattgacctagaaaagggggaggccaac1380

tgcacacgtcaacacatgcaggcggctatgtactacatcctcactagagggtggtcagac1440

aatggtgaccccatgtttaaccagacatgggctacctttgccatgaacattgcccctgct1500

ctagttgtggactcctcgtgtctgataatgaacctgcaaatcaagacctatggtcaaggc1560

agtgggaacgcagccacattcatcaacaaccatctcttgagcaccctggtgcttgatcag1620

tggaacttgatgaaacaacccagcccagacagcgaggagttcaagtcaattgaggacaag1680

ctaggtattaacttcaagatcgagaggtcaattgatgacatcaggggcaagctaagacag1740

cttgtcccccttgcacaaccagggtatctgagtggaggagtcgaaccagaacactccagc1800

ccaactgttgagcttgacctgctaggctggtcagcaacatacagcaaagatcttgggatc1860

tatgtgcctgtacttgacaaggaacgcctattctgctcggctgcgtatcccaaaggggtc1920

gagaacaagagtctcaagtccaaagttgggatcgagcaagcatacaaggtagttaggtat1980

gaggcgttgagactggtaggtggttggaactatccactcctgaacaaagcttgcaagaac2040

aacgcaagcgctgctcggcggcatttggaggccaaggggttcccactcgacgagttccta2100

gccgagtggtctgagctgtcagaattcggcgaggcctttgaaggcttcaacataaagctg2160

accgtaacaccagagatccttgccgaactgaacaagccagtacccccaaaaccccccaat2220

gtcaacagaccagtcaacaccggaggtctaaaggctgtcagcaacgccctaaagaccggc2280

cgctacaggaatgaagccggactgagtggcctcgtccttctagccacagccaggagccga2340

ctgcaagacgcagtaaaggccaaagcagaggccgagaaactccacaagtccaagccagac2400

gaccccgatgcagactggtttgaaagatccgaaactctgtctgaccttctggagaaagcc2460

gacatagccagcaaggtcgcacactcagcactcgtggaaacaagcgacgctcttgaggcg2520

gttcagtcaacctctgtgtatactcccaaatacccggaggtcaagaacccacagaccgcc2580

tccaaccccgttgtcgggctccacctgcccgccaagagagccaccggtgtccaggccgct2640

cttctcggagcaggaacgagcaggccaatggggatggaggccccaacacggtccaagaac2700

gccgtaaaaatggccaaaaggcggcaacgccaaaaggagagccgccaatagccatgatgg2760

gaaccactcaagaagaggacactaaccccagaccccgtatccccggccttcgcctgcggg2820

ggccccc2827

<210>3

<211>3406

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtcgg60

atacgatcggtctgaccccgggggagtcactcggggacaggccgacaaggccctgttcca120

ggttggaactcctccttctacagtactatcattgatggttagtagagatcagacaaacga180

tcgcagcgatgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagcc240

ttctgatgccaacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctagagaagcacactc300

tcaggtcagagacctcgacctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattg360

tctttttccctggtttccctggctcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatg420

ggaactacaagttcgatcagatgctcctgactgcccagaacctaccggccagctacaact480

actgcaggctagtgagtcggagtctcacagtgaggtcaagcacactccctggtggcgttt540

atgcattaaacggaaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgagtgaactgacag600

atgttagctacaatgggttgatgtctgcaacggccaacatcaacgacaaaattgggaacg660

tcctagtaggggaaggggtaactgtcctaagcttgcccacatcatatgatctggggtatg720

tgagactcggtgaccccattcccgctatagggcttgacccaaagatggtagcaacatgtg780

acagcagtgacaggcccagagtctacaccataactgcagccaatgattaccaattctcat840

cacagtaccaagcaggtggagtgacaattacactgttctcagcaaacatcgatgccatta900

caagcctcagcatcgggggggaactcgtgtttcaaacaagcgtccaaggccttatactgg960

gcgctaccatctaccttataggcttcgatgggactgcggtaatcaccagagctgtggccg1020

caaacaatgggctaacggccggcactgacaaccttatgccattcaatattgtgataccga1080

ccagcgagataacccagccaatcacatccatcaaactggagatagttacctccaaaagtg1140

gtggtcaggcgggggatcagatgtcatggtcagcaagtgggagcctagcggtgacgatcc1200

acggcggcaactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtgg1260

ctacaggatctgtcgttacggtcgctggggtgagcaacttcgagctgatcccaaatcctg1320

aactagcaaagaacctgatcacagaatacggccgatttgacccaggagccatgaactaca1380

caaaattgatactgagtgagagggaccgtcttggcatcaagaccgtatggccaacaaggg1440

agtacactgactttcgcgagtacttcatggaggtggccgacctcaactctcccctgaaga1500

ttgcaggagcatttggcttcaaagacataattcgggccttaaggaggatagctgtgccgg1560

tggtctccacactgttcccacccgccgctcctctggcccatgcaattggggaaggtgtag1620

actatcttctgggcgacgaggcacaggctgcttcaggaactgctcgagccgcgtcaggaa1680

aagcaagagctgcctcaggccgcataaggcagctaaccctcgccgccgacaaggggtacg1740

aggtagtcgcgaatctgtttcaggtgccccagaatcctgtagtcgacgggattctcgctt1800

cacctgggatactccgcggcgcacacaacctcgactgcgtgctgagagagggtgccacgc1860

tattccctgtggtcatcaccacagtggaagatgccatgacacccaaagcactgaacagca1920

aaatgtttgctgtcattgaaggcgtgcgagaagacctccaacctccatctcaaagaggat1980

ccttcatacgaactctctccggacatagagtctatggatatgctccagatggggtacttc2040

cactggagactgggagagattacaccgtggtcccaatagatgatgtctgggacgacagca2100

ttatgctgtccaaagaccccatacctcctattgtgggaaacagcgggaacctcgccatag2160

cttacatggatgtgtttcgacccaaagtccccatccatgtagccatgacgggagccctca2220

acgcctatggcgagattgagaatgtgagctttagaagcaccaagctcgccactgcacacc2280

gacttggcctcaagttggctggtcccggcgcatttgacgtgaacaccgggtccaactggg2340

cgacgttcatcaaacgttttcctcacaatccacgcgactgggacaggctcccctacctaa2400

accttccataccttccgcccactgcaggacgccagtacgacctggctatggccgcctcag2460

agttcaaggagacccccgaactcgagagcgctgtcagagccatggaagcagcagccaacg2520

tggacccactgttccaatccgcgctcagcgtgttcatgtggctggaagagaatgggattg2580

tgaccgacatggccaacttcgcactcagcgacccgaacgcccatcggatgcgcaactttc2640

tcgcaaacgcaccacaagcaggcagcaagtcgcaaagagccaagtacgggacggcaggct2700

acggagtagaggcccggggccccactccagaggaagcacagagggaaaaagacacacgga2760

tctcaaagaagatggagaccatgggcatctactttgcaacaccagaatgggtagcactca2820

atgggcaccgggggccaagccccggccagctaaagtactggcagaacacacgagaaatac2880

ctgatccaaacgaggactacctagactacgtgcatgcagagaagagccggttggcatcag2940

aagaacaaatcctaagggcagctacgtcgatctacggggctccaggacaggctgagccac3000

cccaggccttcatagacgaagtcgccaaagtctatgaaatcaaccatgggcgtggcccca3060

accaagagcagatgaaagatctgctcctgactgcgatggagatgaagcatcgcaatccca3120

ggcgggctccaccaaagcccaagccaaaacccaatgttccaacgcagagaccccctggtc3180

ggctgggccgctggatcagggccgtctctgatgaggaccttgagtgaggctcctgggagt3240

ctcccgacaccacccgcgcaggcgtggacaccaattcggccatacaacatcccaaattgg3300

atccgttcgcgggtccccgggtcggcatggcatctccacctcctcgcggtccgacctggg3360

catccgaaggaggacgcacgtccactcggatggctaagggagggcg3406

<210>4

<211>2973

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtcgg60

atacgatgggtctgaccctctgggagtcacgaattaacgtggctactaggggtgacaccc120

accgctagctgccacgttagtggctcctcttcttgatgattctgccaccatgagtgacgt180

attcaacagtccacaggcgcgaagcaaaatatcagcagcgtttggcataaagcccacagc240

tggacaggatgtggaagaactcttgatccccaaggtctgggttccacctgaggacccact300

ggcaagccccagtcgacttgccaaattcctcagagaaaacggctacaagattttgcagcc360

gcggtctctacccgagaatgaggagtatgagaccgaccagatacttccagacctagcatg420

gatgcgacagatagagggggcagttctgaagcccaccttgtctctccccattggtgacca480

agagtacttcccaaagtattacccaactcatcgcccgagcaaggagaagcccaatgcgta540

cccaccagacattgcattactcaagcagatgatctacctatttctccagcttccggaagc600

cacagagggcctgaaggatgaagtgaccctcctaactcaaaatatacgagacaaggccta660

cggaagtgggacctacatggggcaagcgaccagacttgttgccatgaaagaggttgccac720

tgggagaaatccaaacaaggatcctctaaaacttgggtacacttttgagagcatcgcgca780

gttgcttgacatcaccctaccagttggcccacctggtgaggatgacaagccctgggtgcc840

actcacaagagtgccgtcaaggatgctagtgctgacgggagacgtagatggggactttga900

ggttgaggattacctcccgaaaatcaacctcaagtcatcaagtggactaccatatgtagg960

tcgcactaagggggaaacaattggcgagatgatagccatctcaaaccaattcctccggga1020

gctatcagcgctgctgaagcaaggtgcagggaccaaagggtcaaacaagaagaagctact1080

cagcatgctcagtgactattggtacttatcatgcgggcttttgtttccgaaggctgaacg1140

gtatgacaaaagcacatggcttaccaagacccggaacatatggtcagctccatccccgac1200

tcacctcatgatctccatgatcacctggcccgtgatgtccaacagccctaacaacgtgtt1260

gaatattgaagggtgcccgtcactctacaagtttaacccgtttaggggaggactaaatag1320

gatcgttgagtggatacttgctccggaagaacccaaggcccttgtatatgcagataacat1380

atacatcgtccactctaacacgtggtactcaattgacctagaaaagggggaggccaactg1440

cacacgtcaacacatgcaggcggctatgtactacatcctcactagagggtggtcagacaa1500

tggtgaccccatgtttaaccagacatgggctacctttgccatgaacattgcccctgctct1560

agttgtggactcctcgtgtctgataatgaacctgcaaatcaagacctatggtcaaggcag1620

tgggaacgcagccacattcatcaacaaccatctcttgagcaccctggtgcttgatcagtg1680

gaacttgatgaaacaacccagcccagacagcgaggagttcaagtcaattgaggacaagct1740

aggtattaacttcaagatcgagaggtcaattgatgacatcaggggcaagctaagacagct1800

tgtcccccttgcacaaccagggtatctgagtggaggagtcgaaccagaacactccagccc1860

aactgttgagcttgacctgctaggctggtcagcaacatacagcaaagatcttgggatcta1920

tgtgcctgtacttgacaaggaacgcctattctgctcggctgcgtatcccaaaggggtcga1980

gaacaagagtctcaagtccaaagttgggatcgagcaagcatacaaggtagttaggtatga2040

ggcgttgagactggtaggtggttggaactatccactcctgaacaaagcttgcaagaacaa2100

cgcaagcgctgctcggcggcatttggaggccaaggggttcccactcgacgagttcctagc2160

cgagtggtctgagctgtcagaattcggcgaggcctttgaaggcttcaacataaagctgac2220

cgtaacaccagagatccttgccgaactgaacaagccagtacccccaaaaccccccaatgt2280

caacagaccagtcaacaccggaggtctaaaggctgtcagcaacgccctaaagaccggccg2340

ctacaggaatgaagccggactgagtggcctcgtccttctagccacagccaggagccgact2400

gcaagacgcagtaaaggccaaagcagaggccgagaaactccacaagtccaagccagacga2460

ccccgatgcagactggtttgaaagatccgaaactctgtctgaccttctggagaaagccga2520

catagccagcaaggtcgcacactcagcactcgtggaaacaagcgacgctcttgaggcggt2580

tcagtcaacctctgtgtatactcccaaatacccggaggtcaagaacccacagaccgcctc2640

caaccccgttgtcgggctccacctgcccgccaagagagccaccggtgtccaggccgctct2700

tctcggagcaggaacgagcaggccaatggggatggaggccccaacacggtccaagaacgc2760

cgtaaaaatggccaaaaggcggcaacgccaaaaggagagccgccaatagccatgatggga2820

accactcaagaagaggacactaaccccagaccccgtatccccggccttcgcctgcggggg2880

cccccgggtcggcatggcatctccacctcctcgcggtccgacctgggcatccgaaggagg2940

acgcacgtccactcggatggctaagggagggcg2973

<210>5

<211>2973

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtcgg60

atacgatgggtctgaccctctgggagtcacgaattaacgtggctactaggggtgacaccc120

accgctagctgccacgttagtggctcctcttcttgatgattctgccaccatgagtgacat180

tttcaacagtccacaggcgcgaagcacgatctcagcagcgttcggcataaagcctactgc240

tggacaagacgtggaagaactcttgatccctaaagtttgggtgccacctgaggatccgct300

tgccagccctagtcgactggcaaagttcctcagagagaacggctacaaagttttgcagcc360

gcggtctctgcccgagaatgaggagtatgagaccgaccaaatactcccagacttagcatg420

gatgcgacagatagaaggggctgttttaaaacccactctatctctccctattggagatca480

ggagtacttcccaaagtactacccaacacatcgccctagcaaggagaagcccaatgcgta540

cccgccagacatcgcactactcaagcagatgatttacctgtttctccaggttccagaggc600

caacgagggcctaaaggatgaagtaaccctcttgacccaaaacataagggacaaggccta660

tggaagtgggacctacatggggcaagcgaccagacttgttgccatgaaagaggttgccac720